CN114107132B - 一种枯草芽孢杆菌菌株hm-1及其微生物菌剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌菌株HM‑1及其微生物菌剂和应用，涉及微生物肥料技术领域。本发明所述菌株HM‑1的保藏编号为CGMCC No.21752，并制备了含有枯草芽孢杆菌菌株HM‑1的微生物菌剂，还公开了所述微生物菌剂在防治番茄灰霉病、黄瓜灰霉病、草莓灰霉病及白菜软腐病中的应用，本发明公开的枯草芽孢杆菌菌株HM‑1及含有该菌株的微生物菌剂对灰霉菌和软腐欧文氏菌有较强的拮抗作用，将制得的所述微生物菌剂施用到田间后，可有效防治番茄灰霉病、黄瓜灰霉病、草莓灰霉病及白菜软腐病；可替代化学农药，从而减少果蔬生产过程中化学农药的施用量。

Description

一种枯草芽孢杆菌菌株HM-1及其微生物菌剂和应用

技术领域

本发明属于微生物肥料技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌菌株HM-1及其微生物菌剂和应用。

背景技术

灰霉菌(Botrytis cinerea)，又称灰葡萄孢菌，是一类世界性分布的真菌，可使多种作物发生严重的灰霉病，由灰葡萄孢菌引起的灰霉病是生产上最难防治的重要病害之一，尤其对保护地番茄、黄瓜、草莓的危害更为严重。灰霉菌具有极强的腐生能力，可以在离体的组织上或土壤中旺盛生长，可以在高湿条件下终年大量繁殖，通过侵染作物的花、果、叶等，造成作物萎蔫死亡，严重影响保护地栽培作物的产量和品质。目前，化学防治是减轻灰霉病为害的主要手段，但长期、单一使用化学防治方法很容易使灰霉病菌产生抗药性，也容易造成环境污染。目前也有一些用于灰霉病防治的生防菌剂，但由于灰霉病的病原菌种群存在的多样性及病原菌不断进化等原因，生防效果并不理想。

近年来，随着大白菜栽培面积的不断扩大和连作年限的增加，大白菜软腐病有加重发展的趋势，严重影响了大白菜的生产。在北方地区个别年份该病造成大白菜减产达50％以上，个别地块甚至绝产。白菜软腐病是一种发生严重的细菌性病害，主要病原菌为胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(Erwinia carotovora subsp.carotovora)。该病原菌在前期干旱、后期多雨或灌溉不当情况下，很容易在生产中大面积流行。研究证明，软腐细菌能在土壤中越冬并从幼苗根系侵染植株，生长后期和贮藏期发生病害主要是从根系侵入而在维管束中潜伏侵染的病原菌所致。白菜软腐病病原菌属于革兰氏阴性菌，变异快，容易产生抗药性。目前，对该病的防治主要采用选育抗病品种和化学药剂防治相结合的方法，但效果并不十分理想，并且长期使用化学农药防治还容易导致环境污染及农药残留等安全问题。

生物防治是利用有益生物来抑制或消灭有害生物的一种防治策略，可以减少农药污染，保障食品安全，是目前国内外针对植物病害的有效防治措施之一，具有安全、高效、无公害和低成本等特点，且不会引起病原菌产生相应的耐药性。因此，利用有益微生物进行生物防治已成为当前植物病害防治的重点发展方向。

由于生物多样性和生物的共同进化特性，针对病原微生物的不同种类以及每种病原微生物的不断进化，需要筛选更多不同种类的有益微生物进行应对，筛选对病原菌具有抑制作用的生防微生物是防治病原菌为害的有效方法。

