CN112470598B - 一种促进紫花苜蓿快速结瘤的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物繁育技术领域，特别是一种促进紫花苜蓿快速结瘤的方法。包括如下步骤：供试菌株及紫花苜蓿品种选择、供试培养基、成团泛菌脂多糖（LPSp）的提取、成团泛菌脂多糖的活性检测、组培发芽试验。其中发芽试验种子分为消毒和未消毒两个处理，未消毒组不作任何处理，处理组每玻璃组培发芽瓶加入1 ml、2 ml和3 ml LPSp，脂多糖浓度分别为0.267、0.534、0.801 EU/mL，并记为A、B、C处理；无菌水处理作为对照组。本发明0.267 EU/mL LPSp促进了未消毒组紫花苜蓿根的结瘤0.267 EU/mL LPSp加速未消毒组紫花苜蓿根的结瘤，比对照组约提前18 d；0.267 EU/mL LPSp不会影响种子的萌发，包括发芽势和发芽指数；随着LPSp浓度的升高，紫花苜蓿种子的萌发和生长受到抑制，0.801 EU/mL LPSp完全抑制了消毒组种子的萌发和生长。
Description
技术领域
本发明涉及生物繁育技术领域，特别是一种促进紫花苜蓿快速结瘤的方法。
背景技术
紫花苜蓿（Medicago sativa L.）为豆科苜蓿属多年生牧草，其茎叶中含有丰富的蛋白质、矿物质和维生素，因其营养丰富、适应性强、产草量高等优点，有“牧草之王”的美誉（Dong, 2011）。它不仅可以作为饲料作物，而且对改土肥田、保持水土、改善生态环境也具有较大贡献。此外，紫花苜蓿是中国乃至世界上种植面积最大，种植范围最广的豆科牧草，也是西部地区草地建设和荒漠化改造中首选的牧草（曹宏等, 2011）。然而因其多种植在没有灌溉条件的瘠薄地和盐碱地，造成紫花苜蓿单位面积产量低、干草品质差、粗蛋白含量较低和总量供应不足等问题，严重制约了苜蓿的产业化发展（云锦风和孙启忠, 2003）。因此，加快培育高产抗逆紫花苜蓿是提高苜蓿产业化生产程度的有效手段。
紫花苜蓿与根瘤菌共生固氮是其产量高的基本条件（马其东等, 1999），但是根瘤固氮存在菌体与植物特异性识别（刘慧琴, 1994），此外还受多种因素的影响（如土壤条件、选育的根瘤菌定居能力差、不具结瘤竞争优势），因此在使用前要进行筛选，才能保证根瘤菌有效的起到固氮作用。脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）是一种重要的微生物相关分子模式，可引发植物和动物的免疫反应（Boller and Felix, 2009），在豆科植物根瘤菌共生体系的共生固氮和非生物胁迫等方面发挥着重要的功能。
脂多糖是由法国科学家Pfeiffer在霍乱弧菌的研究中首次发现并提出，因只有当细菌死亡溶解或用人工的方法破坏细菌后才能被释放出来，又称内毒素（Akira, 2006）。脂多糖在结构及功能上具有三个“两性”特征，即属于两性（亲水性、疏水性）分子、携带两极（正、负）电荷、及发挥两相（有益、毒害）作用。早期有关脂多糖的研究主要集中在动物中，之后的研究发现脂多糖在植物生长发育调控以及免疫反应过程中也起到重要作用。最近的研究表明，从铜绿假单胞菌（Pseudomnas aeruginosa）中纯化的10至50 mg/mL商用脂多糖可引发植物先天免疫反应（孙等人, 2012; Ranf et al., 2015）。除此之外，脂多糖可以触发拟南芥活性氧（Reactive oxygen species, ROS）的双相产生（Shang-Guan et al.,2018）。
