CN112006035A

CN112006035A - 用于防治植物病害的微生物源杀菌剂及其制备方法

Info

Publication number: CN112006035A
Application number: CN202010725280.8A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Jiaxing Juetuo Technology Co ltd
Current assignee: JIANGXI NEW DRAGON BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2020-07-24
Filing date: 2020-07-24
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2040-07-24
Also published as: CN112006035B

Abstract

本发明提供一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂及其制备方法，属于微生物农药技术领域，该微生物源杀菌剂制备方法具有以下步骤：将生防菌种进行斜面培养得到活化菌种；接种到液体培养基中培养得到各菌种的液体种子；将各菌种液体种子移入含有红藻氨酸的固态发酵培养基中，进行发酵培养后，无菌水浸泡、过滤得到各菌种发酵液；取发酵液混合后再与载体、助剂复混，喷雾干燥、气流粉碎得到微生物源杀菌剂。本发明制得的微生物源杀菌剂具有较好的悬浮率和较短的润湿时间，抑菌作用强，对植物病害防治效果明显。

Description

用于防治植物病害的微生物源杀菌剂及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂及其制备方法。

背景技术

农作物病害引起的损失幅度约占总产量的25～75％，以我国主要的粮食作物水稻为例，每年种植面积约4亿亩，按亩产量400公斤，水稻病害平均引起减产10％计，每年造成经济损失达300多亿元人民币之巨，严重威胁粮食作物的安全生产。目前，生产上控制植物病害除了选用良种和改进栽培措施外，主要依靠喷洒化学杀菌剂。目前使用的大多化学杀菌剂对人体和动物具有不同程度的毒害作用，残留在植物可食部分的有害成份会对人体健康造成潜在威胁，已经引起政府和社会各阶层的关注；不仅如此，有些化学农药难以分解，会长期地累积在生态系统中，造成对环境的污染，不利于社会经济的可持续发展；而且，现有的化学农药对某些植物病害并不完全有效。因此，在努力发展新一代化学农药的同时，还需要大力研究和发展高效、安全、经济、对环境相容性好的生物源农药。

微生物及其代谢产物在植物病害生物防治方面有十分重要的作用。例如，稻、麦纹枯病是世界性分布的土传真菌病害。随着作物的长期重茬连作，土壤病菌长期积累，土传病害严重发生，加之化学农药、化肥的不当使用，导致土壤板结和盐碱化严重，农产品的产量大幅下降，甚至绝收，品质差，价格低，对农民影响很大。该病在我国广大稻、麦生产区普遍发生，现已成为长江流域及黄淮平原稻、麦产区的重要病害。因此，如何发展和正确使用生物杀菌剂是发展有机、绿色农业的首选课题。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂及其制备方法，该微生物源杀菌剂为可湿性粉剂，具有较好的悬浮率和较短的润湿时间；较强的抑菌作用，对植物病害具有较好的防治效果。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂的制备方法，具有以下步骤：