发明内容

有鉴于此，本发明针对现有可应用的生防微生物菌株不够丰富等技术问题，提供一种能够高效防治番茄灰霉病、黄瓜灰霉病、草莓灰霉病及白菜软腐病的生防微生物菌株，并且提供一种含有该枯草芽孢杆菌菌株的微生物菌剂，提供该微生物菌剂在防治番茄灰霉病、黄瓜灰霉病、草莓灰霉病及白菜软腐病上的应用，以解决保护地番茄、黄瓜、草莓栽培中灰霉病防治效果不佳的技术问题，解决大白菜软腐病防治效果不佳的技术问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株HM-1，所述菌株HM-1已进行保藏，保藏编号为：CGMCC No.21752。

本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂的活性成分包括上述菌株HM-1的菌体、芽孢和/或胞外代谢产物。

本发明的另一个目的是提供上述微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：将上述菌株HM-1的种子液接种于发酵培养基中进行有氧发酵，发酵液为液态菌剂；

所述发酵培养基中包括以下成分：花生饼粉15g/L，玉米淀粉20g/L，葡萄糖10g/L，CaCO₃ 2g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，泡敌0.1g/L，pH 7.0～7.5。

优选的，所述种子液的制备方法包括将经过活化的所述菌株HM-1，接种于LB液体培养基中，在30℃、150-220r/min下培养20-24h，得到种子液。

优选的，所述接种的接种量为发酵液体积的2-10％

优选的，所述有氧发酵时，通气比为1：1、搅拌转速为100-150r/min、罐压0.12MPa、培养温度30℃、培养时间为48-72h。

优选的，所述液态菌剂中活菌含量为1.0×10¹⁰cfu/mL，其中芽孢含量不低于95％。

优选的，在得到所述液态菌剂后，还包括将所述液态菌剂与300-500目的硅藻土熟料粉按照5：1的重量比混合，经搅拌后进行干燥，得HM-1固态菌剂；

所述HM-1固体菌剂中活菌含量不低于4.8×10¹⁰cfu/g。

本发明的一个目的是提供上述菌株HM-1或上述微生物菌剂在在防治番茄灰霉病、黄瓜灰霉病、草莓灰霉病、白菜软腐病中任一种病害中的应用。

本发明的最后一个目的是提供一种防治灰霉病的方法，包括以下步骤：向植物上喷施上述微生物菌剂。

有益效果：本发明的枯草芽孢杆菌菌株HM-1及其微生物菌剂能高效防治灰霉菌感染所致的番茄灰霉病、黄瓜灰霉病、草莓灰霉病，防治效果均达到80％以上，对白菜软腐病的防效达到80％以上。作为高效的生物防治手段，无污染，无毒害，无残留，对环境友好，可以替代化学防治方法，减少果蔬栽培过程中化学农药的使用，减少化学农药引起的残留和污染，提高作物产品质量。

生物保藏信息

枯草芽孢杆菌菌株HM-1，分类命名为Bacillus subtilis，已于2021年01月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCC No.21752。

附图说明

图1枯草芽孢杆菌菌株HM-1在固体LB培养基上培养24h的菌落形态；

图2枯草芽孢杆菌菌株HM-1革兰氏染色后的光学显微镜下的形态；

图3本发明实施例2中菌株HM-1的16S rDNA凝胶电泳图；

图4菌株HM-1 16S rDNA的测序结果；

图5菌株HM-1基于16S rDNA构建的系统发育树；

图6实施例1中菌株HM-1与灰霉菌(Botrytis cinerea)在PDA平板的对峙试验结果；

图7实施例2中菌株HM-1与胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(Erwiniacarotovora subsp.carotovora)在LB平板的对峙试验结果。

具体实施方式

实施例1

对草莓、黄瓜、番茄灰霉病病原菌具有拮抗作用的细菌进行分离、筛选。

从灰霉病害发生严重地块，采集健康植株的根际土壤作为试验样品。在实验室内，从该样品中进行细菌分离，在PB培养基上进行多次分离纯化，得到纯培养菌落后，以灰霉菌(Botrytis cinerea)为指示菌，采用对峙试验方法，在PDA培养基上进行拮抗性能高的菌株的筛选。具体步骤：从河北省昌黎县、抚宁区的番茄、黄瓜、草莓种植田中的霉病害发生严重地块，采集健康植株根际土壤作为试验样品，将该土壤样品经梯度稀释后涂布于PB培养基中，于28℃恒温培养箱培养。