冷静报道成团泛菌脂多糖（LPSp）是低毒性、安全良好、纯度活性高的免疫增强剂（冷静, 2007）。本试验目的是明确成团泛菌CQ10脂多糖对紫花苜蓿的免疫反应。以紫花苜蓿“巨能551”种子为供试种子材料，选择不同浓度脂多糖与紫花苜蓿互作，进行接种试验，最后确定脂多糖与紫花苜蓿种子处理的优良组合。该试验可以为苜蓿产业化提供一种新的免疫调节剂，不仅可以提高苜蓿产量和质量，而且能增大固定空气中的氮含量从而减轻温室效应；同时，为实际生产中更好地推广应用脂多糖及当前畜牧业的可持续发展提供一种新的思路。
发明内容
发明解决起技术问题所采用的技术方案为：
一种促进紫花苜蓿快速结瘤的方法，包括如下步骤：
A、供试菌株及紫花苜蓿品种选择
供试菌株分离于紫花苜蓿种子，经鉴定为成团泛菌（Pantoea agglomerans），编号CQ10；以内含中华根瘤菌（Sinorhizobium medicae，SM）的“巨能551”紫花苜蓿种子为供试材料，种样于5℃恒温保；
B、供试培养基
营养琼脂培养基NA，用于成团泛菌的纯化培养 ；
C、成团泛菌脂多糖的提取
细菌脂多糖的提取采用在NA培养基上活化48 h后的菌株，使用贝博生物科技有限公司BBproExtra脂多糖（LPS）提取试剂盒，提取成团泛菌脂多糖；
D、成团泛菌脂多糖的活性检测
制备1 EU/mL内毒素溶液，进行标准系列稀释，将内毒素标准品稀释成0.01、0.025、0.05、0.1 EU/mL 4个浓度梯度，内毒素检查用蒸馏水作空白对照，定量法鲎试剂测定脂多糖活性，具体参照GenScript的ToxinSensorTM Endotoxin Detection System试剂盒说明书进行操作，计算成团泛菌脂多糖的活性；
E、组培发芽试验
E1、参照《牧草种子检验规程GB/T 2930.4-2001》挑选籽粒饱满、无病虫害的干净种子25粒，质量浓度3%的NaClO消毒5 min、质量浓度75%的酒精消毒1 min，无菌水冲洗3~4次，4个重复；
E2、玻璃组培发芽瓶，高度10.0 cm、直径8.0 cm，中加入200ml蒸馏水和不同浓度的脂多糖，正面放置发芽床，121℃高温0.11 Mpa高压灭菌锅灭菌21 min；
E3、发芽试验 种子分为消毒和未消毒两个处理，未消毒组不作任何处理，处理组每玻璃组培发芽瓶加入1 ml、2 ml和3 ml 成团泛菌脂多糖LPSp，脂多糖浓度为0.267、0.534、0.801 EU/mL，记为A、B、C处理；无菌水处理作为对照组，记为CK；每瓶接入25粒种子，4个重复，在温度23℃、湿度45%、23.5Klux光照18h加黑暗6 h的组培室进行培养，接种后需观察对照组和处理组种子生长状态及统计种子第7 d发芽势、第30 d发芽率和发芽指数，第30 d取样测定紫花苜蓿植株鲜重、干重、苗长、根长、叶绿素等指标；种子萌发的标准为胚根突破种皮，长出0.3 cm长的白色种根，
测定指标：种子发芽率GR=（发芽的种子数/25）×100%；发芽势GP=发芽高峰期发芽的种子数/供试种子数×100%；发芽指数GI= ∑Gt/ Dt，Gt为当天的发芽数；Dt为发芽日数。
还包括如下步骤H、数据分析
采用SPSS 13.0分析软件（SPSS Inc., Chicago, IL, USA)分析种子的发芽率、根长、苗长、鲜重等指标并使用ANOVA进行显著性分析。
所述步骤E中组培发芽试验种子分为消毒和未消毒两个处理，未消毒组不作任何处理，处理组每玻璃组培发芽瓶加入1 ml、2 ml和3 ml 成团泛菌脂多糖LPSp，脂多糖浓度分别为0.267、0.534、0.801 EU/mL，并记为A、B、C处理；无菌水处理作为对照组。
本发明的有益效果为：
