CN114946883B - 一种能够增强植物抗病性的葫芦素及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请首次发现葫芦素能通过提高肠杆菌和芽孢杆菌的丰度，间接抑制镰刀菌生长，进而形成了一套对土传病原菌‑镰刀菌的有效的防御方法。本申请的方法有效提高了植物的抗病性，并为培育优质高产、适应性强的作物提供了依据。

Description

一种能够增强植物抗病性的葫芦素及其应用

技术领域

本申请涉及一种能够增强植物抗病性的葫芦素及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

枯萎病也称疫病，是由真菌或细菌引致的植物病害，发病突然，症状包括严重的点斑、凋萎或叶、花、果、茎或整株植物的死亡。其中，镰刀菌经常侵染寄主植物的维管束系统，破坏植物的输导组织，并在植物生长发育代谢过程中产生毒素来危害作物，造成植物萎蔫死亡，影响产量和品质。最常见的尖孢镰刀菌(F.oxysporum)是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病的发生。目前，防治镰刀菌枯萎病的方法包括轮作，植株修剪及疏植以利通风，采用无病种子或砧木以及抗病品种，施用杀菌剂等，但这些方法不仅费时费力，而且可能污染环境，给人类健康带来潜在的威胁。

根际微生物作为植物的第二基因组，对于植物根系生长、矿质营养摄取和疾病抗性具有重要的作用。良好的根际微生物环境促进宿主植物抵御非生物胁迫导致的生长压力，也能更好地培育健康土壤，改善土壤结构，提高生产效率。植物根系分泌的结构丰富多样的次生代谢物如黄酮类、生物碱类、萜类化合物(如葫芦素)等对于重塑根系微生物群落具有非常重要的功能。随着代谢组学和宏基因组学的不断发展，植物根际分泌物如何塑造根际微生物群落，被更多的研究人员所揭示，例如黄酮类物质香豆素成为塑造根际微生物组潜在的调节剂，在对病原菌的防御，促进营养吸收和根系群落互作等方面起重要作用。吲哚类生物碱苯并恶唑啉酮被发现在调控根际微生物组方面也发挥重要的功能，通过影响微生物群落的特定群体，进而改变整体微生物的组成与结构等。因此，研究人员希望能通过根际分泌物来调节或重塑根际微生物群落，从而有效且环保地防治枯萎病。

发明内容

为了解决上述技术问题，本申请提供一种通过重塑植物根际微生物群落来抑制镰刀菌枯萎病的方法，包括在植物根际处增加肠杆菌的数量(例如加入含肠杆菌的制剂)和/或使用促进肠杆菌生长的调节剂的步骤。

可选的，进一步包括加入芽孢杆菌(例如加入含肠杆菌的制剂)和/或芽孢杆菌生长的促进剂的步骤。

在一些实施方式中，促进肠杆菌生长的调节剂或制剂为葫芦素。

在一些实施方式中，为了保证葫芦素对肠杆菌的促进作用能高效地促使芽孢杆菌生长，上述两步骤可间隔数天或数周。

在一些实施方式中，数天指1-3天、3-5天、5-10天等合适间隔；数周指1-2周、2-4周、4-6周等合适的间隔。

本申请还提供一种促进肠杆菌生长的方法，使肠杆菌与含葫芦素的制剂接触。

本申请还提供一种用于抑制镰刀菌的制剂，所述制剂中至少同时包含肠杆菌和葫芦素。

在一些实施方式中，所述制剂中进一步包含芽孢杆菌。这些芽孢杆菌可与葫芦素或肠杆菌单独包装。

在一些实施方式中，葫芦素为葫芦素B或其衍生物。

在一些实施方式中，植物为瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等，例如葫芦科植物，具体的例如甜瓜、黄瓜、南瓜、丝瓜、西瓜等。

在一些实施方式中，镰刀菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，茄病镰刀菌(Fusarium solani)，层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)等。

在一些实施方式中，芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，人参土芽孢杆菌(Bacillus ginsengihumi)等。

