CN112430558B - 一株具有抑菌能力的丝状芽孢杆菌gbw-f006及其应用 - Google Patents

一株具有抑菌能力的丝状芽孢杆菌gbw-f006及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具有抑菌能力的丝状芽孢杆菌GBW‑F006及其应用。所述丝状芽孢杆菌GBW‑F006的分类命名为丝状芽孢杆菌Bacillus filamentosus，保藏编号为CGMCC No.20918，其菌落呈乳白色，圆形，直径2‑6mm，表面光滑无皱褶，不透明，边缘整齐，无晕环；菌体呈圆柱状，芽孢端生呈椭圆形，直径1‑2μm，生长温度范围为15℃～45℃。所述丝状芽孢杆菌GBW‑F006具有很好的抑制细菌和多种病原真菌的能力，能够用来防治甜瓜的萎蔫病、枯萎病与根腐病等多种病害并促进甜瓜的茎粗、株高和出苗率以及果实的产量，因此该菌具有广阔的应用前景。

Description

一株具有抑菌能力的丝状芽孢杆菌GBW-F006及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有抑菌能力的丝状芽孢杆菌GBW-F006及其应用。
背景技术
甜瓜又称香瓜、哈密瓜等，是世界温带至热带地区广泛栽培的为果品的瓜类，其因爽甜可口、香甜浓郁以及富含大量维生素、有机酸及矿物质等营养物质受到人们的喜爱。但在甜瓜的种植过程中，会因其自身感染病原菌或种植土壤、所浇水分受到细菌、真菌的污染而导致甜瓜患病，比如萎蔫病、根腐病、炭疽病等，影响其正常生长，会使甜瓜果实弱小、品质变劣、含糖量降低。
目前，针对甜瓜的病害多采用农药或抗生素治疗，而某些农药或抗生素虽能起到较好的抑菌作用，但其溶液可能呈碱性、或有氨味，对人畜是具有低毒的，或会对土壤造成一定的破坏作用。
芽孢杆菌是一类抗逆性强、致命性低，低营养需求的革兰氏阳性菌，常用于益生菌或生防菌的开发。近年来，芽孢杆菌也因其低成本、高耐受的特性，被用于制备成微生物菌剂。但目前用于甜瓜种植中的芽孢杆菌尚少，且对所用的芽孢杆菌要求较高，不仅需要能够耐受土壤的低温，还要能在土中萌发存活、实现菌量增长，同时该菌还需在促生长、抗病害、诱导植物系统防御等多个方面具有一定作用，因此寻找一株能够满足上述条件的菌株，有利于甜瓜的种植和培育。
发明内容
本发明提供了一株具有抑菌能力的丝状芽孢杆菌GBW-F006及其应用。所述丝状芽孢杆菌GBW-F006能够产表面活性肽surfactin，具有耐低温、土中萌发增殖、拮抗病原细菌和多种病原真菌的能力。
为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：
本发明提供了一株耐低温的丝状芽孢杆菌GBW-F006，其分类命名为丝状芽孢杆菌Bacillus filamentosus，保藏编号为CGMCC No.20918。
进一步的，所述丝状芽孢杆菌GBW-F006是革兰氏阳性菌，其菌落呈乳白色，圆形，直径2-6mm，表面光滑无皱褶，不透明，边缘整齐，无晕环；菌体呈圆柱状，芽孢端生呈椭圆形，直径1-2μm。
进一步的，所述丝状芽孢杆菌GBW-F006的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步的，所述丝状芽孢杆菌GBW-F006的生长温度范围为15℃～45℃。
进一步的，所述丝状芽孢杆菌GBW-F006的最适合生长温度范围为25℃～37℃。
进一步的，所述丝状芽孢杆菌GBW-F006具有很好的抑制细菌和病原真菌的能力。
进一步的，所述丝状芽孢杆菌GBW-F006能够产表面活性肽。
进一步的，所述抑菌活性肽包括Surfactin。
本发明还提供了所述的丝状芽孢杆菌GBW-F006在用于制备抑制病原菌的微生物抑制剂中的应用。
进一步的，所述病原菌包括病原细菌和病原真菌；所述病原细菌包括霍乱弧菌和产气荚膜梭菌；所述病原真菌包括木贼镰刀菌、层出镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、白地霉和麦根腐平脐蠕孢。
本发明还提供了所述的丝状芽孢杆菌GBW-F006在用于制备防治植物病害的微生物菌剂中的应用。
进一步的，在应用时，将所述丝状芽孢杆菌GBW-F006制备成菌含量为1.3～1.56×108CFU/ml的稀释菌液后，以10-30ml/株的用量浇灌在定植的植物苗上。
进一步的，在应用时，将所述丝状芽孢杆菌GBW-F006制备成菌含量为1.3～1.56×108CFU/ml的稀释菌液后，以75-80kg/亩的用量与常规肥料混合后，在植物苗定植前，施加到种植土壤中。
进一步的，所述常规肥料包括腐熟有机肥、腐殖酸和草木灰。
进一步的，所述丝状芽孢杆菌GBW-F006能够显著降低植物病害的发病率。
进一步的，所述植物病害为由木贼镰刀菌、层出镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、白地霉和麦根腐平脐蠕孢、霍乱弧菌和产气荚膜梭菌引起的植物病害。
进一步的，所述植物病害包括萎蔫病、根腐病和枯萎病。
进一步的，所述丝状芽孢杆菌GBW-F006能够显著增加植物的茎粗、株高和出苗率。
