CN111139199B - 解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17843及其应用 - Google Patents

解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17843及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其应用。本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17843。该解淀粉芽孢杆菌可以制备成微生物菌剂，也可以和其他微生物菌剂制备成复合菌剂，还可以制备成肥料，用于防治根腐病。

Description

解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17843及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其应用，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17843)、微生物菌剂、复合菌剂、肥料及防治根腐病的方法。
背景技术
近年来，由于草莓市场需求逐年扩大，种植草莓的连作重茬地面积逐年增加，从而造成草莓根部病害逐年加重，其中草莓根部重要病害之一是草莓根腐病(strawberryrootrot)，该病害通常是有多种病原菌引起的，防治困难，特别是种植在连作多年草莓地块的草莓更容易发生草莓根腐病，现已成为制约草莓产业正常发展的主要因素之一。
草莓根腐病农药防治效果发挥了巨大的作用，但是频繁使用容易引起病原菌的抗药性，降低防治效果，近年来生物防治逐渐引起人们的重视，生物防治具有安全无毒，不使病原菌产生耐药性，能改善土壤微环境等优点，目前应用最多的是芽孢杆菌类，芽孢杆菌同时还具有便于生产加工，可长期储存，防效显著且不同年份效果较一致，促进作物生长等特点而受到研究者青睐并成为目前研发的热点。
针对根腐病的防治，还需要更加有效的芽孢杆菌。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种解淀粉芽孢杆菌、微生物菌剂、复合菌剂及防治根腐病的方法。
解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，具有抑制植物病害的能力，能够产生多种代谢产物，主要包括：抑菌蛋白类，脂肽类蛋白质，伊枯草菌素A，表面活性物质，芬芥素，芽孢菌素D，大环内酯类，寡肽酶，肽类，聚酮化合物等。解淀粉芽孢杆菌对多种作物的致病真菌有较好的抑制效果，可制成生物制剂应用于植物病害防治上，因此其生物学特性和生产工艺的研究具有非常重要的意义。本发明通过筛选获得对于病原菌抗性高的菌株，经鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌，并经验证该菌株表现为对根腐病的防治效果。而且解淀粉芽孢杆菌对多种作物病害均具有很好的防治效果，例如对果蔬作物上的灰霉病菌、镰刀病菌、全蚀病菌、褐腐及炭疽病菌，对玉米大斑病又称条斑病、煤纹病、枯叶病、叶斑病等，对水稻稻曲病等均有很好的效果。所提供的解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17843)可制备微生物菌剂、复合菌剂、肥料等，用于植物的根腐病的预防和治疗。
具体而言，本发明提供了如下技术方案：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17843。本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌，从连续多年种植草莓的大棚土壤中筛选获得。经过实验室平皿拮抗实验、草莓盆栽试验、田间试验验证，通过形态学、生理生化特性及16S rRNA基因鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。其对拟盘多毛孢(P.clavispora)和镰刀菌均具有良好防治作用，对两种病原菌的抑制率均为80％以上。其能够防治因拟盘多毛孢、镰刀菌引发的根腐病，能够抑制病原微生物拟盘多毛孢和镰刀菌的菌丝生长，减少孢子产生，适应草莓种植过程中抗病需求。所提供的解淀粉芽孢杆菌使可以作为微生物菌剂，也可以和其他菌剂复配制备复合菌剂，微生物菌剂或者复合菌剂本身可以作为肥料或者加入肥料中使用，用来防治根腐病，使得作物的产量有了显著增加，品质有了明显提升、口感更佳。以草莓为例，这种作物的产量和品质的提升可以体现在单果重、亩产量和糖度等方面均有了很大提升。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括本发明第一方面所述的解淀粉芽孢杆菌。