PB培养基配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，自来水1000mL，pH7.2～7.4，121℃灭菌20min后使用。

待平板长出菌落后，挑取不同形态的单菌落采用划线分离法反复进行分离纯化，直到得到单菌落的纯培养物，纯化后的菌株保存于PB培养基斜面。以灰霉菌(Botrytiscinerea)为指示菌，将筛选出的细菌菌株点接在距平板中央3cm处的4个角上，平板中央同时接种直径5mm的活化的灰霉病菌块，每个菌株重复三次，28℃恒温培养5d，测量、记录抑菌圈直径的大小并计算平均抑制率，筛选出了对灰霉菌拮抗作用最强的菌株HM-1，见图6。

采用抑菌圈法测定枯草芽孢杆菌菌HM-1对白菜软腐病菌即胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜致病亚种(Erwinia carotovora subsp.carotovora)生长的抑制率，结果表明：HM-1可有效抑制胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(Erwinia carotovorasubsp.carotovora)的生长，抑菌圈直径均在19mm以上(见图7)。

实施例2

枯草芽孢杆菌菌株HM-1的鉴定

1)形态特征鉴定。根据《常见细菌系统鉴定手册》中记载的实验内容和实验方法，对筛得的菌株HM-1进行鉴定，菌落形态观测是在PB培养基上进行的，将菌株划线接种后，于28℃恒温培养24h观察菌落形态。菌落近圆形，边缘不整齐，颜色为乳白色，无光泽，较干燥，不透明，菌落表面粗糙，不光滑，菌落正反面都为乳白色。挑取24h菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜的100倍油镜下观察。在显微镜下可以看到，菌株HM-1为芽孢杆菌，革兰氏阳性菌，着色均匀，芽孢位置中生或近中生，芽孢膨大，无伴孢晶体，单个出现。在电镜下观察该菌株为长杆状，初步判断菌株HM-1属于芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。见图1及图2。

2)生理生化特征鉴定

表1菌株HM-1的生理生化特征

注：+表示阳性反应；-表示阴性反应。Note：+positive；-negative。

参考《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版中文)》(R.E.布坎南等科学出版社，1984年)所述方法对菌株HM-1进行生理生化检测。生理生化测定结果(见表1)表明，菌株HM-1是好氧性革兰氏阳性菌，能使淀粉水解(产生淀粉酶)，能使明胶液化，接触酶反应呈阳性等；碳源利用实验表明，菌株HM-1可以利用蔗糖、葡萄糖、果糖等，但不能利用甘露醇、淀粉、木糖醇。菌株HM-1的生理生化特征与文献所述枯草芽孢杆菌生理生化特征基本一致。

3)16S rDNA鉴定：将菌株HM-1接种到PB培养液，28℃摇床培养12h，采用天根生化科技(北京)有限公司基因组DNA提取试剂盒提取该菌株的基因组DNA，然后以提取的总DNA作为模板，以上游引物：F₂₇(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和下游引物R₁₄₉₂(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)引物对进行PCR扩增。

PCR反应体系为25μL，反应体系为：基因组DNA 1μL，10×PCR buffer 2.5μL，F₂₇引物0.5μL，R₁₄₉₂引物0.5μL，dNTPs 1μL，Taq酶(5U/μL)0.25μL，ddH₂O 19.25μL。

反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸2min，循环31次；72℃10min。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，将大小约为1500bp的PCR产物送上海生工生物技术有限公司测序后，将获得的DNA序列(见图4)与NCBI的数据库中进行BLAST分析，显示菌株HM-1与Bacillus subtilis DK15(MT534533)相似性最高，相似度达到99.93％。用MEGA6.0中构建系统发育树，结果见图5，16S rDNA凝胶电泳图，见图3。