在一些实施方式中，肠杆菌为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae),桑树肠杆菌(Enterobacter mori)，阿斯伯里肠杆菌Enterobacter asburiae)等。

本申请的优点在于，通过施用根际分泌物来调节或重塑根际微生物群落，利用微生物之间彼此消长的内在联系，有效且环保地防治植物枯萎病。本申请的方法和制剂简单经济，省时省力，不会污染环境，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1、Cm70和Cm104在富含尖孢镰刀菌的连作土壤中(a)以及其灭菌土壤中(b)的生长状态。

图2、芽孢杆菌和肠杆菌菌株对尖孢镰刀菌的拮抗活性。

图3、葫芦素B对尖孢镰刀菌的拮抗作用分析。

图4、肠杆菌属菌株促进芽孢杆菌生长。

图5、葫芦素B促进肠杆菌属菌株生长。

图6、葫芦素B处理对Cm70材料的生长表型的影响。

图7、植物病情指数分析葫芦素B与抗病性的关系。

图8、根际土壤中葫芦素B的含量测定。

图9、芽孢杆菌属，肠杆菌属及镰刀菌属丰度排名前十的菌种；其中，星号标记的是健康组中富集，疾病组中减少的物种；括号中标注的为本实施例用于中测试的芽孢杆菌菌株和肠杆菌菌株；每个样本三次生物学重复。

图10、肠杆菌属菌株培养液中葫芦素B含量分析。

图11、添加葫芦素B的E-159菌株的培养上清液的HPLC-QTOF-MS分析。其中，a，E-159菌株培养液提取物的代谢总离子图；b，比较葫芦素B标品与衍生物的质谱图。

具体实施方式

为了具体阐述本申请具有普适性的设计思路，下面以具体的葫芦素、植物、微生物或实验参数为例进行展示，但不应当反而成为限制本申请保护范围的理由。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、抗枯萎病与非抗枯萎病实验材料的选择与验证

从甜瓜核心种质资源中筛选到两份亲缘关系较近的甜瓜材料，一份为不抗枯萎病的Cm70材料，一份为抗枯萎病的Cm104材料。将这两份材料种植在湖南长沙采集到的常年连作土壤中，该土壤富含土传病原真菌-尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，这种病原真菌可引起植物枯萎病发生。结果显示，Cm70材料几乎全部表现出枯萎表型，直至死亡，而Cm104材料却生长正常；当Cm70材料种植在高温高压灭菌处理后的土壤中时，却能正常生长(图1)。

实施例2、芽孢杆菌而非肠杆菌能抑制尖孢镰刀菌

采用芽孢杆菌与尖孢镰刀菌、肠杆菌与尖孢镰刀菌进行对峙实验，结果显示，芽孢杆菌对尖孢镰刀菌具有明显抑制作用，而肠杆菌菌株对尖孢镰刀菌都没有抑制作用(图2)。

具体实施方法：将直径为0.5cm的尖孢镰刀菌菌块放置PDA培养板的中部，在30℃培养箱中培养5天左右。将芽孢杆菌或肠杆菌的种子菌液均匀的点成一个圆形菌斑，菌斑围绕真菌生长，距离培养皿边缘1cm左右。5天左右时间可以观察对峙结果并拍照记录。

实施例3、葫芦素不能抑制尖孢镰刀菌

采用不同浓度的葫芦素B处理尖孢镰刀菌，并以溶剂甲醇作为对照组进行测试，结果表明，葫芦素B对尖孢镰刀菌没有抑制作用(图3)。

具体实施方法：扩繁的尖孢镰刀菌(F.oxysporum)在PDA培养板上生长至一定面积后，将牛津杯放置于培养皿距离皿边缘直线距离1cm位置，使其自然立在琼脂板上；之后，吸取100μL不同浓度的葫芦素B溶液添加到牛津杯里，静置5到10分钟，确保溶液扩散到琼脂内部；培养板放置于室温培养，5天后观察拮抗效果。