1、0.267 EU/mL LPSp促进了未消毒组紫花苜蓿根的结瘤。
2、0.267 EU/mL LPSp加速未消毒组紫花苜蓿根的结瘤，比对照组约提前18 d。
3、0.267 EU/mL LPSp不会影响种子的萌发，包括发芽势和发芽指数；随着LPSp浓度的升高，紫花苜蓿种子的萌发和生长受到抑制，0.801 EU/mL LPSp完全抑制了消毒组种子的萌发和生长。
附图说明
图1为内毒素含量测定标准曲线；
图2为未消毒组在4个处理下的发芽率；
图3 为消毒组在4个处理下的发芽率；
图4为紫花苜蓿在4个处理下的发芽势；
图5为紫花苜蓿在4个处理下的发芽指数；
图6为 紫花苜蓿在4个处理下的发芽率；
图7 紫花苜蓿在4个处理下的根长；
图8 紫花苜蓿在4个处理下的苗长；
图9紫花苜蓿在4个处理下的鲜重；
图10紫花苜蓿在4个处理下的干重；
图11紫花苜蓿在4个处理下的叶绿素含量；
图12不同脂多糖浓度处理下紫花苜蓿幼苗叶绿素的变化情况；
图13不同脂多糖浓度处理下第30 d紫花苜蓿幼苗结瘤情况；
图14根瘤内可培养细菌的分离情况。
具体实施方式
一种促进紫花苜蓿快速结瘤的方法，包括如下步骤：
A、供试菌株及紫花苜蓿品种选择
供试菌株分离于紫花苜蓿种子，经鉴定为成团泛菌（Pantoea agglomerans），编号CQ10；以内含中华根瘤菌（Sinorhizobium medicae，SM）的“巨能551”紫花苜蓿种子为供试材料，种样于5℃恒温保；
B、供试培养基
营养琼脂培养基NA，用于成团泛菌的纯化培养 ；
C、成团泛菌脂多糖的提取
细菌脂多糖的提取采用在NA培养基上活化48 h后的菌株，使用贝博生物科技有限公司BBproExtra脂多糖（LPS）提取试剂盒，提取成团泛菌脂多糖；
D、成团泛菌脂多糖的活性检测
制备1 EU/mL内毒素溶液，进行标准系列稀释，将内毒素标准品稀释成0.01、0.025、0.05、0.1 EU/mL 4个浓度梯度，内毒素检查用蒸馏水作空白对照，定量法鲎试剂测定脂多糖活性，具体参照GenScript的ToxinSensorTM Endotoxin Detection System试剂盒说明书进行操作，计算成团泛菌脂多糖的活性；
E、组培发芽试验
E1、参照《牧草种子检验规程GB/T 2930.4-2001》挑选籽粒饱满、无病虫害的干净种子25粒，质量浓度3%的NaClO消毒5 min、质量浓度75%的酒精消毒1 min，无菌水冲洗3~4次，4个重复；
E2、玻璃组培发芽瓶，高度10.0 cm、直径8.0 cm，中加入200ml蒸馏水和不同浓度的脂多糖，正面放置发芽床，121℃高温0.11 Mpa高压灭菌锅灭菌21 min；
E3、发芽试验 种子分为消毒和未消毒两个处理，未消毒组不作任何处理，处理组每玻璃组培发芽瓶加入1 ml、2 ml和3 ml成团泛菌脂多糖LPSp，脂多糖浓度为0.267、0.534、0.801 EU/mL，记为A、B、C处理；无菌水处理作为对照组，记为CK；每瓶接入25粒种子，4个重复，在温度23℃、湿度45%、23.5Klux光照18h加黑暗6 h的组培室进行培养，接种后需观察对照组和处理组种子生长状态及统计种子第7 d发芽势、第30 d发芽率和发芽指数，第30 d取样测定紫花苜蓿植株鲜重、干重、苗长、根长、叶绿素等指标；种子萌发的标准为胚根突破种皮，长出0.3 cm长的白色种根，
测定指标：种子发芽率GR=（发芽的种子数/25）×100%；发芽势GP=发芽高峰期发芽的种子数/供试种子数×100%；发芽指数GI= ∑Gt/ Dt，Gt为当天的发芽数；Dt为发芽日数。
还包括如下步骤H、数据分析