菌种活化，将生防菌种进行斜面培养得到活化菌种；

菌种培养，将活化菌种接种到液体培养基中培养得到各菌种的液体种子；

菌种发酵，将各菌种液体种子移入含有红藻氨酸的固态发酵培养基中，进行发酵培养后，无菌水浸泡、过滤得到发酵液；

可湿性粉剂制备，取发酵液与载体、助剂复混，喷雾干燥、气流粉碎得到微生物源杀菌剂；

其中，载体包括蛭石和金属有机框架材料，质量比为1～1.2:1；助剂包括：分散剂MF-6、湿润剂9500、保护剂蜜糖，质量比为3～3.4:4.5～5:1。多种微生物复合杀菌剂能迅速定植到植物根围，通过与病原菌竞争侵染位点、重寄生作用、分泌生长素和促进植物营养吸收等作用，显著预防、拮抗并杀灭多种作物微生物病害；同时具有促进生作物长、提高产量和改善品质的功效。哈茨木霉、枯草孢芽杆菌次生代谢产物对控制病害发生、促进植株生长方面效果明显，可诱导植物产生抗性，抵抗病原菌浸染能力强；多粘孢芽杆菌对植物青枯病、枯萎病具有较好地抑制作用；地衣芽孢杆菌能产生多种蛋白酶和拮抗物质以及细胞分裂素和脱落酸等；与枯草芽孢杆菌和哈茨木霉搭配后，能增强产品的蛋白酶活性和拮抗农作物病原菌的能力；分泌的多种酶，通过对植物细胞壁的影响来刺激植物增强免疫特性，起到生防促生作用。红藻氨酸的加入，通过调控微生物sigma因子，增加拮抗物质等代谢物的分泌，从而增加抑菌作用，同时增强植物的免疫性能。以蛭石和金属有机框架材料混合物为载体，高孔隙率、低密度、大比表面积、孔径规则可调，吸附性强；具有较好的吸附性能和生物相容性，可提高微生物杀菌剂的悬浮率和湿润性，进而提高粉剂的生防效果。

优选地，生防菌包括：以重量份计，30～40份哈茨木霉、20～30份多粘类孢芽杆菌、10～15份地衣孢芽杆菌、10～15份枯草孢芽杆菌。

优选地，红藻氨酸通过调节生防菌sigma54和sigma70因子，改善菌种细胞的代谢。

优选地，菌种活化条件为：温度25～30℃，培养时间2～3d。

优选地，菌种培养具体为：液体培养基为PDA培养基，哈茨木霉在温度为25～28℃、转速为150～180r/min的条件下培养3～4d；多粘类孢芽杆菌、地衣孢芽杆菌、枯草孢芽杆菌在温度为28～30℃，转速为140～160r/min的条件下，培养2～3d。

优选地，菌种培养过程中活化菌种接种量为6～10％，各菌种液体种子中有效菌数不少于4×10⁹cfu/g。

优选地，发酵培养中固态发酵培养基包括：麦麸60～65g，稻壳12～15g，玉米粉5～8g，豆粕15～18g，含水量60～65％，pH调至6.8～7.2，红藻氨酸的加入量为0.5～1.5％。

优选地，微生物源杀菌剂原料组分含量为：以重量份计，25～35份发酵液，50～60份载体，15～20份助剂。

优选地，金属有机框架材料包括：MIL系列材料、PCN系列材料、UiO系列材料、ZIF系列材料、IRMOF系列材料中的一种。

优选地，在菌种发酵培养中加入甜菜碱，加入量为0.1％～0.2％。甜菜碱可以促进微生物胞外多糖的分泌，有助于物质在液体中的悬浮，提高可湿性粉剂的悬浮率，降低润湿时间；且制得的微生物源杀菌剂具有较好地生防效果。

本发明还公开了一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂。

优选地，微生物源杀菌剂芽孢含量≥2×10¹⁰cfu/g。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

多种微生物复合，可显著预防、拮抗并杀灭多种作物微生物病害。哈茨木霉、枯草孢芽杆菌、多粘孢芽杆菌次生代谢产物可诱导植物产生抗性，抵抗病原菌浸染能力强；地衣芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌和哈茨木霉搭配后，能增强产品的蛋白酶活性和拮抗农作物病原菌的能力。红藻氨酸的加入，通过调控微生物sigma因子，增加拮抗物质等代谢物的分泌，从而增加抑菌作用，同时增强植物的免疫性能。以蛭石和金属有机框架材料混合物为载体，具有较好的吸附性能和生物相容性，可提高微生物杀菌剂的悬浮率和湿润性，进而提高粉剂的生防效果。甜菜碱可促进微生物胞外多糖的分泌，进一步提高可湿性粉剂的悬浮率，降低润湿时间，改善防治效果。

本发明采用了上述技术方案提供一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂及其制备方法，该微生物源杀菌剂为可湿性粉剂，具有较好的悬浮率和较短的润湿时间；较强的抑菌作用，对植物病害具有较好的防治效果。

附图说明

图1是本发明试验例2中抑菌圈直径大小对比图；

图2是本发明试验例2中润湿时间和悬浮率测试结果对比图；

图3是本发明试验例3中微生物体内mRNA相对表达量对比图；

图4是本发明试验例4中胞外多糖含量对比图；

图5是本发明试验例5中防治效果对比图。

具体实施方式

本发明允许各种修改及变形，其特定实施例进行了举例，下面进行详细说明。但并非要把本发明限定于公开的特别形态之意，相反，本发明包括与由权利要求项所定义的本发明思想一致的所有修改、均等及替代。