综合上述形态特征鉴定、生理生化特征鉴定及16S rDNA鉴定，判断该菌株HM-1鉴定为枯草芽孢杆菌。

实施例3

含有枯草芽孢杆菌菌株HM-1的微生物液体菌剂的制备

枯草芽孢杆菌菌株HM-1的活化：从-20℃冰箱中保存的枯草芽孢杆菌HM-1的甘油菌中，取菌液划线至LB培养基上30℃培养24h。24h后mLmL枯草芽孢杆菌菌株HM-1在LB固体培养基上生长良好，菌落近圆形，边缘不整齐，颜色为乳白色，无光泽，较干燥，不透明，菌落表面粗糙，不光滑。

种子液的制备：500mL种子摇瓶中LB液态培养基的装液量为150mL。挑取LB固体培养基上的单菌落接种于种子摇瓶中，将种子摇瓶在30℃、220r/min下培养24h，得到种子液。

发酵培养基配方(g/L)为：花生饼粉15g/L，玉米淀粉20g/L，葡萄糖10g/L，CaCO₃2g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，泡敌0.1g/L，pH 7.0-7.5。

将发酵培养基置于发酵罐中，灭菌。

将枯草芽孢杆菌菌株HM-1的种子液，接入发酵罐中，培养条件为：通气比为1：1、搅拌转速为100-150r/min、罐压0.12MPa、培养温度30℃、培养时间为72h，得到活菌含量为1.0×10¹⁰cfu/mL的发酵液、其中芽孢含量为95％。该发酵液加入0.5％山梨醇作为紫外保护剂，搅拌均匀后，可以直接作为液态菌剂使用。

实施例4

含有枯草芽孢杆菌菌株HM-1的微生物固体菌剂的制备

在实施例3得到上述枯草芽孢杆菌菌株HM-1液态菌剂的情况下，制备枯草芽孢杆菌菌株HM-1的固体菌剂。

向实施例3制得的液态菌剂(活菌含量为1.0×10¹⁰cfu/mL且其中芽孢率为95％)中加入300目的硅藻土熟料粉，加入发酵液重量的0.5％山梨醇作为紫外防护剂，液态菌剂与硅藻土熟料粉的重量比为5：1。将该液固混合物搅拌30min后，利用输料泵将该混合物输入喷雾塔中干燥后，得到含水量为5.6％(W/W)，活菌含量为4.8×10¹⁰cfu/g的枯草芽孢杆菌菌株HM-1固态菌剂。其中喷雾塔中的干燥条件为：进风口温度为180℃，出风口温度为70℃。

在固体菌剂中，添加其质量5％(W/W)的十二烷基苯磺酸钠(SDS)和适量300目的硅藻土熟料粉，混合均匀后粉碎即可得到含量为2.0×10¹⁰cfu/g的固态菌剂。

实施例5

含有枯草芽孢杆菌菌株HM-1的两种菌剂在防治番茄灰霉病中的应用。

在河北省昌黎县新集镇的连作5年的番茄地块以及靖安镇的连作4年的番茄地块，分别应用两种菌剂开展防治番茄灰霉病的田间试验。两个地块的试验均设3个处理：即HM-1菌剂防治处理、常规对照、空白对照。HM-1粉剂防治处理是：将实施例4制得的HM-1粉剂(活菌含量为2.0×10¹⁰cfu/g)和水以1：1000的重量比悬溶后，分别在番茄苗期、花期和结果期进行喷施，每次使用剂量为每亩60g菌剂；常规对照：采用50％速克灵可湿性粉剂1000倍溶液；空白对照：不施用任何防治药物，但喷施与前述HM-1粉剂防治相同重量的水；常规对照、空白对照喷施时间也是番茄苗期、花期和结果期。每个处理3次重复，处理小区的面积50m²，试验总占地450m²。调查番茄灰霉病的发病情况。