进一步的，所述丝状芽孢杆菌GBW-F006能够明显增加植物果实的产量。
进一步的，所述植物包括甜瓜。
进一步的，所述丝状芽孢杆菌GBW-F006发酵液的制备步骤如下：将活化的所述丝状芽孢杆菌GBW-F006转移至种子培养基内，37℃、200rpm震荡12h，得到GBW-F006种子液；将GBW-F006种子液以5％体积比转接至小罐发酵培养基内，罐内温度维持在36℃～38℃，罐内压力0.05-0.06Mpa，罐内转速170～180rpm/min，培养46h～48h，镜检确定芽孢率>98％，即可停罐，得到丝状芽孢杆菌GBW-F006发酵液。
进一步的，所述丝状芽孢杆菌GBW-F006发酵液的菌含量不低于390×108CFU/ml。
进一步的，所述丝状芽孢杆菌GBW-F006稀释菌液的制备步骤为：将所述丝状芽孢杆菌GBW-F006发酵液使用空白培养基稀释250～300倍，得到丝状芽孢杆菌GBW-F006稀释菌液。
进一步的，所述丝状芽孢杆菌GBW-F006稀释菌液的菌含量为1.3～1.56×108CFU/ml。
进一步的，所述种子培养基的配方包括：蛋白胨5g，酵母粉1g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，可溶性淀粉5g，蒸馏水1L，pH 7.4～7.6。
进一步的，所述小罐发酵培养基的配方包括：玉米浆干粉1g，棉籽蛋白粉2g，蛋白胨0.8g，酵母膏0.5g，KH2PO4 0.1g，MgSO4·7H2O 0.05g，MnSO4·H2O 0.03g，中性蛋白酶5万U/g 0.1g，蒸馏水1L，pH 7.3～7.5。
本发明还提供了所述的丝状芽孢杆菌GBW-F006在用于制备发酵生产表面活性肽的微生态制剂中的应用。
进一步的，所述表面活性肽包括surfactin。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：
1、本发明所述的丝状芽孢杆菌GBW-F006分离自甜瓜根际土，应用于甜瓜生长与病害防治，具有较强的原位促适用效应。
2、本发明所述的丝状芽孢杆菌GBW-F006可耐受15℃～45℃，耐温范围广，能耐受低温，在土温约14℃～22℃的环境下，前3天仍能实现萌发与菌量增殖，具有较强的土壤应用潜力。
3、本发明所述的丝状芽孢杆菌GBW-F006发酵液含有抑菌物质表面活性肽Surfactin，且可耐受90℃、10min加热，该特性可拓宽该菌的应用场景。
4、本发明所述的丝状芽孢杆菌GBW-F006具有较强的病原细菌、真菌拮抗能力，针对厌氧产气荚膜梭菌的抑菌圈直径可达22.6mm，还可抑制霍乱弧菌，可拮抗木贼镰刀菌、层出镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、白地霉、麦根腐平脐蠕孢等多种病原真菌，针对植物萎蔫病病原菌木贼镰刀菌的抑制率高达92.9％，针对根腐病病原菌麦根腐平脐蠕孢的抑制率高达92.6％，在抗病盆栽与田间试验中，丝状芽孢杆菌GBW-F006发酵液均表现出较强的抑菌防病能力，而且其还能够增加甜瓜的茎粗、株高、出苗率和果实重量，从而提高甜瓜的种植产量和品质，增加甜瓜的种植收益，因此具有该菌广阔的应用前景。
5、本发明所述的丝状芽孢杆菌发酵液制备方法简单、合理，操作快捷，具有良好的工业化实施前景。
附图说明
图1：实施例1筛选的7株芽孢菌在低温15℃的生长比较图。
图2：丝状芽孢杆菌GBW-F006在NA培养基上的菌落、菌体与芽孢图。
图3：丝状芽孢杆菌GBW-F006在不同温度下的生长曲线。
图4：实施例1筛选的7株芽孢菌抑制好氧与厌氧细菌的能力比较图；A为霍乱弧菌，B为产气荚膜梭菌。
图5：实施例1筛选的7株芽孢菌抑制病原真菌的能力比较图；A为木贼镰刀菌，B为层出镰刀菌，C为串珠镰刀菌，D为尖孢镰刀菌，E为白地霉，F为麦根腐平脐蠕孢。
图6：丝状芽孢杆菌GBW-F006针对病原真菌的抑制情况图；A为木贼镰刀菌，B为层出镰刀菌，C为串珠镰刀菌，D为尖孢镰刀菌，E为白地霉，F为麦根腐平脐蠕孢。
图7：HPLC测定抑菌物质Surfactin的标准曲线绘制。
图8：HPLC测定丝状芽孢杆菌GBW-F006发酵液中抑菌物质Surfactin含量。
图9：丝状芽孢杆菌GBW-F006的甜瓜田间应用实例图。
具体实施方式
结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
下述实施例中，如无特殊说明，所使用的试验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
实施例中所需培养基或试验试剂配方如下：
1.营养琼脂(NA)培养基：蛋白胨10g，牛肉浸粉3g，氯化钠5g，琼脂粉20g，pH 7.2～7.4，蒸馏水1L。
2.改良营养肉汤(NB)培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，(NH4)2SO4 2g，FeSO4·7H2O 0.03g，MgSO4·7H2O 0.05g，pH 7.2-7.4，蒸馏水1L。
3.种子培养基：蛋白胨5g，酵母粉1g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，可溶性淀粉5g，pH 7.4～7.6，蒸馏水1L。