采用SPSS 13.0分析软件（SPSS Inc., Chicago, IL, USA)分析种子的发芽率、根长、苗长、鲜重等指标并使用ANOVA进行显著性分析。
所述步骤E中组培发芽试验种子分为消毒和未消毒两个处理，未消毒组不作任何处理，处理组每玻璃组培发芽瓶加入1 ml、2 ml和3 ml LPSp，脂多糖浓度分别为0.267、0.534、0.801 EU/mL，并记为A、B、C处理；无菌水处理作为对照组。
材料和方法
1.1供试菌株及紫花苜蓿品种
供试菌株分离于紫花苜蓿种子，经鉴定为成团泛菌（Pantoea agglomerans），编号CQ10。
以甘肃农业大学牧草种质资源实验室内含中华根瘤菌（Sinorhizobium medicae，SM）的“巨能551”紫花苜蓿种子为供试材料，种样于5℃恒温保；
1.2供试培养基
营养琼脂培养基（Nutrient Agar, NA），配方参照（Fang Z D, 1998）主要用于成团泛菌的纯化培养。
1.3成团泛菌脂多糖的提取
细菌脂多糖的提取采用在NA培养基上活化48 h后的菌株，使用贝博生物科技有限公司BBproExtra脂多糖（LPS）提取试剂盒，提取成团泛菌脂多糖，具体方法参照说明书。
1.4成团泛菌脂多糖的活性检测
制备1 EU/mL内毒素溶液，进行标准系列稀释。将内毒素标准品稀释成0.01、0.025、0.05、0.1 EU/mL 4个浓度梯度，内毒素检查用蒸馏水作空白对照，定量法鲎试剂测定脂多糖活性。具体参照GenScript的ToxinSensorTM Endotoxin Detection System试剂盒使用说明书操作方法，计算成团泛菌脂多糖的活性。
1.5 组培发芽试验
1.5.1前期准备
1) 参照《牧草种子检验规程GB/T 2930.4-2001》挑选籽粒饱满、无病虫害的干净种子25粒，质量浓度3%的NaClO消毒5 min、质量浓度75%的酒精消毒1 min，无菌水冲洗3~4次，4个重复。2)玻璃组培发芽瓶中加入200ml蒸馏水（高度10.0 cm，直径8.0 cm）和不同浓度的脂多糖，正面放置发芽床，高温高压灭菌锅（121℃、 0.11 Mpa）。灭菌21 min。
1.5.2发芽试验
种子分为消毒和未消毒两个处理，未消毒组不作任何处理。处理组每玻璃组培发芽瓶加入1 ml、2 ml和3 ml LPSp，并记为A、B、C处理；无菌水处理作为对照组，记为CK；每瓶接入25粒种子，4个重复，在温度23℃、湿度45%、光照+黑暗（18 h+6 h）的组培室进行培养。接种后需观察对照组和处理组种子生长状态及统计种子第7 d发芽势、第30 d发芽率和发芽指数，第30 d取样测定紫花苜蓿植株鲜重、干重、苗长、根长、叶绿素等指标。
种子萌发的标准为胚根突破种皮，长出0.3 cm左右长的白色种根。
测定指标：种子发芽率（GR）（%）=（发芽的种子数/25）×100%；发芽势（GP）（%）=发芽高峰期发芽的种子数/供试种子数×100%；
发芽指数（GI）= ∑Gt/ Dt（Gt：当天的发芽数；Dt：发芽日数）。
1.6数据分析
采用SPSS 13.0分析软件（SPSS Inc., Chicago, IL, USA)分析种子的发芽率、根长、苗长、鲜重等指标并使用ANOVA进行显著性分析。
结果与分析
2.1成团泛菌脂多糖的活性测定结果
以内毒素标准品绘制标准曲线，结果见图1。其方程式为：y = 0.1245x - 0.0376R² = 0.9924。将三次测定样品的平均值带入标准曲线求得成团泛菌脂多糖活性为0.267EU/mL。那么A、B、C处理的脂多糖浓度分别为0.267、0.534、0.801 EU/mL。