实施例4、肠杆菌能促进芽孢杆菌的生长

采用不同的已知肠杆菌的发酵液培养不同的已知芽孢杆菌，其中肠杆菌使用了E-159,E-99,E-126,E-128,芽孢杆菌使用了B-3610和B-A，实验遵循本领域的常规方法。结果发现：各肠杆菌发酵液均可以促进芽孢杆菌生长(图4)，即肠杆菌属细菌能够促进芽孢杆菌属细菌的生长。

具体实施方法：首先，对不同的肠杆菌菌株进行培养，在30℃恒温摇床中孵育72小时，转速为180rpm。收集菌液，使用0.22μm的无菌滤器过滤菌体的上清发酵液。芽孢杆菌的生长曲线使用锥形瓶进行测定，经过前期优化，20％的肠杆菌发酵液用于测定芽孢杆菌的生长曲线。每一个锥形瓶中添加24mL 1/2TSB培养液和同样初始菌量的芽孢杆菌，最后添加6mL肠杆菌发酵液或者等体积1/2TSB(对照组)。最后这些锥形瓶置于30℃恒温摇床中孵育，转速为200rpm。芽孢杆菌菌液浓度使用96孔酶标仪(SpectraMax)进行测定，吸光度设定为600nm，测定时间为2，4，6，8，10，12，14和16小时。

实施例5、葫芦素能促进肠杆菌的生长

分别利用浓度为50ppm和150ppm的葫芦素B(CuB)处理肠杆菌属的不同细菌，并观察葫芦素B对它们生长的影响。实验结果显示，葫芦素B能够促进肠杆菌的生长(图5)。同时我们还发现，与对照相比，含有肠杆菌的培养基中葫芦素B的含量显著降低(图10)，我们推测葫芦素B可能被肠杆菌属微生物作为碳源加以利用。为了验证这一想法，我们利用三重四级杆飞行质谱(HPLC-QTOF-MS)对E-159菌的培养上清进行代谢组分析，发现上清液中可以鉴定到两种葫芦素B衍生物(图11)。因此，通过葫芦素促进肠杆菌生长，而肠杆菌促进芽孢杆菌生长，最终利用芽孢杆菌抑制尖孢镰刀菌是一套可行的方案。

具体实施方法：从划线的1/2TSB固体培养板(TSB 15g/L，Agar 20g/L)上挑取单克隆置于1/2TSB液体培养基上过夜孵育，OD600到1.0-2.0。菌液使用1/2TSB培养液稀释100到500倍(根据不同菌的生长速率调整)，作为测定生长曲线的初始菌浓度。葫芦素B使用甲醇溶解，配置不同浓度梯度母液(0,2.5mg/mL,7.5mg/mL)。肠杆菌菌株的生长曲线测定使用96孔板(Corning,EIA/RIA,Flat bottom)。每个孔中加入98μL 1/2TSB培养液稀释过的初始菌量，同时每个孔中加入2μL不同浓度葫芦素B母液，使其终浓度为0ppm，50ppm，150ppm。0ppm是对照组，加入的是等体积甲醇。培养板在30℃摇床中，使用200rpm转速培养。以上菌液600nm处吸光度使用96孔酶标仪(SpectraMax)进行测定，测定时间为2，4，6，8，10，12，14和16小时。