4.小罐发酵培养基：玉米浆干粉1g，棉籽蛋白粉2g，蛋白胨0.8g，酵母膏0.5g，KH2PO4 0.1g，MgSO4·7H2O 0.05g，MnSO4·H2O 0.03g，中性蛋白酶5万U/g 0.1g，pH 7.3～7.5，蒸馏水1L。
5. 2216E培养基：蛋白胨5g，酵母粉1g，pH 7.5～7.7，含有3％海盐的陈海水1L；固体培养基在此基础上加20g/L琼脂粉。
6. 1053培养基：胰蛋白胨10g，牛肉浸粉10g，葡萄糖5g，氯化钠5g；酵母浸粉3g，乙酸钠3g，可溶性淀粉1g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，pH 6.7～6.9，蒸馏水1L；固体培养基在此基础上加20g/L琼脂粉。
7.马铃薯琼脂(PDA)培养基：马铃薯浸粉6g，葡萄糖20g，pH 5.4～5.6，蒸馏水1L，固体培养基在此基础上加20g/L琼脂粉。
以上培养基在使用前，均需在116℃下灭菌30min，冷却备用。
实施例1：丝状芽孢杆菌GBW-F006的分离筛选与鉴定
1、丝状芽孢杆菌GBW-F006的分离与筛选
从河北沧州、邯郸、河南濮阳、安阳、山东青岛、海阳、青州、寿光的多地多年生蔬菜大棚内取作物根际土，于医学检验样品袋内4℃冷藏保存，并及时分离，样品涉及辣椒、西葫芦、花菜、甜瓜、番茄、黄瓜等56种作物。取土壤样品2g，放入18mL无菌水中，于30℃、200rpm/min震荡提取30min，样液于75℃水浴20min，然后进行梯度稀释，取各个梯度稀释液100μl在NA平板上进行涂布，将涂布好的平板37℃倒置培养48h，用灭菌竹签挑去不同形态的单菌落，转接于NA斜面上，37℃培养48h后镜检确定产芽孢，并将菌株于4℃保藏备用。
将低温驯化后获得的67株菌分别接种至改良营养肉汤(NB)培养基中，于15℃、200rpm/min震荡培养24h，在OD 600nm测定培养液吸光值。67株菌中，有60株在15℃下培养24h，OD600nm的吸光值<1.0，仅有7株菌在15℃下培养24h，OD 600nm的吸光值>1.0，这7株芽孢菌在低温15℃的生长情况如图1所示，其中，菌株GBW-F006的15℃培养液OD值最高，说明该菌具有很好的耐低温特性，该菌株分离自寿光上口镇李家南邵村李先洲家11年甜瓜根际土。
所述菌株GBW-F006在NA培养基上的菌落、镜检菌体与芽孢如图2所示。GBW-F006在NA培养基上的菌落如图2a，为乳白色，圆形，直径2-6mm，表面光滑无皱褶，不透明，边缘整齐，无晕环；GBW-F006在24h的10*100倍油镜镜检结果如图2b，菌体呈G+，为圆柱状，芽孢端生呈椭圆形，直径1-2μm。
2、丝状芽孢杆菌GBW-F006的16S rRNA序列测定
以所述菌株GBW-F006的DNA为模板，使用16S rDNA通用引物进行扩增，扩增片段进行序列测定，其16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示，将得到的菌株GBW-F006的16S rDNA测序结果与NCBI GenBank中的序列进行Blast比对分析，结果显示菌株GBW-F006与Bacillusfilamentosus同源相似性为99.72％，因此确定该菌株为丝状芽孢杆菌。
3、丝状芽孢杆菌GBW-F006的菌种保藏
将筛选到的菌株GBW-F006进行菌种保藏，所述丝状芽孢杆菌GBW-F006的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年10月20日；丝状芽孢杆菌Bacillus filamentosus的保藏编号为：CGMCC No.20918。
实施例2：丝状芽孢杆菌GBW-F006的生长与生理生化特性
1、GBW-F006在改良NB培养基内在不同温度下的生长曲线
将活化纯化的GBW-F006接种至改良NB培养基中，在pH 7.2-7.4，分别在15℃、25℃、37℃与45℃不同温度下，恒温、200rpm/min震荡培养36h，其中每2-6h取样，在OD600nm下测定吸光值，绘制生长曲线如图3所示：在37℃下，GBW-F006在前4h生长延滞，6-12h时菌量呈对数生长，16h菌量达到最高，直至20h菌量趋于稳定，24h以后逐渐衰亡，最高OD值达2.97；在25℃下，GBW-F006的延滞期推迟至6h，8-16h时菌量快速增长，20h-24h逐渐稳定，30h以后逐渐衰亡，最高OD值出现在20h为2.39；在45℃下，GBW-F006的延滞期推迟至8h，10-16h时菌量持续缓慢增长，20h-24h逐渐稳定，30h之后逐渐衰亡，最高OD值出现在24h为1.39；在15℃下，GBW-F006的生长持续进行，10h前生长延滞，12h-24h增长幅度比24h-36h略高，说明后期长势削弱但仍处于增长势头，进而说明GBW-F006对15℃的低温具有较好的耐受性。综合而言，丝状芽孢杆菌GBW-F006在25℃-37℃长势良好，在45℃长势有所延缓，菌量有所减少，在15℃时，生长受到低温影响，有所延后，但直至36h仍处于增长态势，这些均说明丝状芽孢杆菌GBW-F006具有较强的低温耐受性，生长温度范围广，有利于其在土壤18℃～23℃的环境中萌发、增殖。