2.2不同浓度脂多糖对紫花苜蓿种子萌发的影响
结果如图2、3所示，接种1～7 d，未消毒组在4个处理下种子发芽率均不断提高，且第7 d均达到最大，其中，A、 B、C的种子发芽率分别为0.88、0.88、0.81，比对照分别低0.03、0.03、0.1。消毒组的A、B处理在接种后7 d种子发芽率相等且均低于对照，为0.92。C处理下的种子发芽率在接种3 d后均低于其它处理，且消毒组低于未消毒组，其中，消毒组发芽率持续为0.0，表明添加0.801 EU/mL LPSP会抑制消毒种子的萌发。
发芽能力可以通过发芽势和发芽指数来判断。从图4、5可以看出，随脂多糖浓度升高，紫花苜蓿种子发芽势和发芽指数逐渐降低，且均低于对照，其中A和B处理下的消毒组的发芽势和发芽指数均高于未消毒组，A高于B。消毒组A、B处理下的发芽势比CK分别低3%和5%，且差异性不显著（p>0.05）；发芽指数比CK分别低4.40、14.21。未消毒组A、B处理下的发芽势比CK分别低5%和3%，且差异性不显著（p>0.05）；发芽指数比CK分别低1.79、4.98。在C处理下，未消毒组的发芽势和发芽指数分别为81.33、27.88，消毒组的发芽势和发芽指数均是0，两者间差异性均显著（p<0.05），表明LPSp对紫花苜蓿的发芽无促进作用。
从图6可以看出，随脂多糖浓度升高，消毒组紫花苜蓿种子发芽率呈下降趋势， 且C与其他处理间差异显著（p<0.05）。当脂多糖浓度为0.267 EU /mL时，消毒组发芽率较其他处理分别升高了1%、93.0%；当脂多糖浓度为0.534 EU /mL时，未消毒组发芽率较其他处理分别升高了2.0%、6.67%，且相同脂多糖浓度处理下各处理间差异不显著（p>0.05）。C处理下，消毒组发芽率为0，未消毒组发芽率显著低于对照9.67%，证明高脂多糖浓度对紫花苜蓿种子发芽起到抑制作用。
2.3不同浓度脂多糖对紫花苜蓿幼苗生长的影响
从图7和8可以看出，A处理下紫花苜蓿幼苗的根长和苗长均高于CK，消毒组分别较CK升高2.2、2㎝，未消毒组分别较CK升高0.3178、1.1225㎝，且两者差异性不显著（p>0.05）。B处理下，种子虽有萌发，但只有胚芽，平均根长和苗长低于1㎝。，C处理下，种子基本未萌发，因此未测得幼苗的苗长和根长。表明高浓度的脂多糖对紫花苜蓿幼苗的生长具有显著的抑制作用。
2.4不同浓度脂多糖对紫花苜蓿鲜重及干重的影响
从图9可以得出，A处理下未消毒组幼苗鲜重显著高于CK，较CK高0.1417 g，两者差异性显著（p<0.05）。从图10可以看出，随脂多糖浓度升高，紫花苜蓿幼苗干重呈下降趋势，其中，A处理消毒组和未消毒组分别为0.0284 g、0.0258 g，B处理消毒组和未消毒组分别为0.0052 g、0.0061 g，且两者差异性不显著（p>0.05）。
2.5不同浓度脂多糖对紫花苜蓿叶绿素含量的影响
随脂多糖浓度升高，紫花苜蓿所含叶绿素逐渐降低，且相同脂多糖浓度处理下各处理间差异不显著（p>0.05）。C处理下，脂多糖浓度为0.801 EU/ mL时，消毒组和未消毒组叶绿素含量分别为0.1939、0.0617 mg/mL，幼苗已全部白化，说明高脂多糖浓度对紫花苜蓿叶绿素合成具有抑制作用。
图12A ：第13 d的消毒B处理组幼苗生长情况； B ：第30 d的消毒B处理组幼苗生长情况； C ：第13 d的未消毒B处理组幼苗生长情况；D ：第30 d的未消毒B处理组幼苗生长情况，
