CN108795797B - 一株玉米根系内生阴沟肠杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株玉米根系内生阴沟肠杆菌及其应用，属于微生物领域。本发明的阴沟肠杆菌P1‑7(Enterobacter cloacae P1‑7)，已于2018年03月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号编号为CCTCC NO：M 2018130。保藏中心于2018年03月28日鉴定菌株是存活的。所述阴沟肠杆菌P1‑7具有自身固氮能力、无机磷分解能力、有机磷分解能力、解钾能力和IAA分泌能力；可以提高甜玉米甜度、改善菜心口感和提高菜心维生素C含量等等。如本发明的具备多种功能的阴沟肠杆菌为国内外首次报道，它在生产应用中将发挥更多的功能，具有广阔的市场前景。

Description

一株玉米根系内生阴沟肠杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株玉米根系内生阴沟肠杆菌及其应用。

背景技术

氮、磷、钾是植物生长和发育过程中所必需的元素，植物对这三种元素的需求很大。氮磷钾肥料在农业中的应用是一种普遍而有效的施肥方法(宋凤鸣等，2017)。然而，我国肥料利用率低，氮肥的利用率为30％～35％，磷肥的利用率为10％～20％，钾肥为35％～50％(杨青林等，2011)。长期大量施用化肥已经造成了一系列的生产和环境问题，如肥料浪费、水体富营养化、土壤结构破坏、污染物在土壤中累积以及引起土壤盐碱化，严重影响了土壤的生态环境(贾瑞莲，2016)，这种影响还导致农产品中有害物质严重超标，并最终影响人类身体健康(卢秉林等，2007)。

大气中的氮素含量极为丰富，但植物不能直接利用氮气，需要通过微生物的固氮酶把大气中的N₂还原成能被植物利用的氨态氮，这个过程就是生物固氮(新楠等，2005；Puri et al,2018)。生物固氮在生产实践中起着重要的作用，可以为植物尤其是粮食作物提供氮素营养，增加产量，减少氮肥使用和降低生产成本(沈世华等，2003)。在当今日益加强的环境意识中，生物固氮研究以及其在农业中的应用，对建立生态平衡、促进农业可持续发展等方面具有特别重要的意义(郑秀娟，2010)。

根据微生物固氮过程中获得能量的方式及其与其它生物的关系将自然界中的生物固氮大致分共生固氮、自生固氮和联合固氮三大类(新楠等，2005；张秋磊等，2008)。关于共生固氮，前人已经非常深入地研究了豆科植物的固氮根瘤菌(Azotorhizobium)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)等，并且共生固氮是3种固氮形式中效率最高的(比自生固氮效率高数十倍)，但共生固氮在全球主要粮食作物如水稻、玉米中无法单独应用(张秋磊等，2008)，使得氮素成为这些作物生产过程中的限制性因素，自生固氮和联合固氮虽然效率没有共生固氮高，但是其可以为这些禾本科植物提供氮素，近年来引起科学家的极大关注。特别是联合固氮菌，可以在植物根系或根际土壤中定殖，有的甚至能侵入植物根系的表皮组织或维管，与宿主植物形成紧密的联系，但不形成分化结构(张美琴等，2007)。

我国科学家在2000年就报道了肠杆菌科联合固氮工程菌Enterobactergergoviae在玉米中的应用效果，联合固氮工程菌应用可以使玉米增产，但增产效果受到土壤(李永兴等，2000)和玉米品种的影响(隋文志等，2000)。除肠杆菌科的联合固氮菌在玉米中的固氮效果得到研究外，巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)在玉米根系结瘤(李素翠等，2001)、定殖(Liu Yuan et al,2003)和对玉米增产(李春明等，2003；陈三凤等，2002)的效果都得到了探索和研究，近年来，科学家还研究了巴西固氮螺菌接种对玉米代谢组的影响(Brusamarello-Santos et al,2017)。由于这些固氮菌的固氮效果受到环境条件、宿主基因型等的影响，在生产中并没有得到广泛的应用。因此，此后对于联合固氮菌的筛选，多从玉米根系内部(韩梅等，2010；张多英等，2010；傅晓方等，2012)或根际(孙建光等，2010；李文凤等，2014；李琼洁等；2016)来分离，从玉米根内分离的内生联合固氮菌有肠杆菌科的克雷伯氏菌属的种类Klebsiella trevisan(韩梅等，2010)和K.oxytoca(张多英等，2010)、节杆菌(Arthrobacter sp.)、纤维化纤维菌(Cellulosimicrobium cellulans)(张多英等，2010)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)及不动杆菌(Acinetobacter sp.)等，从玉米根际分离的联合固氮菌种类有鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.(孙建光等，2010；傅晓方等，2012)和Kosakonia radicincitans(李琼洁等，2016)，这些内生或根际固氮菌不仅能够固氮，还具有促进作物生长的能力。