调查方法：在第3穗果采获后采用对角线五点取样法，每个点调查20株，调查株发病率与病情指数，记录总调查株数、总发病株数。

番茄灰霉病病情指数分级标准：

0级：全株无害病斑；

1级：少数叶片发病至全株下部1/4以下的叶片有病斑；

2级：全株中下部1/2以下的叶片有病斑或者茎秆分枝上有病斑；

3级：全株3/4以下部位的叶片有病斑或者单个分支茎秆枯死和单株有1～2个果实发病腐烂；

4级：全株3/4以上的叶片发病枯黄或者茎秆枯死，单株有2个以上的果实发病腐烂。

防效计算方法：

番茄株发病率＝总发病株数/总调查株数×100

病情指数＝∑(发病株数×该发病株级值)/(总调查株数×最高级值)×100

防治效果(％)＝(对照区病情指数—处理区病情指数)/对照区病情指数×100

防治效果如表2所示，含有菌株HM-1的粉剂型菌剂对番茄灰霉病具有良好的防效，在施用含有菌株HM-1的粉剂的情况下，番茄灰霉病发病率和病情指数均降低，防病效果均在80％以上。

表2不同菌剂施用对番茄灰霉病的防治效果

实施例6

含有枯草芽孢杆菌菌株HM-1的粉剂在防治黄瓜灰霉病中的应用。

在河北省昌黎县新集镇的连作5年的黄瓜地块以及靖安镇的连作5年的黄瓜地块，分别应用含有枯草芽孢杆菌菌株HM-1的粉剂开展防治黄瓜灰霉病的田间试验。两个地块的试验均设3个处理：即HM-1粉剂、常规对照、空白对照。微生物菌剂防治处理是：将实施例4制得的HM-1的粉剂(活菌含量为2.0×10¹⁰cfu/g)和水以1：1000的重量比悬溶后，分别在黄瓜苗期、花期和结果期进行喷施，每次使用剂量为每亩60g菌剂；常规对照：采用50％速克灵可湿性粉剂1000倍溶液；空白对照：不施用任何防治药物，但喷施与前述HM-1的粉剂防治相同重量的水；常规对照、空白对照喷施时间也是黄瓜苗期、花期和结果期。每个处理3次重复，处理小区的面积50m²，试验总占地450m²。调查黄瓜灰霉病的发病情况。

调查方法：在第3批黄瓜采摘后采用对角线五点取样法，每个点调查20株，调查株发病率与病情指数，记录总调查株数、总发病株数。

黄瓜灰霉病病情指数分级标准：

0级：全株无害病斑；

1级：少数叶片发病至全株下部1/4以下的叶片有病斑；

2级：全株中下部1/2以下的叶片有病斑或者茎秆分枝上有病斑；

3级：全株3/4以下部位的叶片有病斑或者单个分支茎秆枯死和单株有1～2个果实发病腐烂；

4级：全株3/4以上的叶片发病枯黄或者茎秆枯死，单株有2个以上的果实发病腐烂。

防效计算方法：

黄瓜株发病率＝总发病株数/总调查株数×100

病情指数＝∑(发病株数×该发病株级值)/(总调查株数×最高级值)×100

防治效果(％)＝(对照区病情指数—处理区病情指数)/对照区病情指数×100

防治效果如表3所示，含有菌株HM-1的粉剂对黄瓜灰霉病具有良好的防效，在施用含有菌株HM-1的粉剂的情况下，黄瓜灰霉病发病率和病情指数均降低，防病效果均在80％以上。