2、GBW-F006的生理生化特征
将丝状芽孢杆菌GBW-F006在改良NB培养基进一步培养后，根据《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》中的生理生化检测方法，对该菌进行生理生化特性测定，结果如表1所示。丝状芽孢杆菌GBW-F006在15℃～45℃温度范围内均能生长繁殖，但其最适合生长温度在25℃～37℃，该菌最高可耐受9％NaCl，该菌接触酶与氧化酶反应均为阳性，可水解脲酶，分解酪素，可利用柠檬酸盐。GBW-F006还可利用木糖、蔗糖、菊粉、葡萄糖、山梨醇、水杨苷、D-海藻糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖等多种碳水化合物产酸，还可产α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、L-脯氨酸芳胺酶等。
表1丝状芽孢杆菌GBW-F006的生理生化特性
Figure BDA0002847373580000071
实施例3：丝状芽孢杆菌GBW-F006在土壤中的萌发特性
土壤准备：取寿光上口镇李家南邵村甜瓜根际土5000g，经过121℃灭菌30min，并在ZW15S26Y紫外灯管照射24h晾干后，土壤水分为4.63％；无菌土壤过18目筛，收集筛下土壤，分为7份，每份300g，装于500ml无菌烧杯内。
丝状芽孢杆菌GBW-F006发酵液准备：将菌株GBW-F006在营养琼脂(NA)平板培养基上活化2遍，挑取直径较大的单菌落接种至由营养琼脂(NA)培养基制备的茄形瓶斜面上，置于37℃培养箱内恒温培养72h，镜检确定芽孢率>99％，然后将无菌水倒入茄形瓶内，刮取表面菌苔，转移至种子培养基内，37℃、200rpm震荡12h，然后转接至小罐发酵培养基内，保持罐内温度在36℃～38℃，罐内压力0.05Mpa，罐内转速170～180rpm/min，培养46h～48h，镜检确定芽孢率>98％，即可停罐，菌量为360×108CFU/ml。
丝状芽孢杆菌GBW-F006的土壤萌发试验：取4.2ml GBW-F006发酵液，与烧杯内的灭菌土壤混合均匀，最终菌量约5×108CFU/ml。将7个含菌烧杯重新埋于李家南邵村甜瓜根际土壤里，分别于0d、1d、2d、3d、7d、15d、30d测定芽孢菌总菌量与75℃、20min加热处理后的耐热孢子菌量。菌量测定方法参照GB 20287-2006农用微生物菌剂与NYT 2321-2013微生物肥料产品检验规程。孢子萌发率＝(总菌量-75℃加热后菌量)/总菌量×100％。
丝状芽孢杆菌GBW-F006的土壤内孢子萌发率如表2所示，GBW-F006的孢子萌发率在前3d逐渐增加，3d时达88.9％，总菌量也有一定幅度增长，说明在前3d内，孢子萌发为营养体形式存在，耐受性较弱，且菌量因繁殖而略有增加；7d以后，GBW-F006的总菌量虽有上升，但孢子萌发率却明显下降，主要是因为7d以后，GBW-F006主要以孢子状态存在，土壤可利用的养分骤降，芽孢菌萌发为营养体后，再继续增殖会因营养缺乏或其他环境不适宜因素，重新转化为孢子状态，或多数菌持续以孢子状态存在而并未再萌发。经测定，该大棚的甜瓜根际土土温约14℃～22℃，最高土温经常出现在下午14:00，而最低气温多出现在凌晨3:30，环境湿度控制在65％～70％。上述试验结果表明，丝状芽孢杆菌GBW-F006适合在该土壤的温湿环境下生长，在前3d内可持续萌发并略微增殖，这将有利于GBW-F006在土壤中的萌发和增殖以及作用的发挥。
表2丝状芽孢杆菌GBW-F006的土壤内孢子萌发率
Figure BDA0002847373580000081
Figure BDA0002847373580000091
实施例4：丝状芽孢杆菌GBW-F006抑制细菌能力测试
为了进一步考察筛选芽孢菌抑制细菌的能力，对实施例1中筛选得到的7种芽孢菌抑制好氧菌霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和厌氧菌产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)的能力进行对比。
将活化纯化的7株芽孢菌接种至改良NB培养基中，37℃恒温、200rpm/min震荡培养48h，得到菌液。将霍乱弧菌活化后，接种于2216E培养基内，30℃恒温、180rpm/min震荡培养16h，备用；将产气荚膜梭菌活化后，接种于1503培养基内，置于上海助蓝密闭型抽气式厌氧罐内，放入1个日本三菱厌氧耗气包，37℃、厌氧静置培养24h，备用。
取霍乱弧菌200μl均匀涂布于2216E固体培养基上，培养基上再放8个牛津杯，牛津杯直径8mm，分别加入水和7株菌的100μl菌液，30℃恒温培养24h，用直尺量取抑菌圈直径，比较抑制好氧细菌能力。
取产气荚膜梭菌200μl均匀涂布于1503固体培养基上，培养基上放8个牛津杯，牛津杯直径8mm，分别加入水和7种株菌的100μl菌液，置于上海助蓝密闭型抽气式厌氧罐内，放入1个日本三菱厌氧耗气包，37℃、厌氧静置培养24h，用直尺量取抑菌圈直径，比较抑制厌氧细菌能力。