磷作为植物生长中所必需的营养物质，植物能够直接利用吸收的磷主要是无机磷。虽然自然界中存在大量的磷元素，但是能够被植物利用吸收的有效磷的含量不超过土壤中总磷量的5％(蒋国彪，2012)，大多数磷的存在形式是无效态磷，包括不能被直接吸收的有机磷或不溶性无机磷。土壤有机磷在植物的潜在磷源中起着重要的作用，但必须通过磷酸酶的水解释放无机磷以供植物使用(王悦等，2014)，无机磷大多是与钙、镁、铁等金属离子结合形成难溶性磷酸盐沉积。

为了保证农作物获得好的产量和品质需要施用磷肥，但是磷肥施用后，在土壤中容易形成难溶性磷，导致当季利用率只有10％～25％(张亮，2013)，长期过量施用磷肥则会造成土壤板结，水体富营养化等负面影响(周广飞，2017)。所以，利用土壤中难溶性的磷肥成为解决磷肥短缺的重要途径。土壤中具有溶磷能力的微生物包括真菌、细菌和放线菌，大多数是细菌，多以芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)、肠细菌属(Enterbacter)等为主(张亮，2013)。对玉米根际和非根际解磷细菌开展的研究显示，芽胞杆菌属的细菌是玉米根际和非根际都存在的解磷细菌类群，并且能够分解有机磷和无机磷，其次是假单胞菌属(赵小蓉等，2001)，肠细菌属，泛菌属(Pantoe)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)也是玉米根际的高效解磷细菌类型(Chung et al,2005)，根际土壤存在的解磷细菌比非根际土壤多(白文娟等，2013)。从玉米根系或其他来源获得的解磷细菌不仅对玉米表现出促生作用(胡晓峰，2010；Hameeda et al,2008)，还可以提高玉米种子的发芽率或提高玉米苗期的防御酶活性(胡晓峰，2010；李晓晓等，2014)。利用解磷生物有机肥开展的大田实验发现，解磷生物有机肥可以显著提高玉米的产量(石磊等，2014；冯伟等，2013)。

钾在地壳中的含量达2.6％(陈向东，2012)，是农作物生长所必须的三种基本营养元素之一，是影响作物品质的显著因子(沈国志等，2008)。植物中钾元素含量占干物质总含量的0.2％～4.1％，仅次于氮(邹文辉，2013)。在植物生长发育的过程中，钾元素不仅能促进植物更好的利用氮素，还参与了光合作用、同化产物的运输以及碳水化合物代谢，蛋白质的合成，而且还能提高作物的抗病虫害、抗旱等抗病性，从而提高作物的产量和品质。因此，施用钾肥对植物的生长具有重大的意义。一般来说，当作物钾缺乏时，生长速率开始减慢，而且茎相对的变弱。然后到达生长发育的中期和后期，便开始变黄甚至死亡，然后逐渐地从较低的叶子向上部叶片扩散。玉米苗期缺钾症状表现为：新的叶片叶顶和叶片边缘变黄，老叶子逐渐枯萎，节间缩短，软弱易倒伏(杜艳娣，2017)，土壤缺钾严重限制植物产量和品质。

速效钾包括土壤溶液钾和交换性钾，是指可以直接为植物所利用的，这类钾在土壤中含量相对较低，仅占全钾的0.2％～2.2％，以钾长石为主的难溶的硅铝酸钾含量占地球表面岩石和土壤的60％以上，只有经历长时间的风化作用之后，才能转化成为有效的钾元素，供植物直接吸收利用(宋凤鸣等，2017)。所以，利用微生物分解硅酸盐类矿物将土壤中无效钾释放出来，供植物吸收利用，是解决钾肥稀缺的重要途径。土壤中存在着一类细菌，可以将难以溶解的含钾矿物转变为可溶解状态，主要包括环状芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、假单胞菌、多粘类芽孢杆菌等(党雯等，2014)，其中一些类群不仅具有解钾的能力，还能够解磷和固氮，包括假单胞菌、巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌(蒋宝贵等，2005)，还有一些类型的解钾菌同时具备拮抗活性(刘光烨等，2001)。利用含有解钾菌的生物肥料拌种，能够提高玉米的产量(刘景芝，2000)。

植物内生菌(Endophyte)是一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌。普遍存在于高等植物中，木本、草本植物，单子叶植物和双子叶植物内均有内生细菌。目前已成为生物防治中有潜力的微生物农药、增产菌或作为潜在的生防载体菌而加以利用。