A: The growth of the seedlings of the disinfection B treatment groupon the 13th day; B: the growth of the seedlings of the disinfection Btreatment group on the 30th day; C: the growth of the seedlings of theundisinfected B treatment group on the 13th day; D: the undisinfected Btreatment group seedlings on the 13th day Seedling growth of disinfection Btreatment group。
2.6不同浓度脂多糖对紫花苜蓿结瘤的影响
添加不同浓度脂多糖对紫花苜蓿幼苗生长的影响差异较大，其中，对A试验组幼苗的生长具有显著的促进作用，且未消毒组幼苗第22 d会长出根瘤；对B和C试验组的生长具有强烈的抑制作用。
图13A.第30 d的未消毒对照组；B.第30 d的消毒A试验组；C.第30 d的未消毒B试验组；D.第30 d的消毒对照组；E.第30 d的消毒A试验组；F.第30 d的B消毒试验组；G.第30d的A未消毒试验组的结瘤现象；H.第30 d的A未消毒试验组的结瘤的幼苗。
A. Unsterilized control group on the 30th day; B. Disinfected A LPSptest group on the 30th day; C. Unsterilized B LPSp test group on the 30thday; D. Disinfected control group on the 30th day; E. Disinfection A LPSptest group on the 30th day; F. B disinfection LPSp test group on the 30thday; G. Nodulation of A non-sterile LPSp on the 30th day; H. A non-sterilizedlipid on the 30th day Nodular seedlings of polysaccharides。
2.7根瘤菌的分离和鉴定
从根瘤和“巨能551”紫花苜蓿种子中共分离得到9株细菌分离物，编号为1-9号菌株，根据16S rDNA序列与NCBI Blast数据库的最高的相似度菌株相比确定其属名，共有7个属，其中7 号菌株，16S rDNA序列与NCBI Blast数据库中的中华根瘤菌属（Sinorhizobium）的多数菌株同源性高于99%，结合其菌落形态特征和生理生化指标，初步将它们鉴定为中华根瘤菌（Sinorhizobium medicae，SM）。结果见下表（表1）
图14左1：根瘤在YMA培养基10-3梯度下可培养细菌分离情况；左2和左3：中华根瘤菌的生长形态。中华根瘤菌的形态特征：细胞呈杆状，（0.5～0.9）μm ×（1.2～3.0）μm，单生。在YMA 培养基上生长缓慢，第5 d的菌落生长形态为：粉色、圆形、凸起、有粘液，有光泽，边缘整齐，直径2-4 mm。
3 讨论
3.1脂多糖对紫花苜蓿发芽的影响