7种芽孢菌抑制好氧与厌氧细菌的能力见表3和图4，结果显示丝状芽孢杆菌GBW-F006有较强的抑制细菌的能力，尤其是针对厌氧产气荚膜梭菌的抑菌圈直径可达22.6mm；丝状芽孢杆菌GBW-F006抑制好氧霍乱弧菌的抑菌圈直径可达14.3mm，抑菌效果均强于其他6种菌，这些特性均有利于丝状芽孢杆菌GBW-F006在环境污染、病菌预防等方面的应用。
表3 7种芽孢菌抑制好氧与厌氧细菌的能力比较
Figure BDA0002847373580000092
Figure BDA0002847373580000101
实施例5：丝状芽孢杆菌GBW-F006抑制真菌能力定性与定量测定
为了进一步考察筛选芽孢菌抑制真菌的能力，对实施例1中筛选的7种芽孢菌抑制木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)、层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、白地霉(Galactomycescandidum)和麦根腐平脐蠕孢(Bipolaris sorokiniana)这6种病原真菌的能力进行对比。
表4靶标真菌的情况介绍
Figure BDA0002847373580000102
将活化纯化的7株芽孢菌接种至改良NB培养基中，37℃恒温、200rpm/min震荡培养48h，得到菌液。将6种靶标菌活化纯化后，接种于PDA固体培养基内，30℃恒温培养6d，至真菌菌丝长满全皿，然后通过无菌平皿用不锈钢打孔器打成直径6mm的真菌菌块。
将空白PDA培养基平板中心分别接种6种靶标真菌菌块各1块，注意菌丝部位需与培养基平面完全接触，30℃恒温培养1d至菌丝固定。次日，将PDA培养基划分为8个均等区域，然后分别将7株芽孢杆菌按顺序划线接种于PDA培养基上，基本保证中心点到每一个芽孢菌接种线的距离是一致的，将真菌平皿抑菌体系正置于30℃恒温培养箱内，培养5～6d，观察真菌菌丝与细菌菌体生长情况。抑制上述病原真菌的能力结果如图5和表5所示，丝状芽孢杆菌GBW-F006抑制这6种真菌的拮抗带宽度均最强，说明丝状芽孢杆菌GBW-F006能够很好的抑制病原真菌。
表5 7种芽孢菌抑制病原真菌的拮抗带宽度比较
Figure BDA0002847373580000111
为了进一步测定丝状芽孢杆菌GBW-F006针对6种病原真菌的抑制率，设计了如下试验：
丝状芽孢杆菌GBW-F006发酵液准备：将菌株GBW-F006在营养琼脂(NA)平板培养基上活化2遍，挑取直径较大的单菌落接种至由营养琼脂(NA)培养基制备的茄形瓶斜面上，置于37℃培养箱内恒温培养72h，镜检确定芽孢率>99％，然后将无菌水倒入茄形瓶内，刮取表面菌苔，转移至GBW-F006种子培养基内，37℃、200rpm震荡12h，然后转接至GBW-F006小罐发酵培养基内，罐内温度维持在36℃～38℃，罐内压力0.05Mpa，罐内转速170～180rpm/min，培养46h～48h，镜检确定芽孢率>98％，即可停罐，菌量为380×108CFU/ml。
将6种靶标菌活化纯化后，接种于PDA固体培养基内，30℃恒温培养6d，至真菌菌丝长满全皿，然后用无菌平皿用不锈钢打孔器打成直径6mm真菌菌块。
利用空白小罐培养基，将GBW-F006发酵液稀释至菌量为1×108CFU/ml。分别取1mlGBW-F006稀释菌液于空灭菌平皿内，然后倾注入25ml冷却至43℃的PDA固体培养基，待培养基凝固后，在平板中心分别接种6种靶标真菌菌块各1块，注意菌丝部位需与培养基平面完全接触，对照组加入1ml空白小罐培养基液，30℃恒温培养5d～6d，分别测定对照组与各个试验组的真菌菌丝直径。
丝状芽孢杆菌GBW-F006针对6种病原真菌抑制率测定结果如表6和图6所示，丝状芽孢杆菌GBW-F006针对6种靶标病原真菌的的抑制率均≥82.9％，尤其是对植物萎蔫病病原菌木贼镰刀菌的抑制率高达92.9％，针对根腐病病原菌麦根腐平脐蠕孢的抑制率高达92.6％，说明丝状芽孢杆菌GBW-F006具有强的抑制多种真菌病害的能力。这些靶标真菌多与植物萎蔫、穗腐、枯萎、根腐、果腐等病害相关，丝状芽孢杆菌GBW-F006对这些病原菌有较强拮抗能力，将有助于其在抑制这些病害的微生物制剂中抑菌作用的发挥。
表6丝状芽孢杆菌GBW-F006对病原真菌的抑制率
Figure BDA0002847373580000121
实施例6：丝状芽孢杆菌GBW-F006发酵液中抑菌物质分析
为进一步考察丝状芽孢杆菌GBW-F006发酵液抑菌物质的类别与含量，以表面活性肽Surfactin为标品，采用HPLC内标定位、外标定量法，对丝状芽孢杆菌的抑菌物质进行分析。Surfactin标品购买自北京沃凯，化学式C53H93N7O13，分子量1036g/mol。
以甲醇为溶剂，配置Surfactin浓度为100、200、400、600、1000mg/L的标品。标准液过0.22μm有机滤膜，取20μL上机。HPLC主要条件如下：色谱柱：C18,4.6*150mm；检测器：紫外UV 254nm；进样量：20μL；流动相A：乙腈(含0.1％TFA)；流动相B：水(含0.1％TFA)；流动相比例：A:B＝75:35，pH由磷酸调节至5.5；柱温：35℃；波长：210nm；流速：0.84ml/min。