植物内生菌对植物产生的有益作用包括以下几个方面：

(1)作为解磷细菌(Hameeda et al,2008)产生和释放有机酸，降低植物根际土壤pH值，与Ca²⁺、Fe²⁺、A1³⁺等离子鳌合，使磷有效溶解，将土壤中的难溶解的含磷化合物转化成植物可以吸收的形态(Mehta and Nautiyal,2001)。

(2)作为解钾细菌可将难溶性的硅铝酸盐等矿物通过有机酸、氨基酸和生物膜作用等途径，将难溶矿物中的不溶性钾元素等转变为可被植物吸收的可溶态。

(3)作为固氮菌株将空气中的N₂固定还原成植物可利用的NH⁴⁺供植物利用(张美琴等，2007)。

(4)产生细胞分裂素(cytokinin)、赤霉素(gibberellin)、吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)等植物激素调控植物生长，其中IAA是一种植物体内普遍存在的内源生长素，它能够加快细胞分裂，促进种子萌发，调节植物生长。

(5)拮抗菌株通过跟病原菌竞争生存空间和营养物质例如碳源、氮源、磷或铁来抑制病原菌的生长，减少病原菌定植，或产生嗜铁素清除植物根系周围可被病原菌利用的铁元素，限制病原菌株的生长，以达到抗病和促生长的效果。

玉米内生菌的最早报道见于甜玉米，研究显示巨大芽胞杆菌和和阴沟肠杆菌是甜玉米根中常见的内生菌(McInroy and Kloepper,1995)。对甜玉米植株根、茎、叶的内生细菌研究发现，甜玉米根系内生细菌菌量最多，茎次之，叶最少(马冠华等，2004)；玉米种子、根、叶和茎中内生菌经鉴定主要为芽孢杆菌属，假单胞菌属，黄单胞菌属，欧文氏菌属和肠杆菌属(罗明等，2004)；Szilagyi-Zecchin等(2014)在玉米根系分离出固氮内生菌，并验证了固氮菌对玉米发芽以及玉米的生长发育具有促进作用。

大量的文献报道显示阴沟肠杆菌是玉米根系常见的微生物，最近的文献显示阴沟肠杆菌是玉米根系微生物群落的奠基种，当简化的微生物群落中去除阴沟肠杆菌后，玉米根系的微生物群落会崩溃，阴沟肠杆菌的地位被苍白杆菌代替，而由阴沟肠杆菌等4种主要细菌组成的微生物群落接种玉米后，能够帮助玉米抵御由F.verticillioides引起的茎基腐(Niu et al，2017)，说明阴沟肠杆菌对维持玉米根系微生物群落稳定和促进植物的抗病之间存在关联。

McInroy and Klopper(1995)比较了甜玉米根系和茎中内生菌的差异，发现Burkholderia pickettii和Enterobacter spp.是甜玉米根系常见的内生菌，其中阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae 在根中分离的几率比在茎中的高。但未对分离菌株的功能做鉴定。韩梅等(2010)从玉米中分离到具有固氮能力的内生菌，属于克雷伯氏菌，但未报道上述内生菌株固氮功能之外的其它功能。张多英等(2010)从玉米中分离到具有固氮活性的弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、节杆菌(Arthrobacter sp.)和纤维化纤维菌(Cellulosimicrobium cellulans)，也未报道上述内生菌株固氮功能之外的其它功能。傅晓方等(2012)从玉米根茎叶中分离到约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)、Sphingomonas panni、Sphingomonas yabuuchiae和巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)，报道这些菌株具有固氮和产IAA能力，其中约氏不动杆菌和巴氏葡萄球菌还具有有机磷分解能力。李琼洁等(2016)从玉米根系分离到具有固氮活性的内生菌Kosakonia radicincitans，但未报道菌株除固氮之外的功能。综上所述，在甜玉米根系中分离到阴沟肠杆菌的文献未报道分离菌株的功能，在普通玉米根系或根茎叶中并未分离到阴沟肠杆菌，且分离菌株多只报道了固氮能力，没有发现同时具备固氮、分泌IAA、解钾、解无机磷和有机磷能力的菌株，而具备多种功能的菌株在生产应用中能够发挥更多的功能。

发明内容

本发明的目的在于提供一株玉米根系内生阴沟肠杆菌及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一株阴沟肠杆菌P1-7，所述阴沟肠杆菌P1-7的保藏编号为CCTCC NO：M2018130。

本发明的阴沟肠杆菌P1-7(Enterobacter cloacae P1-7)，已于2018年03月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，中国典型培养物保藏中心；保藏号编号为CCTCC NO：M2018130。保藏中心于2018年03月28日鉴定菌株是存活的。