糖类作为微生物、动植物及人体细胞表面的重要组成部分，在生命体的生长、发育和代谢等过程中发挥着极其重要的作用，可以调节植物的营养传输、下胚轴伸长、子叶绿化和芽的发育（Shahri, 2014）。细菌细胞表面存在许多结构特异的荚膜多糖和脂多糖，是重要的毒力因子，对细菌的毒性起到了决定性作用，其结构复杂多样且高度保守，因此，糖类可作为一种有效的抗原类化合物（耿雪韵, 2016）。张文平等（2019）研究发现乳酸菌胞外多糖（20～2 000 mg/L)对水稻种子根的生长有促进作用；向达兵等（2018）研究了内生真菌（Bionectrispityodes）多糖漫种对苦荞种子萌发的影响，结果表明当所用内生真菌多糖浓度为100 mg /kg时，对苦荞株高有明显的促进效果，但当多糖浓度继续升高时，其促进效果显著下降，而当浓度上升到80mg/kg时，真菌多糖浸种处理有明显的抑制效果。本试验结果表明，成团泛菌脂多糖为0.267 EU/mL时，消毒组和未消毒组的紫花苜蓿幼苗苗长和根长均显著高于对照，但当浓度继续升高时，会出现抑制效果，这与前人的研究结果一致（张文平,2019; 向达兵, 2018）。此外，随着成团泛菌脂多糖浓度的升高，消毒组和未消毒组发芽指数、干重、叶绿素含量逐渐降低，且成团泛菌脂多糖浓度为0.801 EU/mL时，消毒组紫花苜蓿的萌发生长完全受到抑制，这可能与植株体内的激素水平和活性氧有关（Suzuki et al,2004; Ding et al., 2008；Shang-Guan et al., 2018）。
3.2脂多糖对紫花苜蓿结瘤的影响
紫花苜蓿可以和根瘤菌共生固氮，其共生固氮体系是自然界中固氮效率较高的体系之一（聂延富, 1983），对改良土壤结构、增加土壤肥力，和氮肥的施用量、养畜、保蓄水土及美化环境都有良好的改善作用，对于保护环境和农业的可持续发展也具有巨大的经济效益和生态效益。NO（nitric oxide, NO）作为一种自由基反应性气体信号分子，在豆科植物根瘤菌共生体系的功能结瘤、共生固氮和响应非生物胁迫等方面发挥着重要的功能（Shimoda et al., 2009; Kato et al., 2010; Cam et al., 2012）。最近的研究表明，用LPSP作为一种重要的生物类激发子可以诱导原生质体产生大量的NO（孙爱珍, 2010;ZEIDLER, 2004），而且NO参与介导水杨酸（salicylie acid, SA）信号途径中病原相关基因PRI基因的表达（KLESSINC, 2000）。本试验结果发现，添加不同浓度LPSP对紫花苜蓿根的结瘤的影响差异较大，仅0.267 EU/ mL LPSP未消毒组幼苗根会结瘤，其他试验组均无结瘤现象，因此我们推测在紫花苜蓿种子的萌发生长阶段，LPSP诱导紫花苜蓿原生质体产生了NO，而紫花苜蓿的结瘤可能也与NO的产生有关，且No的含量也是控制结瘤的重要因素之一，但这一假设需要进一步的研究来证实。其中0.267 EU/ mL LPSP消毒组幼苗根未结瘤我们猜想可能是消毒杀死了紫花苜蓿种子表面的一些腐生菌包括根瘤菌，破坏了其表面微生物的微生态环境，使得根瘤菌的结瘤基因无法作用于黄酮化合物从而表达信号分子结瘤因子（Denarie and Cullimore, 1993; Staehelin et al., 1995;Tejerizo et al., 2011），这一假设也需要更进一步的研究来证实。0.534 EU/mL LPSP会抑制紫花苜蓿根的伸长且植株褪绿，这与Shang-Guan结果一致（Shang-Guan et al., 2018）；另外，添加0.801 EU/ mLLPSP会完全抑制紫花苜蓿种子的发芽，这可能与LPSP浓度有很大关系，LPSP作为一种微生物相关分子模式，对于植物和动物均具有双重作用，低浓度时脂多糖可刺激机体免疫系统，增强固有免疫功能（Sang-Kyung Le, 2009; Jan-Micheltte, 2004）；高浓度时脂多糖会引起广泛而强烈的炎症反应（Kimball et al., 2003; Orellana et al., 2007）。作为革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分和细菌溶解死亡后释放的产物，具有易于分离、成本较低、过程可控等优点，具有良好的开发前景。