这些实施例只用于更具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围并非限定于这些实施例，这是所属技术领域的技术人员不言而喻的。

本发明实施例所使用的哈茨木霉、多粘芽孢杆菌、地衣孢芽杆菌、枯草孢芽杆菌均订购于通派(上海)生物科技有限公司。

实施例1：

PDA培养基：

新鲜的马铃薯200g，琼脂16g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL；方法：将马铃薯去皮切成1cm3左右小块，放入盛有800mL蒸馏水的锅中煮30min，用纱布过滤，过滤后取滤液加葡萄糖、琼脂煮沸后分装，121℃高压灭菌20min后备用。

固态发酵培养基：

麦麸60g，稻壳15g，玉米粉5g，豆粕15g，含水量60％，pH调至7.0；121℃高压灭菌20min后备用。

一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂，原料组分包括：以重量份计，30份发酵液、60份载体、15份助剂；其中，生防菌包括：以重量份计，40份哈茨木霉、30份多粘类孢芽杆菌、15份地衣孢芽杆菌、15份枯草孢芽杆菌；载体包括蛭石和MIL系列材料，质量比为1:1；助剂包括：分散剂MF-6、湿润剂9500、保护剂蜜糖，质量比为3.2:4.8:1；固体培养基中红藻氨酸加入量为1％。

制备方法包括以下步骤：

菌种活化，将哈茨木霉、多粘类孢芽杆菌、地衣孢芽杆菌、枯草孢芽杆菌菌种进行斜面培养，在室温下放置1d后，分别转接到试管进行斜面培养，在28℃下培养2d，得到活化菌种；

菌种培养，按接种量8％将活化菌种接入到PDA培养基中培养得到各菌种的液体种子；哈茨木霉在温度为27℃、转速为180r/min的条件下培养4d；多粘类孢芽杆菌、地衣孢芽杆菌、枯草孢芽杆菌在温度为30℃，转速为160r/min的条件下，培养3d。

菌种发酵，将各菌种液体种子移入含有红藻氨酸的固态发酵培养基中，32℃固态发酵72h，得到固态发酵产物。取100g固态发酵物加入200mL无菌水浸泡20min，180r/min震荡20min，纱布过滤弃去固体残留物得到发酵液；

可湿性粉剂制备，取发酵液加入载体不断搅拌使其充分吸收，喷雾干燥后得到母粉；加入助剂复混并通过气流粉碎机粉碎得到微生物源杀菌剂。

实施例2：

PDA培养基和固态发酵培养基的制备与实施例1相同。

一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂，原料组分包括：以重量份计，25份发酵液、60份载体、15份助剂；其中，生防菌包括：以重量份计，40份哈茨木霉、30份多粘类孢芽杆菌、15份地衣孢芽杆菌、15份枯草孢芽杆菌；载体包括蛭石和MIL系列材料，质量比为1.2:1；助剂包括：分散剂MF-6、湿润剂9500、保护剂蜜糖，质量比为3.2:4.8:1；固体培养基中红藻氨酸加入量为0.5％。

制备方法步骤与实施例1相同。

实施例3：

PDA培养基和固态发酵培养基的制备与实施例1相同。

一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂，原料组分包括：以重量份计，25份发酵液、60份载体、15份助剂；其中，生防菌包括：以重量份计，40份哈茨木霉、30份多粘类孢芽杆菌、15份地衣孢芽杆菌、15份枯草孢芽杆菌；载体包括蛭石和MIL系列材料，质量比为1.2:1；助剂包括：分散剂MF-6、湿润剂9500、保护剂蜜糖，质量比为3.2:4.8:1；固体培养基中红藻氨酸加入量为1.5％。

制备方法步骤与实施例1相同。

实施例4：

PDA培养基和固态发酵培养基的制备与实施例1相同

一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂，本实施例与实施例1的不同之处在于：在菌种发酵过程中，加入0.2％的甜菜碱，可促进微生物胞外多糖的分泌，提升对载体的悬浮率，进而改善微生物源杀菌剂对植物病害的防治效果。