在本发明的一些实施例中，所述微生物菌剂为干粉状，每克所述微生物菌剂中含有所述解淀粉芽孢杆菌的有效活菌数至少为1×1011CFU，优选为4×1011CFU。将微生物菌剂制备成干粉状，每克微生物菌剂中含有的有效活菌数在1×1011CFU以上，例如在2×1011CFU以上，优选为3×1011CFU，从而可以应用该微生物菌剂预防和治疗作物的根腐病，快速高效治疗作物的根腐病，提高作物品质。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种制备微生物菌剂的方法，所述微生物菌剂为本发明第二方面所述的微生物菌剂，所述方法包括：对所述解淀粉芽孢杆菌进行发酵处理；基于所述发酵处理的产物，获得所述微生物制剂。通过对上述解淀粉芽孢杆菌进行发酵处理，获得微生物菌剂，可以用于作物根腐病的防治，同时提高作物的品质和产量。
根据本发明的实施例，以上所述制备微生物菌剂的方法可以进一步包括如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述发酵处理包括：将所述解淀粉芽孢杆菌进行液体发酵培养，以便获得发酵培养液；将所述发酵培养液接种在固体发酵培养基中进行固体发酵培养，以便获得所述发酵处理的产物。
在本发明的一些实施例中，所述固体发酵培养基包括：3～10重量份的麦麸，0.5～5重量份的豆粕，0.05～0.5重量份的硫酸镁，0.05～0.5重量份的氯化钠以及水。应用该固体发酵培养基可以快速发酵获得微生物菌剂。
在本发明的一些实施例中，所述方法进一步包括：将所述发酵处理的产物进行烘干粉碎处理，获得粉末状的微生物菌剂。通过烘干粉碎处理，可以获得粉末状的微生物菌剂，方便保存和使用。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包括第一微生物菌剂和不同于所述第一微生物菌剂的第二微生物菌剂，所述第一微生物菌剂为本发明第二方面所述的微生物菌剂。通过不同的微生物菌剂进行复配，不同的微生物菌剂可以具有发挥不同或者相同或者相似的功能，通过复配可以使得复合菌剂发挥多种作物疾病的预防和治疗目的，提高作物品质。
在本发明的一些实施例中，所述第二微生物菌剂包括选自胶质芽孢杆菌菌剂、绿色木霉菌剂、土曲霉菌剂、解淀粉芽孢杆菌菌剂中的至少一种。这些微生物菌剂对于植物生长有很大的促进作用，对于病原菌有较好的防治效果，因此与所提供的第一微生物菌剂复配，可以进一步提高作物品质。
在本发明的一些实施例中，所述复合菌剂包括1～3重量份的所述第一微生物菌剂，以及选自下列中的至少一种：1～3重量份的胶质芽孢杆菌菌剂；1～3重量份的绿色木霉菌剂；1～3重量份土曲霉菌剂。
在本发明的一些实施例中，所述复合菌剂包括1～1.5重量份的所述第一微生物菌剂，以及选自下列中的至少一种：1～1.5重量份的胶质芽孢杆菌菌剂；1～1.5重量份的绿色木霉菌剂；1～1.5重量份土曲霉菌剂。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种肥料，所述肥料包括本发明第二方面所述的微生物菌剂或者本发明第四方面所述的复合菌剂。
在本发明的一些实施例中，所述肥料进一步包括基础肥料，所述基础肥料包括选自生物有机肥、无机复合肥或者有机无机复混肥中的至少一种，所述微生物菌剂或者所述复合菌剂的含量为所述基础肥料含量的1‰～5‰。
在本发明的一些实施例中，所述生物有机肥包括30～50重量份的发酵牛粪、20～40重量份的炭基肥、10～30重量份的小分子有机料，和5～15重量份的硅酸钙。