本发明的阴沟肠杆菌P1-7菌株分离自珠海市现代农业发展中心位于新会的甜玉米种植示范基地的甜玉米根系，为革兰氏阴性菌，菌体杆状，不产芽胞，生长需要氧气，具有自身固氮能力、无机磷分解能力、有机磷分解能力、解钾能力和IAA分泌能力。

检索已申报发明专利中涉及到阴沟肠杆菌的国内专利有三项，其中申请号20150562917.5的发明专利涉及阴沟肠杆菌未提及本发明中的功能。申请号为201410474834.6的发明专利中的阴沟肠杆菌菌株只涉及到有机磷和无机磷分解能力，未提及本发明专利中提到的IAA产生、固氮和解钾能力。申请号为CN201210279166.2的发明专利中涉及到的阴沟肠杆菌只报道了菌株产生1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)、生产嗜铁素和溶磷能力，但其报道的溶磷能力(5.459μg/mL)远低于本发明专利涉及阴沟肠杆菌的溶磷能力(75.05±0.00μg/mL)。

上述所述的阴沟肠杆菌P1-7在制备微生物肥料中的应用。

一种微生物肥料，所述微生物肥料中包含上述所述的阴沟肠杆菌P1-7的菌体。

优选的，所述微生物肥料适用于玉米、菜心等作物。所述肥料可以提高甜玉米甜度、改善菜心口感和提高菜心维生素C含量等。

上述所述的阴沟肠杆菌P1-7在制备微生物菌剂中的应用。

一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中包含有上述所述的阴沟肠杆菌P1-7的菌体。该菌剂主要用作根际接种剂或作为种子处理剂。将P1-7接种到的植物种子或根系上，可以帮助植物吸收土壤中的磷、钾元素，产生的IAA可以促进植物生长，并可能通过固氮功能为植物提供氮元素，从而达到促进植物生长和改善口感的效果。

上述所述的阴沟肠杆菌P1-7在制备植物生长促进剂中的应用。

一种植物生长促进剂，所述植物生长促进剂的活性成分包括上述所述的的阴沟肠杆菌P1-7。

优选的，所述植物包括玉米、菜心。其作用主要是提高甜玉米的甜度，改善菜心口感并提高菜心维生素C含量。

本发明的有益效果是：

本发明的阴沟肠杆菌P1-7菌株分离自珠海市现代农业发展中心位于新会的甜玉米种植示范基地的甜玉米根系，为革兰氏阴性菌，菌体杆状，不产芽胞，生长需要氧气，具有自身固氮能力、无机磷分解能力、有机磷分解能力、解钾能力和IAA分泌能力。而本发明具备多种功能的阴沟肠杆菌菌株在生产应用中将发挥更多的功能，具有广阔的市场前景。

发明人通过对阴沟肠杆菌P1-7菌株进行分析，获得的16S rDNA、hsp60基因片段，并在NCBI上通过BLAST搜索和比对后，证明阴沟肠杆菌P1-7菌株是一种新的阴沟肠杆菌菌株。在大田试验中，对照和处理都保证充足的施肥条件下，采用菌体稀释灌根的方式可以显著提高收获甜玉米的甜度。在盆栽试验中，定期给菜心灌根施用离心收集的P1-7菌体，收获后的菜心口感优于清水对照，维生素C含量比对照提高。目前尚无玉米内生菌可以提高甜玉米甜度的研究，本发明可以提高甜玉米甜度的阴沟肠杆菌为首次报道。

本发明的阴沟肠杆菌P1-7作为微生物肥料时，所述肥料可以提高甜玉米甜度、改善菜心口感和提高菜心维生素C含量等。

本发明的阴沟肠杆菌P1-7作为微生物菌剂时，主要用作根际接种剂或作为种子处理剂。将P1-7接种到的植物种子或根系上，可以帮助植物吸收土壤中的磷、钾元素，产生的IAA可以促进植物生长，并可能通过固氮功能为植物提供氮元素，从而达到促进植物生长和改善口感的效果。