表3不同菌剂施用对黄瓜灰霉病的防治效果

实施例7

含有枯草芽孢杆菌HM-1的微生物液体菌剂在草莓种植的田间应用。

在河北省昌黎县城郊区连作5年的草莓大棚及新集镇连作3年的草莓大棚，进行枯草芽孢杆菌HM-1的微生物菌剂防治草莓灰霉病的田间试验。应用实施例3中制得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HM-1液体菌剂，其活菌含量为1.0×10¹⁰cfu/mL、芽孢含量为95％，每次使用剂量为每亩300mL芽孢菌剂；将该微生物菌剂按1：200的体积比例用水稀释，将稀释后的液体菌剂在草莓现蕾期和初果期喷施；常规对照：以50％速克灵可湿性粉剂1000倍溶液作为防治药物；空白对照：不施用防治药物但喷施与常规对照相同重量的水。每个处理3次重复，处理小区的面积30m²，试验总占地270m²。调查草莓灰霉病的发病情况和产量。

调查方法：在采收期采用对角线五点取样法，每个点调查20株，调查株发病率与病情指数，记录总调查株数、总发病株数。

草莓灰霉病病情指数分级标准：

0级：无病症；

1级：病斑面积占整个果面的5％以下；

3级：病斑面积占整个果面的6％～10％以下；

5级：病斑面积占整个果面的11％～25％以下；

7级：病斑面积占整个果面的26％～50％以下；

9级：病斑面积占整个果面的50％以上。

防效计算方法：

草莓株发病率＝总发病株数/总调查株数×100

病情指数＝∑(发病株数×该发病株级值)/(总调查株数×最高级值)×100

防治效果(％)＝(对照区病情指数—处理区病情指数)/对照区病情指数×100

防治效果如表4所示，使用该枯草芽孢杆菌HM-1的微生物菌剂可降低草莓灰霉病发病率、降低病情指数，7天防病效果即可达80％以上，能够有效防治草莓灰霉病。

表4不同菌剂施用对草莓灰霉病的防治效果

实施例8

含有枯草芽孢杆菌菌株HM-1的微生物菌剂在防治白菜软腐病中的应用。

本试验设5个处理，分别是：以实施例3中制得枯草芽孢杆菌HM-1液体菌剂配制成1.0×10⁵、1.0×10⁶、1.0×10⁷cfu/mL 3个系列浓度的3个处理，两个对照处理：常规对照：72％农用链霉素可湿性粉剂3000倍液；空白对照：清水。每个处理15m²，3次重复，随机区组排列。试验在位于昌黎县新集镇的白菜种植基地进行。采用白菜苗期灌根法和莲座期喷施的办法，最后1次喷药10d后调查防治效果，每个处理随机调查30株白菜，以株为单位进行病情分级，并计算发病率和病情指数。

病情分级标准：

0级-无病；

1级-植株下部1-2片叶有少量病斑；

2级-植株下部3片或3片以上的叶有病斑，其他感染部位稍重；

3级-叶片全部被感染，其他感染部位较重；

4级-叶片全部感染，植株整体倾斜，叶片下垂不能恢复正常，但仍存活；5级-全株死亡倒地。

发病率＝总发病株数/总调查株数×100

病情指数＝∑(发病株数×该发病株级值)/(总调查株数×最高级值)×100

防治效果(％)＝(对照区病情指数—处理区病情指数)/对照区病情指数×100。

防治效果如表5所示，枯草芽孢杆菌菌株HM-1在土壤中能较好地定殖，灌根可减少土壤中残存病菌和地上部健壮植株的发病率。试验结果显示菌剂浓度为1.0×10⁷cfu/mL时对白菜软腐病的防治效果最佳，其防治效果达到了80.76％。

表5不同处理对白菜软腐病的防治效果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株HM-1或其微生物菌剂在防治番茄灰霉病、黄瓜灰霉病草莓灰霉病和白菜软腐病中的应用；

所述菌株HM-1已进行保藏，保藏编号为：CGMCC No.21752；

所述微生物菌剂的活性成分包括所述菌株HM-1的菌体或芽孢。