在本发明的一些实施例中，所述生物有机肥包括40重量份的发酵牛粪、30重量份的炭基肥和20重量份的小分子有机料，和10重量份的硅酸钙。
在本发明的第六方面，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌在制备微生物菌剂、复合菌剂或者肥料中的应用，所述解淀粉芽孢杆菌为本发明第一方面所述的解淀粉芽孢杆菌。
在本发明的第七方面，本发明提供了一种防治根腐病的方法，包括：对植物施用有效量的解淀粉芽孢杆菌，微生物菌剂，复合菌剂或者肥料，其中所述解淀粉芽孢杆菌为本发明第一方面所述的解淀粉芽孢杆菌，所述微生物菌剂为本发明第二方面所述的微生物菌剂，所述复合菌剂为本发明第四方面所述的复合菌剂，所述肥料为本发明第五方面所述的肥料。
在本发明的一些实施例中所述植物为草莓，所述根腐病为拟盘多毛孢和/或镰刀菌引起的根腐病。
菌种保藏说明
解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为CGMCC No.17843，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年05月22日。
附图说明
图1为根据本发明的实施例提供的解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17843)在NA培养基上的平皿形态图片。
图2为根据本发明的实施例提供的解淀粉芽孢杆菌的16srDNA基因序列系统发育树。
图3为根据本发明的实施例提供的解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17843)对拟盘多毛孢和镰刀菌的平皿拮抗效果图片，其中A图为拟盘多毛孢的平皿拮抗效果图，B图为镰刀菌的平皿拮抗效果图。
具体实施方式
下面参考附图详细描述本发明的实施例，需要说明的是，这些实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本文中，如无特殊说明，当表述某种物质的含量时，是指的该物质的质量占总物质含量的百分比。
本发明通过大量筛选工作得到一株能够防治多种植物病害的解淀粉芽孢杆菌菌株。该解淀粉芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17843。经验证，该解淀粉芽抱杆菌在防治草莓根腐病中显示出非常高效的防治效果，使得草莓产量显著增加。发明的解淀粉芽抱杆菌菌株，可以用于制备防治多种植物病害的微生物肥料中。因而，本发明的解淀粉芽抱杆菌是具有广泛应用前景。
所提供的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17843可以制备成微生物菌剂，作为单一菌剂使用。为此，在本发明的一个方面，本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17843。所提供的微生物菌剂可以作为肥料或者治病药物应用于根腐病的防治中，能够防治病虫害，提高作物产量。
所提供的微生物菌剂可以通过发酵获得。为此，在本发明的另一个方面，本发明提供了一种制备上述微生物菌剂的方法，包括：对解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17843进行发酵处理；基于所述发酵处理的产物，获得所述微生物菌剂。在本发明的至少一些实施方式中，所述发酵处理包括：将所述解淀粉芽孢杆菌进行液体发酵培养，以便获得发酵培养液；将所述发酵培养液接种在固体发酵培养基中进行固体发酵培养，以便获得所述发酵处理的产物。在至少一些实施方式中，可以利用LB培养液进行所述液体发酵培养，所述液体发酵培养的时间为10小时以上，优选为10～16小时。
在本发明至少一些实施方式中，将所述发酵培养液按照接种量(发酵培养液占所述固体发酵培养基的质量比)为5％～10％接种在固体发酵培养基中进行发酵培养。所用到的固体发酵培养基包括3～10重量份的麦麸，0.5～5重量份的豆粕，0.05～0.5重量份的硫酸镁，0.05～0.5重量份的氯化钠和水，其中所述固体发酵培养基中水的含量为50％～60％。
在一些优选实施方式中，所述固体发酵培养基包括4重量份的麦麸，1重量份的豆粕，0.1重量份的硫酸镁，0.1重量份的氯化钠和水，其中固体发酵培养基中水的含量为55％。