本发明的阴沟肠杆菌P1-7作为植物生长促进剂时，其作用主要是提高甜玉米的甜度，改善菜心口感并提高菜心维生素C含量。

附图说明

图1基于16S rDNA基因序列的菌株P1-7与相关菌株的系统发育树；

图2基于hsp60基因序列的菌株P1-7与相关菌株的系统发育树；

图3为P1-7在固体培养基上的固氮能力测定结果；

图4为P1-7在固体培养基上的解磷能力测试结果；

图5为P1-7在固体培养基上的解钾能力测试结果。

具体实施方式

实施例1：P1-7的分离纯化和鉴定

(一)P1-7的分离、纯化和保藏

取距地表10-20cm深处的鲜食玉米根系，共采集五个样本密封于无菌袋中，放置于4℃冰箱中保存备用。

先用流水冲洗20min，洗去表面泥土后，用滤纸沥干，每个样品称取健康的根0.05g，根长大约1-2cm，对其进行表面消毒：(此步骤超净工作台中进行)75％酒精消毒30s后，用无菌水洗涤3次，每次30s，取最后一次无菌水清洗液100μL涂布于改良的NA培养基，过夜培养，平板若无菌落，标志消毒完全，若杀菌不完全，应该再次取根重新分离。将表面消毒完全的鲜食玉米根系在无菌滤纸上滤干后，加2mL无菌水用灭菌研钵研碎后，通过稀释平板方法，进行细菌的简单分离，37℃倒置培养过夜，选择10^-1平板，按照菌落的大小，产色素状况、菌落表面质地、菌落形态、隆起形态、透明度、边缘整齐度等指标挑取形态不同的菌落进行简单分类和计数，并将不同菌株进行纯化，终浓度30％的甘油保藏菌株。

(二)P1-7的生化鉴定

梅里埃细菌鉴定系统鉴定结果如下表1。

表1梅里埃系统鉴定结果

表1结果显示：经梅里埃细菌鉴定系统鉴定，该菌株为阴沟肠杆菌复合群。

(三)利用16S rDNA、hsp60基因开展的菌株鉴定

本发明对P1-7开展了16S rDNA基因序列、hsp60基因序列克隆分析和系统发育树构建，通过系统进化分析。P1-7的分离、纯化和保藏见本实施例第(一)节。

1、菌株DNA的提取

基因组DNA使用TaKaRa公司的MiNiBEST Bacterial Genomic DNA ExtractionKit Ver.2.0细菌基因组DNA提取试剂盒提取，可以获得理想的基因组DNA。

2、16S rDNA基因序列PCR扩增

采用细菌通用引物27F和1513R进行16S rDNA的PCR扩增。其中引物序列如下所示：

27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO.1)；

1513R:5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO.2).

PCR条件：95℃5min,94℃1min，56℃2min，72℃2min，30个循环，72℃10min。

用OMEGA公司凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)对扩增片段进行回收，将回收产物连接到pMD19-T载体上，转化E.coli DH5α，挑转化子经菌落PCR检验确定有目的基因插入后，摇菌，保甘油种，送Invitrogen生物工程技术有限公司广州分公司测定目的基因的碱基序列。

3、hsp60基因序列PCR扩增

菌株的hsp60扩增引物序列为如下所示：

hsp60-f：5’-GGTAGAAGAAGGCGTGGTTGC-3’(SEQ ID NO.3)；

hsp60-r：5’-ATGCATTCGGTGGTGATCATCAG-3ˊ(SEQ ID NO.4)。

PCR扩增条件：反应条件:95℃预热5min；94℃变性1min；61.8℃退火1min；72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。

扩增产物的克隆和测序方法同16S rDNA的克隆和测序。

4、序列的系统发育进化分析

去掉获得基因序列中引物片段，将剩余序列登录NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)进行在线BLAST同源性搜索，选取公开发表的相似度超过90％的序列进行系统进化分析。采用MEGA5.1软件包采用Neighbour-joining法(Kimura’s 2-parameter模型，bootstrap 1000)法构建系统发育树。

5、基于16S rDNA Blast结果的系统进化分析

如图1所示，P1-7菌株和阴沟肠杆菌的一些菌株被聚为一类，显示其为阴沟肠杆菌的可能性最大。

6、基于hsp60基因Blast结果的系统进化分析

如图2所示，P1-7和阴沟肠杆菌的菌株被聚为一类。由于阴沟肠杆菌的菌株之间存在丰富的生物多样性，P1-7和已经报道的阴沟肠杆菌之间存在较大的遗传差异，因此导致P1-7和相近菌株间的相似性不高。这个结果显示，P1-7是阴沟肠杆菌的新菌株。

实施例2：P1-7的固氮能力测试

P1-7的分离、纯化和保藏见实施例1第(一)节。

1、P1-7自生固氮菌能力检测

所用培养基为阿须贝无氮培养基，配方为0.1g CaSO₄，0.2g KH₂PO₄，0.2g NaCl，5.0g CaCO₃，0.2g MgSO₄，葡萄糖10.0g，琼脂15.0g，去离子水定容至1L，pH 7.0。将P1-7的单菌落在无氮固体培养基上划线，于37℃恒温培养箱中培养5d，观察菌落生长情况。