根据不同浓度Surfactin标品峰面积的变化，确定IAA在该体系下的保留时间为7.961，以Surfactin浓度为横坐标，以RT为8附近的峰面积为纵坐标，绘制HPLC外标法标准曲线，如图7所示，标准曲线线性良好，R2＝0.9995。
丝状芽孢杆菌GBW-F006发酵液准备：将菌株GBW-F006在营养琼脂(NA)平板培养基上活化2遍，挑取直径较大的单菌落接种至由营养琼脂(NA)培养基制备的茄形瓶斜面上，置于37℃培养箱内恒温培养72h，镜检确定芽孢率>99％，然后将无菌水倒入茄形瓶内，刮取表面菌苔，转移至GBW-F006种子培养基内，37℃、200rpm震荡13h，然后转接至GBW-F006小罐发酵培养基内，保持罐内温度维持在36℃～38℃，罐内压力0.05Mpa，罐内转速170～180rpm/min，培养46h～48h，镜检确定芽孢率>98％，即可停罐，菌量为375×108CFU/ml。
HPLC法定量测定：取3ml上清液，加6ml甲醇，200rpm震荡萃取1h，10000rpm/min离心10min，取上清经0.22μm滤膜过滤，成为样品上机液。100μl样品上机液+100μl 100mg/LSurfactin标品混合，作为样品加内标液。图8显示HPLC法测定GBW-F008发酵液中Surfactin含量的过程，其中A组谱线为样品上机液，显示该样品在8.062处有峰，而B组谱线则显示样品加内标后，8.038处的峰面积显著上升外，其他保留时间位置峰面积均显著减少，可以确定该发酵液中含有Surfactin，含量基于17.088处的峰面积，根据HPLC外标法确定Surfactin含量为108.6mg/L，经90℃加热10min后，仍含有93.5mg/L Srufactin，留存率86.1％。由此说明丝状芽孢杆菌GBW-F006在生长代谢过程中，可合成耐热性surfactin，该物质具抑制细菌、真菌、病毒、支原体等作用，使得丝状芽孢杆菌GBW-F006可用于与颗粒化肥等混合制备微生物复合肥。
实施例7：丝状芽孢杆菌GBW-F006在盆栽体系下对甜瓜萎蔫病预防效果
试验地点：青岛龙力生物工业园瓜果类类蔬菜大棚。
供试材料：甜瓜苗、丝状芽孢杆菌GBW-F006稀释菌液。将丝状芽孢杆菌GBW-F006在NA平板培养基上活化2遍，挑取直径较大的单菌落再接种至由NA培养基制备的茄形瓶斜面上，置于37℃培养箱内恒温培养72h，镜检确定芽孢率>99％，然后将无菌水倒入茄形瓶内，刮取表面菌苔，转移至GBW-F006种子培养基内，37℃、200rpm震荡12h，得到种子液，然后将种子液以5％的体积转接至小罐发酵培养基内，保持罐内温度在36℃～38℃，罐内压力0.06Mpa，罐内转速170～180rpm/min，培养46h～48h，镜检确定芽孢率>98％，即可停罐，菌量不低于390×108CFU/ml，得到GBW-F006发酵液。再将GBW-F006发酵液使用空白培养基稀释250～300倍后，得到丝状芽孢杆菌GBW-F006稀释菌液，稀释菌液的菌含量为1.3～1.56×108CFU/ml。
靶标真菌：木贼镰刀菌病原菌菌丝液。木贼镰刀菌病原菌在PDA培养基上的菌苔，接种至PDA液体培养基中，28℃、200rpm震荡培养72h，至菌丝长满锥形瓶内。
试验采用72孔育苗穴盘进行，每盘可定植甜瓜苗72棵，设置4组，每组18棵：对照组用10ml/株的空白培养基浇灌于甜瓜苗上，3d后接种木贼镰刀菌病原菌菌丝液；试验低剂量组用10ml/株的丝状芽孢杆菌GBW-F006稀释菌液浇灌于甜瓜苗上，3d后接种木贼镰刀菌病原菌菌丝液；试验中剂量组用20ml/株的丝状芽孢杆菌GBW-F006稀释菌液浇灌于甜瓜苗上，3d后接种木贼镰刀菌病原菌菌丝液；试验高剂量组用30ml/株的丝状芽孢杆菌GBW-F006稀释菌液浇灌于甜瓜苗上，3d后接种木贼镰刀菌病原菌菌丝液。
生长方面：株高：直尺测定根部到植株生长点；茎粗：采用游标卡尺测定番茄茎基底部最宽处的直径；全株干重：样本120℃杀青3h后称量；壮苗指数＝茎粗/株高×全株干重；出苗率＝正常生长苗数/总种苗数×100％。
抗病方面：统计各组病害自接种10d的发病率、病情指数和防治效果。病情分级(0-5级)：0级：根系健全，无病斑；1级：根系上有零星病斑，但不连片；2级：根部斑连片但小于根部周长的1/4；3级：根部斑大于根部周长的1/4但小于根部周长的1/2；4级：根部斑大于根部周长的1/2但小于根部周长的3/4；5级：整个根部都有斑包围，根部腐烂。
统计计算：发病率＝处理发病株数/处理总株数×100％；病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(植株总数×最高级值)×100％；相对防效＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％；分级计数，计算病情指数和拮抗效果。