将获得的发酵产物烘干粉碎，所获得的每克微生物菌剂中含有的解淀粉芽孢杆菌活菌数至少为1×1011CFU，优选为2×1011CFU以上，例如可以为3×1011CFU，4×1011CFU，。
所提供的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17843不仅可以制备成微生物菌剂，作为单一菌剂使用，还可以同其他微生物菌剂进行复配，制备成复合菌剂。为此，在本发明的另一方面，本发明提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包括第一微生物菌剂和第二微生物菌剂，其中第一微生物菌剂为上述微生物菌剂(即包含有解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17843的微生物菌剂)，第二微生物菌剂不同于第一微生物菌剂。可用的第二微生物菌剂可以是其他的解淀粉芽孢杆菌菌剂，也可以是胶质芽孢杆菌菌剂，绿色木霉菌剂，土曲霉菌剂等等，只要能够起到防治病虫害或者疾病的目的即可。这里的胶质芽孢杆菌菌剂是指包含有胶质芽孢杆菌的微生物菌剂，绿色木霉菌剂是指包含有绿色木霉的微生物菌剂，相似地，其他菌剂也做类似理解。
在制备这些复合菌剂的过程中，可以将各微生物在适合条件下制备成相应微生物菌剂，然后再进行复配。例如，胶质芽孢杆菌可以按照与解淀粉芽孢杆菌相似的条件进行发酵，制备胶质芽孢杆菌菌剂。在至少一些实施方式中，胶质芽孢杆菌菌剂通过下述方法发酵获得：将胶质芽孢杆菌进行液体发酵培养，然后将发酵培养液接种到第一固体发酵培养基上。在至少一些实施方式中，该第一固体发酵培养基包括：3～10重量份的麦麸，0.5～5重量份的豆粕，0.05～0.5重量份的硫酸镁，0.05～0.5重量份的氯化钠以及水，其中所述固体发酵培养基中水的含量为50％～60％。在一些优选实施方式中，所述固体发酵培养基包括4重量份的麦麸，1重量份的豆粕，0.1重量份的硫酸镁，0.1重量份的氯化钠和水，其中固体发酵培养基中水的含量为55％。在一些实施方式中，可以将发酵液按照5％～10％接种量进行接种。
绿色木霉和土曲霉可以采用相似的条件发酵制备绿色木霉菌剂或者土曲霉菌剂。在本发明的至少一些实施方式中，可以将绿色木霉和土曲霉分别在PDA液体培养液中发酵，然后将发酵培养液接种到第二固体发酵培养基上，分别得到土曲霉和绿色木霉的发酵产物。其中，可用的第二固体发酵培养基包括：2～5重量份的麦麸，1～5重量份的玉米淀粉，0.5～3重量份的大米碎渣，0.5～3重量份的小米，0.3～1.5重量份的秸秆渣和水，其中该固体发酵培养基中水的含量为55％～65％。在一些优选实施方式中，第二固体发酵培养基包括：2重量份的麦麸，1.5重量份的玉米淀粉，1重量份的大米碎渣，1重量份的小米，0.5重量份的秸秆渣和水，其中该固体发酵培养基中水的含量为60％。将得到土曲霉和绿色木霉的发酵产物分别进行烘干粉碎，获得粉末状的土曲霉菌剂和绿色木霉菌剂，其中每克土曲霉菌剂含有土曲霉的有效活菌数为3×1010以上，优选为5×1010；每克绿色木霉菌剂含有绿色木霉的有效活菌数为2×1010，优选为4×1010。
在本发明的至少一些实施方式中，本发明提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包括上述第一微生物菌剂以及上述胶质芽孢杆菌菌剂、绿色木霉菌剂、土曲霉菌剂中至少一种。在一些实施例中，上述第一微生物菌剂在与胶质芽孢杆菌菌剂、绿色木霉菌剂、土曲霉菌剂中的任意一种或者任意几种复配时，可以按照1～3:1～3的比例进行掺混。所得到的复合菌剂每克含有活菌数为1000亿以上，优选为2000亿以上，例如为3000亿。
在本发明的至少一些实施方式中，本发明提供的复合菌剂包括1～3重量份的上述第一微生物菌剂，以及选自下列中的至少一种：1～3重量份的所述胶质芽孢杆菌菌剂；1～3重量份的所述绿色木霉菌剂；1～3重量份所述土曲霉菌剂。在本发明的另一些实施方式中，本发明提供的复合菌剂包括1～1.5重量份的所述第一微生物菌剂，以及选自下列中的至少一种：1～1.5重量份的所述胶质芽孢杆菌菌剂；1～1.5重量份的所述绿色木霉菌剂；1～1.5重量份的所述土曲霉菌剂。根据本发明的实施例，每克胶质芽孢杆菌菌剂中含有胶质芽孢杆菌的有效活菌数为1×1011CFU以上；每克绿色木霉菌剂含有绿色木霉的有效活菌数为2×1010以上，优选为4×1010；每克土曲霉菌剂中含有土曲霉的有效活菌数为3×1010以上，优选为5×1010。