结果显示：P1-7可以在无氮培养基上生长，见图3，具有自身固氮能力。

2、P1-7泌氨能力检测

(1)将50μg/mL氨态氮标准溶液稀释到0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5μg/mL，采用靛粉蓝分光光度法，用0μg/mL作参比，调吸收值到零，由低浓度到高浓度测定标准系列显色液的吸收值，以吸收值作纵坐标，标准氨态氮的含量为横坐标，进行工作曲线的绘制。

(2)P1-7培养液中氨浓度检测：采用改良靛酚蓝-分光光度法，测量菌株培养液中氨态氮含量，检测菌株泌氨能力(李琼洁等，2016)。制备Ashby无氮液体培养基(每个试管装5mL)，于115℃、20min高压灭菌锅进行灭菌，待其冷却后使用。试验组接种P1-7，对照组不接菌，每个处理重复三次，28℃恒温培养箱静置培养7d，取发酵液于灭菌的15mL离心管，5000r/min离心10min，取上清液100μL，依次加入solution A5mL，solution B 5mL，充分震荡混匀后，37℃水浴锅加热20min后，取出冷却至常温并测定OD₆₃₇值，将所测值代入标准曲线进行计算。

检测结果显示：P1-7不能向培养基中分泌氨离子，可能与P1-7是玉米内生菌，需要进到植物根内才能更好发挥固氮功能有关。

实施例3：P1-7的解磷能力测试

1、P1-7在固体培养基上的解磷能力测定

用牙签挑取LB培养基上活化的P1-7菌株的单菌落，点接于蒙金娜无机磷培养基(NPA)和有机磷培养基上，30℃培养5-10d，通过测量平板上溶磷圈直径与菌落直径的比值确定菌株解磷能力(Chung et al,2005)。

测试结果显示，P1-7可以在固体无机磷和有机磷培养基上生长，因此对其在液体培养基中的溶磷能力开展测试。P1-7在有机磷培养基上的生长见图4，图4中可见：P1-7可以在含有无机磷的平板上产生透明的溶磷圈，显示菌株在植物根际不均匀的固态微环境中也可以代谢和利用磷，这对于菌株在实际应用中发挥作用具有重要的意义。

2、P1-7在液体培养基中的溶磷能力测定

(1)分别吸取5μg/mL磷标准溶液0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mL加双蒸水定容至50mL容量瓶，放置30min后用紫外分光光度计700nm波长进行测定，得到0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0μg/mL磷标准系列显色液，用0μg/mL作参比，调吸收值到零，由低浓度到高浓度测定标准系列显色液的吸收值，以吸收值作纵坐标，标准磷的含量为横坐标，进行工作曲线的绘制。

(2)样品检测：挑取P1-7单菌落接种于5mL解无机磷液体培养基，28℃、180r/min，培养7d；将解磷细菌的发酵液转到灭菌离心管后，4℃、10000r/min，离心20min，离心后，用移液管量取上清液200μL添加到50mL容量瓶中，并加双蒸水至20-25mL，混匀后用胶头滴管加入1滴2.6-二硝基酚指示剂，滴加6mol/L NaOH中和至刚呈黄色，再加入一滴2mol/LH₂SO₄，使得黄色刚好消失，用移液管加5mL钼锑抗显色剂，加水定容，摇匀，在室温下静置30min后，在紫外可见分光光度计上700nm波长处比色，以不加菌的培养基上清液为参比液并调零，然后测定样品的吸收值，代入标准曲线计算得到P1-7培养液中可溶性磷的含量为75.05±0.00μg/mL。

实施例4：P1-7解钾能力测试

1、P1-7在固体平板上解钾能力测定

按照张成省等人的文章(张成省,陈雪,张玉芹,等.烟草根际土壤中解钾细菌的分离与多样性分析[J].中国生态农业学报,2013,21(6):737-743.)的1.2方法测定P1-7菌株在解钾培养基平板上的解钾圈，不同之处在于本研究的培养时间比文献报道长，文献报道培养72h(3d)，本研究培养120h(5d)。

用牙签挑取于LB培养基倒置培养过夜的P1-7菌株，采用点板方法接种于解钾培养基平板，30℃培养5-10d。通过测量平板上溶钾圈直径与菌落直径的比值，确定菌株解钾能力。

结果如图5所示，培养到第5天，溶钾圈直径1.70cm，培养到第10天，增加到2.00cm。而张成省文章分离到的2株阴沟肠杆菌GL7和JM11，其中GL7和JM11在固体平板上的溶钾圈直径0.27cm左右，远远小于本发明P1-7的溶钾圈直径1.70cm(见图5)。