结果如表7所示，经丝状芽孢杆菌GBW-F006稀释菌液处理后，无论是甜瓜的茎粗、株高、全株干重、壮苗指数、出苗率等生长指标，还是其发病率、相对防效等抑菌抗病相关生防指标，GBW-F006试验组较对照组均有显著改善(P<0.05)，尤其是茎粗、出苗率显著提升(P<0.05)，发病率显著降低(P<0.05)，相对防效均≥62.5％。GBW-F006不同剂量试验组之间，中与高剂量组间无显著差异(P>0.05)，而中剂量组的全株干重指标与低剂量组无显著差异(P>0.05)，其他生长与抗病指标显著高于低剂量组(P<0.05)。因此，丝状芽孢杆菌GBW-F006稀释菌液，在应用10-30ml/株处理甜瓜苗时，均能够有效预防甜瓜萎蔫病的发生，并促进甜瓜苗的生长。
表7丝状芽孢杆菌GBW-F006处理后对甜瓜生长与对萎蔫病的预防情况
Figure BDA0002847373580000151
实施例8：丝状芽孢杆菌GBW-F006的甜瓜田间应用实例
试验地点：寿光上口镇李家南邵村甜瓜棚。试验采用温室大棚栽培底肥施入方式，每个处理做一畦(约30株甜瓜)，每个处理3个重复，按顺序循环排列。种苗为同批种苗，保证所有苗大小基本一致，施入底肥后同时间定植，之后浇水、施肥、打药采用同种方式，收获时测定产量、发病率等相关指标。
供试材料：甜瓜苗、丝状芽孢杆菌GBW-F006稀释菌液。将丝状芽孢杆菌GBW-F006在NA平板培养基上活化2遍，挑取直径较大的单菌落再接种至由NA培养基制备的茄形瓶斜面上，置于37℃培养箱内恒温培养72h，镜检确定芽孢率>99％，然后将无菌水倒入茄形瓶内，刮取表面菌苔，转移至GBW-F006种子培养基内，37℃、200rpm震荡12h，得到种子液，然后将种子液以5％的体积转接至小罐发酵培养基内，保持罐内温度在36℃～38℃，罐内压力0.06Mpa，罐内转速170～180rpm/min，培养46h～48h，镜检确定芽孢率>98％，即可停罐，菌量不低于390×108CFU/ml，得到GBW-F006发酵液。再将GBW-F006发酵液使用空白培养基稀释250～300倍后，得到丝状芽孢杆菌GBW-F006稀释菌液，稀释菌液的菌含量为1.3～1.56×108CFU/ml。
该大棚的常规施肥的肥料用量为腐熟有机肥350kg/亩，腐殖酸95kg/亩，草木灰5kg/亩。在常规肥料的基础上，额外施加菌株的稀释菌剂或空白培养基，应用剂量75-80kg/亩。
设置两个组，A组(培养基对照组)使用不接种菌株的空白培养基；B组(加菌试验组)使用丝状芽孢杆菌GBW-F006稀释菌液。试验维期3月，期间持续观察甜瓜苗的生长与发病情况，重点记录甜瓜萎蔫病、枯萎病、根腐病等发病率，发病率＝处理发病株数/处理总株数×100％。
图9显示了田间试验甜瓜苗定植20d后的对比效果，结果显示A组的甜瓜苗多发黄萎蔫，严重影响了光合作用，进而影响植物的生长及后期果实营养的提供，进而引起减产和进一步抗病能力的减弱；B组甜瓜苗生长良好，光合作用强，长势佳。甜瓜田间试验结果如表8所示，丝状芽孢杆菌GBW-F006稀释菌液能够显著提升甜瓜产量，增产11.63％，此外，该菌还能较好地预防甜瓜萎蔫病、根腐病和枯萎病的发生，尤其是显著降低85.11％的甜瓜萎蔫病的发生，有效避免了因病害造成的绝产减少等情况的发生。
表8甜瓜田间试验的指标对比
Figure BDA0002847373580000161
本发明所述丝状芽孢杆菌GBW-F006分离自甜瓜根际土，具有较强的病原细菌、真菌拮抗能力，针对植物萎蔫病病原菌木贼镰刀菌的抑制率高达92.9％。所述GBW-F006可耐受15℃-45℃的温度，生长温度范围广，在土中前3d内可持续萌发并略微增殖。丝状芽孢杆菌GBW-F006发酵液中含有耐热性表面活性肽Surfactin，说明其能够生产Surfactin，且稀释菌液能够有效预防甜瓜萎蔫病的发生。田间试验也验证了丝状芽孢杆菌GBW-F006应用于甜瓜大棚，可实现甜瓜增产11.63％，并降低85.11％甜瓜萎蔫病发生，还可显著降低枯萎病与根腐病的发生。所述耐低温且抗病原菌的丝状芽孢杆菌GBW-F006可耐受低温且在土中萌发增殖，还可抑制好氧、厌氧细菌与木贼镰刀菌、层出镰刀菌、串珠镰刀菌、麦根腐平脐蠕孢等多种植物病原真菌，具有较好的抗病害效果与广阔的应用前景。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 青岛尚德生物技术有限公司
<120> 一株具有抑菌能力的丝状芽孢杆菌GBW-F006及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1452
<212> DNA
<213> Bacillus filamentosus
<400> 1
cgcgggcggg tgctatacat gcaagtcgag cggagatttg aaaagcttgc ttttcaaatc 60
ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg caacctgccc ttgagacggg gataactccg 120
ggaaaccgga gctaataccg gataacacat atcttcgcat gaggatatgt tagaaggtgg 180
cttttagcta ccactcaagg atgggcccgc ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc 240
tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga 300
cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct 360
gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg 420
aagaacaagt acctgttgaa taagcaggta ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg 480
ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg 540
ggcgtaaagc gcgcgcaggc ggttccttaa gtctgatgtg aaagcccacg gctcaaccgt 600
ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag gagagcggaa ttccacgtgt 660
agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcggct ctctggtctg 720
taactgacgc tgaggcgcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc 780
acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag agggtttccg ccctttagtg ctgcagcaaa 840
cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg 900
gggacccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960
aggtcttgac atcctctgct acttctagag atagaaggtt cccttcgggg acagagtgac 1020
aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080
gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg 1140
acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1200
acacgtgcta caatggatgg tacaaagggc tgcaaaaccg tgaggtcgag ccaatcccat 1260
aaaaccattc tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagcc ggaatcgcta 1320
gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt 1380
cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta accttttgga gccagccgcc 1440
gaagtgacta gt 1452

Claims (6)

1.一株具有抑菌能力的丝状芽孢杆菌GBW-F006，其特征在于，其分类命名为丝状芽孢杆菌Bacillus filamentosus，保藏编号为CGMCC No. 20918。
2.权利要求1所述的丝状芽孢杆菌GBW-F006在用于制备抑制病原菌的微生物抑制剂中的应用，其特征在于，所述病原菌包括病原细菌和病原真菌；所述病原细菌包括霍乱弧菌和产气荚膜梭菌；所述病原真菌包括木贼镰刀菌、层出镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、白地霉和麦根腐平脐蠕孢。
3.权利要求1所述的丝状芽孢杆菌GBW-F006在用于制备防治植物病害的微生物菌剂中的应用，其特征在于，所述植物病害为木贼镰刀菌、层出镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、白地霉和麦根腐平脐蠕孢引起的病害。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在应用时，将所述丝状芽孢杆菌GBW-F006制备成菌含量为1.3~1.56×108 CFU/ml的稀释菌液后，以10-30ml/株的用量浇灌在定植的植物苗上。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在应用时，将所述丝状芽孢杆菌GBW-F006制备成菌含量为1.3~1.56×108 CFU/ml的稀释菌液后，以75-80kg/亩的用量与常规肥料混合后，在植物苗定植前，施加到种植土壤中。
6.权利要求1所述的丝状芽孢杆菌GBW-F006在用于制备发酵生产表面活性肽的微生态制剂中的应用。
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