上述提供的微生物菌剂或者复合菌剂可以单独作为肥料或者治病药物使用，也可以添加到肥料中使用。例如可以将上述微生物菌剂或者复合菌剂添加到生物有机肥、有机复合肥、无机复合肥、有机无机复混肥中，添加量可以为千分之一以上，获得相应的微生物肥料，用于植物促生或者根腐病的防治。为此，在本发明的又一方面，本发明提供了一种肥料，所述肥料包括上述微生物菌剂或者复合菌剂。在至少一些实施方式中，所制备的每克肥料中含有的有效活菌数为1亿以上，例如为1.2亿。
在本发明的至少一些实施方式中，所提供的肥料包括生物有机肥和微生物菌剂或者复合菌剂，所述生物有机肥包括30～50重量份的发酵牛粪、20～40重量份的炭基肥、10～30重量份的小分子有机料，5～15重量份的硅酸钙；其中，所述微生物菌剂或者所述复合菌剂的含量为所述生物有机肥的千分之一到千分之五。在本发明的一些优选实施方式中，所提供的肥料包括生物有机肥，和所述微生物菌剂或者所述复合菌剂，所述生物有机肥包括40重量份的发酵牛粪、30重量份的炭基肥和20重量份的小分子有机料，10重量份的硅酸钙，其中，所述微生物菌剂或者所述复合菌剂的含量为所述生物有机肥的含量的千分之一到千分之五。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1解淀粉芽孢杆菌的分离与筛选
本发明的解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17843)从草莓根系表面采用平板涂布法和平板划线法分离获得，包括如下步骤：
(1)芽孢杆菌的分离筛选：在山东莒南草莓大棚根腐病发病田块中选取健康草莓植株，将根部土壤轻轻抖落，用清水冲洗干净，然后将其放置在称量纸上用刀片轻刮草莓根系，全部收集混匀，称取1g放入100ml无菌水中，150rpm，30℃条件下振荡30min，然后进行梯度稀释，至104倍，选取3个梯度进行涂布，每个梯度3个平行，在30℃培养箱中培养2d后选取不同菌落形态的菌株在NA培养基上划线，定期观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化菌株，分别编号保存。
(2)草莓根腐病病原菌的拮抗菌株的筛选
初筛：采用平板对峙法，制备PDA培养基，用打孔器在草莓根腐病病原菌(拟盘多毛孢和镰刀菌)边缘打取直径为5mm的菌饼，将其移植在平板中央，同时将菌株用牙签接种在平板四周，25℃恒温培养，逐日观察菌株对病原菌的抑制作用。
复筛：通过再次对比筛选，获得对拟盘多毛孢和镰刀菌病原菌均具有拮抗效果，且拮抗效果最好的微生物菌株，该微生物菌株同时表现出强的耐温、耐盐特性。
实施例2解淀粉芽孢杆菌的鉴定
实施例2对实施例1所获得的微生物菌株进一步进行鉴定，经鉴定该微生物菌株为解淀粉芽孢杆菌。主要进行了微生物学特性鉴定以及分子生物学特性鉴定，包括：
(1)微生物学特性：在NA培养基上菌落形态为圆形，乳白色微黄，表面粗糙起褶皱，在NA培养基上，28℃培养2d后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)，结果如图1所示。
(2)分子生物学特性：
其16S rRNA测序结果如SEQ ID NO:1所示。
ACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGT(SEQ ID NO:1)
该菌株16srDNA基因序列系统发育树如图2所示。
经鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌，将该菌株进行保藏，保藏编号为CGMCCNo.17843，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例3解淀粉芽孢杆菌的抗病效果
1、平皿抗病效果：