实施例6、葫芦素通过肠杆菌和芽孢杆菌间接抑制植物的枯萎病

上述Cm70材料被种植在富含土传病原真菌-尖孢镰刀菌的常年连作土壤中，随后直接用不同浓度的葫芦素B对材料进行处理，观察其抗病性。具体操作如下：首先，对Cm70甜瓜种子进行表面消毒，75％的酒精30秒，0.6％的次氯酸钠处理15分钟，使用无菌水清洗。随后种子播种于高温高压灭菌的蛭石基质中，期间使用无菌水进行补水。播种5-7天，甜瓜子叶完全展开。选取长势一致的甜瓜幼苗分别移栽到富含土传病原真菌-尖孢镰刀菌的常年连作土壤中。甜瓜幼苗放置于人工气候室中(光照强度300μmol/m²/s，光周期为16小时光照/8小时黑暗，温度25℃)生长。缓苗2-3天后，使用葫芦素B对Cm70材料进行处理。5mL不同浓度的葫芦素B(0,50ppm,150ppm)溶液滴定到幼苗根部，每隔一天滴定一次，每天记录每株的发病情况。对照组是不含葫芦素B的溶剂。枯萎病病情指数根据发病程度划分成0到4等级：Rank 0，无病症；Rank 1，子叶黄化但不萎蔫；Rank 2，子叶或真叶黄化出现萎蔫但茎不萎蔫；Rank 3，子叶和真叶黄化且萎蔫，但茎不萎蔫；Rank 4，植株茎萎蔫或全株死亡。结果表明，与对照相比，150ppm葫芦素B处理(根际土壤葫芦素B积累量为2.6nmol/g soil DW，图4)植株病害发生进程及严重程度出现明显缓和趋势(图6)，其整体的平均病情指数出现明显下降(图7)。

发明人还对Cm104和Cm70根际土壤中葫芦素B含量进行测定，发现Cm104材料根际土壤中积累了大量葫芦素B(69nmol/g soil DW)，而Cm70材料根际土壤中无葫芦素B(图8)。因此，Cm104材料能免受病原菌侵染的一个主要原因是自身的根际分泌了大量葫芦素B的缘故。

接下来，我们分别对健康的Cm70(H-Cm70)，Cm104以及带枯萎病的Cm70(D-Cm70)材料进行取样，取样包括根组织和根际土样，开展了宏基因组鸟枪法测序。结果发现芽孢杆菌属和肠杆菌属在健康的Cm70(H-Cm70)，Cm104中显著富集，而主要的镰刀菌属在带枯萎病的Cm70(D-Cm70)中占据主要丰度(图9)，这与实施例5得出的结论一致。

综上，以上对本申请具体实施方式的描述详细地公开了本申请的技术细节，并举例说明了本申请的技术思路，旨在满足专利法的授权规定，但不应反而被认为是对本申请保护范围的限制。该领域的科研人员可以根据本申请，结合彼时的生物工程和生物信息工程的知识与技术作出各种改变或变形，只要未脱离本申请的核心思路与精神，均应属于本申请所附的权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种通过重塑植物根际微生物群落来抑制镰刀菌枯萎病的方法，其特征在于，包括在植物根际处加入肠杆菌和/或使用促进肠杆菌生长的调节剂的方式；所述促进肠杆菌生长的调节剂含有葫芦素B；所述肠杆菌含有阴沟肠杆菌或桑树肠杆菌。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括加入芽孢杆菌和/或芽孢杆菌生长的促进剂的步骤，所述芽孢杆菌含有枯草芽孢杆菌；所述芽孢杆菌生长的促进剂含有阴沟肠杆菌、桑树肠杆菌或阿斯伯里肠杆菌。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述使用促进肠杆菌生长的调节剂的方式与所述加入芽孢杆菌和/或芽孢杆菌生长的促进剂的步骤间隔数天或数周。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述数天为1-3天、3-5天、或5-10天。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述数周为1-2周、2-4周、或4-6周。

6.一种促进植物根际肠杆菌生长的方法，其特征在于，使肠杆菌与含葫芦素B的制剂接触；所述肠杆菌含有阴沟肠杆菌或桑树肠杆菌。

7.一种用于抑制镰刀菌的制剂，其特征在于，所述制剂中至少同时包含肠杆菌和葫芦素B；所述肠杆菌含有阴沟肠杆菌或桑树肠杆菌。

8.如权利要求7所述的制剂，其特征在于，还进一步包括芽孢杆菌，所述芽孢杆菌含有枯草芽孢杆菌。

9.如权利要求8所述的制剂，其特征在于，所述芽孢杆菌与葫芦素或肠杆菌单独包装。

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