植物根际土壤的微环境中水分是不均匀的，P1-7在固体平板上解钾能力强，说明菌株在固态环境中能够利用不溶性的钾，并随着时间的推移，溶解的钾越来越多，这种能力显示本发明菌株在应用到生产中，更加能够适应根系的缺水环境并发挥功能，这对促进植物吸收利用钾并提高作物品质具有重要的意义。

2、P1-7在液体培养基中溶钾能力测试：

按照刘璇等人的文章(刘璇,孔凡玉,张成省,等.烟草根际解钾菌的筛选与鉴定[J].中国烟草科学,2012(3):28-31.)中1.2.2和张成省等人的文章(张成省,陈雪,张玉芹,等.烟草根际土壤中解钾细菌的分离与多样性分析[J].中国生态农业学报,2013,21(6):737-743.)中的1.3测定解钾菌的速效钾产生能力。其中，方法不同之处在于刘璇等(2012)未提供钾含量测定方法，张成省等(2013)和本发明使用火焰分光光度计测量，并以不接种P1-7的空白对照调零测定钾含量，其它方面无本质不同。

(1)将100μg/mL钾标准溶液分别稀释至0、0.5、1、1.5、2、2.5、3μg/mL，得到钾标准系列溶液，以最大浓度钾标准溶液调节信号强度至最大值，然后由低浓度到高浓度测定标准系列溶液的吸收值，以吸收值作纵坐标，标准钾的含量为横坐标，进行工作曲线的绘制。

(2)样品检测：P1-7的活化同无机磷溶解能力测试，取1mL P1-7的LB发酵液，在500mL含有100mL钾缺乏性培养基(含1g钾长石粉)的三角瓶中接种菌悬液5mL，空白对照中加入相同体积的无菌水，在28℃、180r/min，振荡培养7d。吸取发酵液10mL，加入2mL6％H₂O₂，放入100℃水浴锅中进行消煮，1h后取出，取消化液13000r/min离心5min，取上清1mL于50mL容量瓶，用去离子水定容至50mL后混匀，放置30min后在原子吸收光谱仪上测定吸光度值，代入标准曲线计算K⁺浓度(王珣珏等，2016；刘光烨等，2001)。

检测得到的结果显示，P1-7培养液中可溶性钾的含量为43.27±2.29mg/L。刘璇等(2012)报道的从烟草根际分离到具有解钾能力的阴沟肠杆菌K-JM-J5菌株，对钾长石分解后培养液中速效钾的含量增加了123.21％。本发明以不含菌体的对照调零测试，计算的培养液中可溶性钾的含量为43.27±2.29mg/L。本发明涉及的菌株速效钾比对照增加了143.27％，比文献报道的菌株解钾能力强。张成省等(2013)报道的阴沟肠杆菌GL7的发酵液钾浓度为2.5mg/L，JM 11菌株的发酵液钾浓度为2mg/L左右，远远低于本发明P1-7菌株测出的浓度。

实施例5：P1-7的IAA分泌能力测试

采用Salkowski比色法：在无机酸存在下，IAA能与FeCl₃作用，生成红色的螯合物，该物质在530nm有最大吸收峰。

(1)标准曲线的绘制：配制IAA标准液浓度分别为0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μg/mL。吸取2.0mL浓度不同的标准样品于2.0mL Salkowskis试剂中，充分混匀后，放于遮光的环境静置30min，然后测定OD₅₃₀值，按照横坐标为IAA浓度水平，纵坐标为吸收值，进行标准曲线的绘制。

(2)P1-7分泌IAA能力测定：取于YMD培养基培养4d的P1-7发酵液于17738×g，离心15min，取2mL上清液与2mL Salkowski′s试剂混匀，室温避光30min。颜色变红则表示能够分泌IAA。根据显色变化，用紫外分光光度计测量530nm处的OD值，筛选分泌IAA的菌株，以不接菌株的YMD培养基为对照，每个处理设置3个重复(Mohite，2013)。将所得数据代入标准曲线回归方程。

P1-7在YMD培养基中的IAA分泌水平为273.09±1.42μg/mL。

实施例6：P1-7提高甜玉米甜度的田间测试

2017年9月到2017年12月期间，在珠海区平沙台湾农民创业园开展内生菌对珠玉甜1号甜玉米生长和品质影响的田间实验。实验地总面积120m²，分为6个小区，每个小区20m²。

实验设对照区和处理区，对照区面积60m²，不施用任何菌种，其他管理同处理区，对照区种植90株玉米，3组重复。处理区面积60m²，3个重复，种植玉米90株，每个重复30株，采用灌根处理，菌株使用浓度10⁸cfu/mL，单株用量100mL，每月使用一次。