采用平皿对峙法，制备PDA培养基，用打孔器在草莓根腐病病原菌(分别为拟盘多毛孢和镰刀菌)边缘打取直径为5mm的菌饼，将其移植在平板中央，同时将解淀粉芽孢杆菌菌株用牙签接种在平板四周，且将其与外购解淀粉芽孢杆菌(分别为W1、W2和W3)、胶质芽孢杆菌(W4)、枯草芽孢杆菌(分别为W5和W6)进行拮抗效果对比，接种后将培养皿在25℃恒温培养，测定拮抗率，结果如图3所示。图3中A图代表拟盘多毛孢的平皿拮抗效果图，B图代表镰刀菌的平皿拮抗效果图。
其中拮抗率通过下述公式计算获得：，其中公式中对照菌落直径是指以下述PDA培养基处理，对应的病原菌的菌落直径。
拮抗率(％)＝(对照菌落直径–处理菌落直径)/对照菌落直径*100(公式)
测定结果如下表1所示：
表1平皿拮抗效果
Figure GDA0002426543870000091
实验结果表明，针对草莓根腐病病原菌的平皿拮抗效果表明，本发明所述的解淀粉芽孢杆菌，相较外购的解淀粉芽孢杆菌，其针对拟盘多毛孢病原菌的拮抗率，具有25％～33％提升，针对镰刀菌病原菌的拮抗率有了27％的提升；而且相较于枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌来说，针对两种病原菌的拮抗率也有了明显提升。
2、盆栽试验抗病效果
通过下述方法对不同微生物菌株的治病效果进行验证，包括：
(1)病原菌孢子悬液的制备。将两种病原菌分别接种在PDA平板上，在25℃恒温培养箱中培养5-7d，待菌株长满整个平板后，用无菌水将平板上的孢子冲洗掉，然后离心，收集病原菌孢子，用血球计数板在显微镜下计数，将孢子悬液稀释至106个/ml，备用。
(2)拮抗菌悬液制备。将拮抗菌(包括上述提到的解淀粉芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)从平皿上接种至100mlLB液体摇瓶中，进行发酵，温度为30℃，pH6.8，转速140rpm，培养24h。24h后将其菌悬液浓度调整至108cfu/ml，备用。
(3)抗病试验。试验于山东省临沂市中化农业(临沂)研发中心有限公司试验大棚内进行，试验分组，分别为对照组1、对照组2、实验组1～实验组7，每组20盆，每盆种植一株长势一致、无叶斑的健康草莓植株，盆为30cm×20cm×30cm(盆口直径×盆底直径×盆高)，盆中装3.5kg灭菌土壤。
其中，在缓苗后15天后分别将实验组1～实验组7的不同的菌悬液接入到各盆植株根部土壤中，48小时后接入病原菌孢子悬液(拟盘多毛孢和镰刀菌，其浓度为106cfu/ml)，试验期为30天(以缓苗15天后开始计算)，各处理每天浇水量相同，统一管理。其中实验组1接入解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17843)菌悬液、实验组2～实验组4分别接入外购解淀粉芽孢杆菌(W1)菌悬液、外购解淀粉芽孢杆菌(W2)菌悬液、外购解淀粉芽孢杆菌(W3)菌悬液，实验组5接入外购外胶质芽孢杆菌(W4)菌悬液，实验组6和实验组7分别接入外购枯草芽孢杆菌(W5)菌悬液、外购枯草芽孢杆菌(W6)菌悬液。
另外，对照组1不做任何处理；对照组2接两种病原菌孢子悬液(1：1)，浓度为106cfu/ml。分别参照下述方法计算发病率。
将根腐病病害分为6级，其中0级为根系未发病；1级为根系发病率≤30％，叶片正常；2级为30％<根系发病率≤60％，叶片正常；3级为60％<根系发病率≤80％，叶片变黄；4级为根系发病率80％以上，叶片枯萎；5级为整株死亡，叶片干枯。
发病率(％)＝∑(病害级别×该级别植株数)/(总株数×病害最高级值)×100
具体实验结果见表2：
表2菌剂盆栽拮抗效果
编号 处理 发病率
对照组1 不添加菌液 3％
对照组2 病原菌(拟盘多毛孢和镰刀菌)孢子悬液 85％
实验组1 解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17843) 5％
实验组2 外购解淀粉芽孢杆菌(W1) 27％
实验组3 外购解淀粉芽孢杆菌(W2) 45％
实验组4 外购解淀粉芽孢杆菌(W3) 40％
实验组5 胶质芽孢杆菌(W4) 36％
实验组6 枯草芽孢杆菌(W5) 65％
实验组7 枯草芽孢杆菌(W6) 68％