结论
1、0.267 EU/mL LPSp促进了未消毒组紫花苜蓿根的结瘤。
2、0.267 EU/mL LPSp加速未消毒组紫花苜蓿根的结瘤，比对照组约提前18 d。
3、0.267 EU/mL LPSp不会影响种子的萌发，包括发芽势和发芽指数；随着LPSp浓度的升高，紫花苜蓿种子的萌发和生长受到抑制，0.801 EU/mL LPSp完全抑制了消毒组种子的萌发和生长。
Claims (2)
1.一种促进紫花苜蓿快速结瘤的方法，其特征在于包括如下步骤：
A、供试菌株及紫花苜蓿品种选择
供试菌株分离于紫花苜蓿种子，经鉴定为成团泛菌（Pantoea agglomerans），编号CQ10；以内含中华根瘤菌（Sinorhizobium medicae，SM）的“巨能551”紫花苜蓿种子为供试材料，种样于5℃恒温保；
B、供试培养基
营养琼脂培养基NA，用于成团泛菌的纯化培养 ；
C、成团泛菌脂多糖的提取
细菌脂多糖的提取采用在NA培养基上活化48 h后的菌株，使用贝博生物科技有限公司BBproExtra脂多糖提取试剂盒，提取成团泛菌脂多糖；
D、成团泛菌脂多糖的活性检测
制备1 EU/mL内毒素溶液，进行标准系列稀释，将内毒素标准品稀释成0.01、0.025、0.05、0.1 EU/mL 4个浓度梯度，内毒素检查用蒸馏水作空白对照，定量法鲎试剂测定脂多糖活性，具体参照GenScript的ToxinSensorTM Endotoxin Detection System试剂盒说明书进行操作，计算成团泛菌脂多糖的活性；
E、组培发芽试验
E1、参照《牧草种子检验规程GB/T 2930.4-2001》挑选籽粒饱满、无病虫害的干净种子25粒，质量浓度3%的NaClO消毒5 min、质量浓度75%的酒精消毒1 min，无菌水冲洗3~4次，重复制作4个；
E2、玻璃组培发芽瓶，高度10.0 cm、直径8.0 cm，中加入200ml蒸馏水和不同浓度的脂多糖，正面放置发芽床，121℃高温0.11 Mpa高压灭菌锅灭菌21 min；
E3、发芽试验种子分为消毒和未消毒两个处理，未消毒组不作任何处理，处理组每玻璃组培发芽瓶加入1 ml 成团泛菌脂多糖LPSp，脂多糖浓度为0.267 EU/mL，记为A处理；无菌水处理作为对照组，记为CK；每瓶接入25粒种子，重复制作4个，在温度23℃、湿度45%、23.5Klux光照18h加黑暗6 h的组培室进行培养，接种后需观察对照组和处理组种子生长状态及统计种子第7 d发芽势、第30 d发芽率和发芽指数，第30 d取样测定紫花苜蓿植株鲜重、干重、苗长、根长、叶绿素指标；种子萌发的标准为胚根突破种皮，长出0.3 cm长的白色种根，
测定指标：种子发芽率GR=（发芽的种子数/25）×100%；发芽势GP=发芽高峰期发芽的种子数/供试种子数×100%；发芽指数GI= ∑Gt/ Dt，Gt为当天的发芽数；Dt为发芽日数。
2.根据权利要求1所述一种促进紫花苜蓿快速结瘤的方法，其特征在于还包括如下步骤H、数据分析
采用SPSS 13.0分析软件分析种子的发芽率、根长、苗长、鲜重指标并使用ANOVA进行显著性分析。
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