对比例1：

PDA培养基和固态发酵培养基的制备与实施例1相同。

一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂，包括：以重量份计，30份发酵液、60份载体、15份助剂；其中，生防菌包括：40份哈茨木霉、30份多粘类孢芽杆菌、15份地衣孢芽杆菌、15份枯草孢芽杆菌；载体为蛭石，助剂包括：分散剂MF-6、湿润剂9500、保护剂蜜糖，质量比为3.2:4.8:1。

制备方法步骤与实施例1相同。

对比例2：

PDA培养基和固态发酵培养基的制备与实施例1相同。

一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂，包括：以重量份计，30份防生菌、60份载体、15份助剂；其中，生防菌包括：以重量份计，40份哈茨木霉、30份多粘类孢芽杆菌、15份地衣孢芽杆菌、15份枯草孢芽杆菌；载体包括蛭石和MIL系列材料，质量比为1:1；助剂包括：分散剂MF-6、湿润剂9500、保护剂蜜糖，质量比为3.2:4.8:1。

制备方法与实施例1相同。

对比例3：

PDA培养基和固态发酵培养基的制备与实施例1相同。

一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂，包括：以重量份计，30份防生菌、60份载体、15份助剂；其中，生防菌包括：以重量份计，40份哈茨木霉、30份多粘类孢芽杆菌、15份地衣孢芽杆菌、15份枯草孢芽杆菌；载体为蛭石，助剂包括：分散剂MF-6、湿润剂9500、保护剂蜜糖，质量比为3.2:4.8:1；固体培养基中红藻氨酸加入量为1％。

制备方法与实施例1相同。

对比例4：

PDA培养基和固态发酵培养基的制备与实施例1相同。

一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂，包括：以重量份计，30份防生菌、60份载体、15份助剂；其中，生防菌包括：以重量份计，40份哈茨木霉、30份多粘类孢芽杆菌、15份地衣孢芽杆菌、15份枯草孢芽杆菌；载体为MIL系列材料，助剂包括：分散剂MF-6、湿润剂9500、保护剂蜜糖，质量比为3.2:4.8:1；固体培养基中红藻氨酸加入量为1％。

制备方法与实施例1相同。

试验例1：

微生物源杀菌剂质量检测

含孢量测定

称取3.0g样品，加入27mL无菌水，震荡均匀，依次10倍梯度稀释，选择两个相邻梯度，分别吸取100μL涂布于NA平板上，30℃培养20h，菌落计数。

对实施例1、实施例2、实施例3、实施例4中制得的微生物源杀菌剂进行含孢量的测定，测得芽孢含量为分别为2.8×10¹⁰cfu/g、2.3×10¹⁰cfu/g、2.5×10¹0cfu/g、3.2×10¹⁰cfu/g。

试验例2：

1、抑菌活性测定

孢悬液的制备：在培养5d的稻纹枯病菌平板上加少量无菌蒸馏水，用涂布棒刮取孢子，收集后用无菌蒸馏水调节浓度至10⁷cfu/mL，即为孢悬液。

取2mL稻纹枯病菌孢子悬浮液到融化的PDA培养基(0.7％琼脂，100mL，45℃)中，摇匀，准确取10mL以上培养基至倒好已凝固的PDA平板(每板20mL)上，凝固后用5mm直径的打孔器打孔，挑去菌饼。

取微生物源杀菌剂用无菌蒸馏水稀释10倍，震荡均匀后，吸取50μL加入到含有稻纹枯病菌板的孔中，25℃恒温培养48h。测量抑菌圈直径大小。

对实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3制得的微生物源杀菌剂进行上述测试，结果如图1所示。从图中可以看出，实施例1的抑菌圈直径要大于对比例

1、对比例2、对比例3的，表明本发明加入红藻氨酸及金属有机框架材料可提升微生物源杀菌剂的抑菌效果；且实施例1的效果稍好于实施例2、实施例3。

2、润湿时间测定

标准硬水配置：准确称取无水CaCl₂ 6.08g、MgCl₂·6H₂O 2.78g，用无菌蒸馏水溶解并定容至2L，即标准硬水母液，无菌蒸馏水稀释10倍即标准硬水。