菌液准备：将供试菌株于LB固体培养基上活化，挑单菌落接于LB液体培养基，37℃、180r/min震荡培养12h，之后按1％接种量接种于100mL LB液体培养基，37℃、180r/min震荡培养4h后，1％接种量扩大接种于100mL LB液体培养基，37℃、180r/min震荡培养12h，转至无菌500mL离心管，室温，6000r/min离心10min，弃去上清，细胞重悬于100mL无菌水，室温，6000r/min离心10min，加100mL无菌水二次悬浮后，6000r/min离心10min，倒去上清。加100mL无菌水重悬细胞。稀释平板法检测发酵液浓度，使用前用无菌水调节至所需菌体浓度为1×10⁸cfu/mL。

玉米处理：2017年9月17日播种育苗1000株，一周后(2017年9月25日)移栽，移栽时随定根水第一次灌根处理，此后每月进行一次灌根，连续灌根6次。玉米移栽前施足基肥，移栽后施入一次复合肥。结果见表2。

表2大田试验农艺性状方差分析

处理	对照	P1-7
			株高(cm)	203.38±12.13A	198.83±12.17A
穗位高(cm)	66.00±9.63A	63.20±9.07A
			亩产量(g)	907.17±22.45A	897.27±36.85A
鲜苞穗重(g)	316.29±37.34A	294.33±43.47A
			净穗重(g)	227.87±30.33A	214.42±32.30A
穗长(cm)	18.25±0.84A	18.00±0.95A
			穗粗(cm)	4.55±0.19A	4.52±0.20A
百粒重(g)	41.70±1.96A	41.48±2.02A
			糖含量(％)	15.78±0.70B	16.62±1.55A
秃尖长度(cm)	1.07±1.21A	1.83±1.71A
			穗行数(行)	11.93±1.11A	11.87±0.98A
行粒数(粒)	34.82±2.67A	32.68±3.57A

表2结果显示：P1-7对甜玉米的其它农艺性状没有显著影响，但显著增加了甜玉米的糖含量，增加幅度达到5.23％。

实施例7：P1-7提高菜心口感和维生素C含量的测试

研究P1-7对十字花科蔬菜菜心产量和品质的影响，以扩大P1-7的用途。在50孔穴盘中对菜心进行育苗，育苗一周后移栽至塑料盆(口径5.3cm，直径4.6cm)中，移栽一周后利用阴沟肠杆菌P1-7菌体灌根，对照用等量清水灌根，整个生长过程施一次复合肥，菌体收集方法同实施例6。

使用时将收集的阴沟肠杆菌P1-7菌液稀释至浓度为1×10⁸cfu/mL，每一周浇一次菌液，每次每盆浇50mL菌液，共灌6次。对照用清水浇灌，70d后统计产量，用糖度计测糖份含量，并取400g对照和处理的菜心送中国广州分析测试中心进行检测。此外还对收获的菜心开展口感测试。口感测试方法如下：沸水分别烫漂处理和对照的菜心，不加油和盐，放到做好标记的盘子中，请10人品尝后投票，选出口感好的菜心。

产量和甜度统计结果如表3。氨基酸和维生素C测试结果如表4所示。

表3盆栽试验菜心的糖份含量检测，以及产量分析

处理	甜度(％)	单株产量(g)
			对照	2.76±0.27a	25.12±10.38a
P1-7	2.91±0.23a	25.60±9.62a

表3结果显示：阴沟肠杆菌P1-7处理的菜心产量和甜度略高于对照，但与对照无显著性差异，但在对菜心进行的品尝实验中，阴沟肠杆菌P1-7处理获得9票，而对照仅获得1票，以9:1的成绩高于对照的口感。

表4菜心氨基酸和维生素C测定数据

表4结果显示：P1-7处理的菜心水解氨基酸总和低于对照，但维生素C含量高于对照。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 珠海市现代农业发展中心（珠海市金湾区台湾农民创业园管理委员会、珠海市农渔科研与推广中心）

<120> 一株玉米根系内生阴沟肠杆菌及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acggctacct tgttacgact t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtagaagaa ggcgtggttg c 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgcattcgg tggtgatcat cag 23

Claims (5)

1.一株阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)P1-7，其特征在于：所述阴沟肠杆菌P1-7的保藏编号为CCTCC NO：M2018130。

2.权利要求1所述的阴沟肠杆菌P1-7在制备微生物肥料中的应用。

3.一种微生物肥料，其特征在于：所述微生物肥料中包含有权利要求1所述的阴沟肠杆菌P1-7的菌体。

4.权利要求1所述的阴沟肠杆菌P1-7在制备微生物菌剂中的应用。

5.一种微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂中包含有权利要求1所述的阴沟肠杆菌P1-7的菌体。

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