按照国家标准GB/T 5451-2001农药可湿性粉剂润湿性测定方法，测定样品的润湿时间。

3、悬浮率测定

按照国家标准GB/T 14825-2006农药悬浮率测定方法，测定、计算样品中有效成分悬浮率。

对实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例3、对比例4制得的样品进行润湿时间和悬浮率的测定，实验结果如图2所示。从图中可以可看出，实施例制得的样品的润湿时间均小于对比例、悬浮率均高于对比例，且实施例1的效果稍好于实施例2～3；同时实施例4制得的样品的效果稍高于实施例1，表明甜菜碱的加入可促进微生物源杀菌剂悬浮率的提升，降低润湿时间，进一步改善其植物病害防治效果。

试验例3：

RT-qPCR

根据TRIzol试剂说明，称取50mg左右的发酵液样品进行总RNA的提取，然后以提取的总RNA为模板，录反应得到cDNA；采用qRT-PCR法，以cDNA作为模板，β-actin作为内参，分析基因在结肠组织中的表达。20μL扩增反应体系如下：

混匀离心后置于荧光定量PCR仪上，反应程序如下：95℃预变性4min；然后在95℃，10s60℃20s，72℃10s条件下循环45次n。反应完成后将数据整理，按2^-ΔΔCt的方法处理数据。引物序列见表1，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

对实施例1、实施例2、实施例3、对比例2进行上述测试。微生物体内sigma54和sigma70因子mRNA的含量如图3，可以看出，实施例1中加入红藻氨酸后，微生物体内sigma54和sigma70因子的mRNA相对表达量明显高于对比例2；这说明红藻氨酸的使用会引起微生物体内sigma54和sigma70因子的mRNA相对表达量的上升，且实施例1的效果优于实施例2～3。以上结果表明，红藻氨酸的加入能够在一定程度上增加sigma54和sigma70因子的表达量，促进生物体自身的生长、代谢合成以及拮抗性，提升抑菌作用，进而改善对植物病害的防治效果。

表1 RT-qPCR反应中使用的引物序列

Primer	Sequences
		β-actin-F	5’-ATTCGTCTGGAGTCATGCTAGAC-3’
β-actin-R	5’-GCTACTAGCGTCAGTCAGCTG-3’
		Sigma54-F	5’-CCATGTTCATGTCGACTGATCA-3’
Sigma54-R	5’-TTCGGAACTGTAGTCTGGAT-3’
		Sigma70-F	5’-AACGCTAGCGATGCCATGGATGCT-3’
Sigma70-R	5’-GTACTATCCAGTATATAGATC-3’

试验例4：

胞外多糖测定

采用苯酚-硫酸法进行检测。分别取实施例1和实施例4中的混合发酵液，1500r/min转速下离心15min，吸取上清液0.2mL于1.5mL的指形管中，加入0.8mL的无水乙醇摇匀后放到-4℃冰箱中静置过夜，然后取出3000r/min下离心15min。吸弃上清液，沉淀用1mL蒸馏水复溶，取0.5mL复溶液至15mL试管中(设置一空白管，用蒸馏水取代复溶液)，加入0.5mL蒸馏水、1mL 5％的苯酚和5mL浓硫酸混匀，冷却至室温后，分别测定其吸光度(OD_490nm)。根据平行测定的葡萄糖浓度-吸光度标准曲线方程和稀释情况计算出发酵液胞外多糖含量。

实验结果如图4所示。从图中可以看出，实施例4中加入甜菜碱后的混合发酵液产生的胞外多糖含量高于实施例1中的，表明甜菜碱作用后可以促进微生物分泌胞外多糖，进而提高微生物源杀菌剂的悬浮率。

试验例5：

温室盆钵防治实验

拌种处理：用微生物源杀菌剂拌种，用量为100kg供试种子加500g杀菌剂；清水拌种作对照。供试小麦为中感纹枯病的扬麦16。药剂拌种处理均采用现配现拌方式，按照(药剂量：供试种子重量＝1:50)的比例拌种，自然风干，播种。每塑料盆(直径18cm×高20cm)播种20粒经药剂处理过的麦种，各处理随机区组排列，4次重复。

试验中小麦纹枯病的发生采用人工接种发病，接种方法为沟带接种法。首先制作带菌麦粒，选饱满无病麦粒，浸泡吸胀后置于双层塑料袋中，灭菌后接种菌丝培养15～20d(25℃)，期间定期翻动麦粒，待菌丝体均匀长满培养基。在小麦播种时，将种子和带菌麦粒一起均匀施于土壤中，接种量约为5g/盆带菌麦粒。

小麦纹枯病的调查均依据《农药田间药效试验准则》，于小麦的抽穗期，采用7级分类法进行调查：0级为不发病；1级为叶鞘发病但茎秆不发病；3级为叶鞘发病，并侵入茎，但茎秆病斑环茎不足1/2；5级为茎秆病斑环茎超过1/2，但不倒伏或折断；7级为枯死、倒伏、枯白穗。病情指数和防治效果的计算公式如下：

病情指数(％)＝∑(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×7)×100

防治效果(％)＝(空白对照区病情指数-处理区病情指数)/空白对照区病情指数×100

对实施例1、实施例4、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4制得的微生物源杀菌剂进行上述试验，结果如图5所示。从图中分析可知，实施例1制得的微生物源杀菌剂的防治效果明显高于对比例，表明本发明实施例得到的杀菌剂对植物病害具有较好的防治效果；且实施例4的效果稍好于实施例1的，表明甜菜碱可起到促进的作用。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims

1.一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂的制备方法，具有以下步骤：

菌种活化，将生防菌种进行斜面培养得到活化菌种；

菌种培养，将所述活化菌种接种到液体培养基中培养得到各菌种的液体种子；

菌种发酵，将所述各菌种液体种子移入含有红藻氨酸的固态发酵培养基中，进行发酵培养后，无菌水浸泡、过滤得到发酵液；

可湿性粉剂制备，取所述发酵液与载体、助剂复混，喷雾干燥、气流粉碎得到微生物源杀菌剂；

其中，所述载体包括蛭石和金属有机框架材料，质量比为1～1.2:1；所述助剂包括：分散剂MF-6、湿润剂9500、保护剂蜜糖，质量比为3～3.4:4.5～5:1。

2.根据权利要求1所述的一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂的制备方法，其特征在于：所述生防菌包括：以重量份计，30～40份哈茨木霉、20～30份多粘类孢芽杆菌、10～15份地衣孢芽杆菌、10～15份枯草孢芽杆菌。

3.根据权利要求1所述的一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂的制备方法，其特征在于：所述红藻氨酸通过调节生防菌sigma54和sigma70因子，改善菌种细胞的代谢。

4.根据权利要求1所述的一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂的制备方法，其特征在于：所述菌种活化条件为：温度25～30℃，培养时间2～3d。

5.根据权利要求1所述的一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂的制备方法，其特征在于：所述菌种培养具体为：液体培养基为PDA培养基，哈茨木霉在温度为25～28℃、转速为150～180r/min的条件下培养3～4d；多粘类孢芽杆菌、地衣孢芽杆菌、枯草孢芽杆菌在温度为28～30℃，转速为140～160r/min的条件下，培养2～3d。

6.根据权利要求1所述的一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂的制备方法，其特征在于：所述菌种培养过程中活化菌种接种量为6～10％，各菌种液体种子中有效菌数不少于4×10⁹cfu/g。

7.根据权利要求1所述的一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂的制备方法，其特征在于：所述发酵培养中固态发酵培养基包括：麦麸60～65g，稻壳12～15g，玉米粉5～8g，豆粕15～18g，含水量60～65％，pH调至6.8～7.2；红藻氨酸加入量为0.5～1.5％。

8.根据权利要求1所述的一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂的制备方法，其特征在于：所述微生物源杀菌剂原料组分含量为：以重量份计，25～35份发酵液，50～60份载体，15～20份助剂。

9.一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂，通过权利要求1～8任一项所述的制备方法获得。

10.根据权利要求9所述的一种用于防治植物病害的微生物源杀菌剂，其特征在于：所述微生物源杀菌剂芽孢含量≥2×10¹⁰cfu/g。