结果表明，在灭菌土壤中，本发明所述的微生物菌剂对两种病原菌的草莓根腐病防效明显，其发病率仅为5％，相较外购的解淀粉芽孢杆菌27％～45％，以及胶质芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的发病率，病情指数显著降低。
实施例4制备解淀粉芽孢杆菌菌剂
本发明所述的解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17843)，其菌剂制备方法可以采用以下步骤：
将解淀粉芽孢杆菌接种至1000ml LB液体摇瓶中扩繁，制备种子液，之后将种子液转移至10L的液体发酵罐中，接种量为9％，pH7.0，转速160rpm，30℃发酵2天，后喷雾干燥。其有效活菌数为1×1011CFU/g。
液体发酵培养基A的配方按重量组分计：蛋白胨10g，硫酸铵2.5g，牛肉浸出粉3g,氯化钠5g，磷酸氢二钾2g，聚乙烯醇5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2。
将所制备的解淀粉芽孢杆菌菌剂进行田间抗病效果的验证，试验于山东省临沂市进行，包括：
选取1个草莓大棚，共2亩，分别设置对照组1、对照组2、实验组，对照组1不使用菌剂，对照组2施用市场采购菌剂，试验组使用上述制备的解淀粉芽孢杆菌菌剂。其他田间管理相同。具体实验结果见表3，其中鲜重(g/株)代表草莓植株的重量；结果数(个/株)代表每株植株上所结的草莓的个数；产量(g/株)代表草莓果实的重量；甜度(％)通过糖度仪检测获得。需要说明的是，以下各实施例中鲜重、结果数、产量、甜度等均与该实施例具有相同的含义以及相同的计算方式。
表3草莓大棚试验结果
Figure GDA0002426543870000111
使用本发明所述的解淀粉芽孢杆菌菌剂，与对照相比，草莓植株生理指标均有提升，果实饱满，畸形果少，味甜、口感好，发病率仅为9％，与外购市场菌剂相比发病率有了明显降低，甜度与外购市场菌剂相比也有了明显增加。
实施例5解淀粉芽孢杆菌在制备复合菌剂中的应用
本实施例提供了一些复合菌剂，所提供的复合菌剂通过将不同的菌剂按照一定的比例混合获得的。可将解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17843菌剂与胶质芽孢杆菌菌剂、绿色木霉菌剂、土曲霉菌剂的至少之一按照1～3：1-3的质量比例进行掺混，优选地，可将解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17843菌剂与胶质芽孢杆菌菌剂、绿色木霉菌剂、土曲霉菌剂的至少之一按照1～1.5：1～1.5的质量比例进行掺混，其制备方法可以采用以下步骤：
1、分别制备解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17843)菌剂与胶质芽孢杆菌菌剂。
将解淀粉芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌分别接种至100ml LB液体摇瓶中单独发酵，温度为30℃，pH6.8，转速140rpm，培养18小时。随后转接到固体发酵培养基A上，接种量为8％，30℃发酵7天，固体发酵培养基A的配方按重量组分计为麦麸：豆粕：硫酸镁：氯化钠＝4:1:0.1:0.1，含水量55％。
发酵产物进行烘干粉碎，获得粉末状的解淀粉芽孢杆菌菌剂和胶质芽孢杆菌菌剂，其中每克解淀粉芽孢杆菌菌剂中含有解淀粉芽孢杆菌有效活菌数为4×1011CFU，每克胶质芽孢杆菌菌剂中含有胶质芽孢杆菌的有效活菌数为1×1011。
2、制备绿色木霉菌剂、土曲霉菌剂。
将土曲霉、绿色木霉分别在100ml PDA液体摇瓶中单独发酵，温度为27℃，转速120rpm，培养28小时得到菌丝球。随后将菌丝球分别接种到固体发酵培养基B上，接种量为8％，30℃发酵，光照24小时后黑暗培养24小时，连续发酵9天，分别得到土曲霉和绿色木霉的发酵产物。其中固体发酵培养基B的配方按重量组分计为麦麸：玉米淀粉：大米碎渣：小米：秸秆渣＝2:1.5:1:1:0.5，含水量60％。
发酵产物进行烘干粉碎，获得粉末状的土曲霉菌剂和绿色木霉菌剂。其中每克土曲霉菌剂中含有土曲霉的有效活菌数分别为5×1010/g，每克绿色木霉菌剂中含有绿色木霉的有效活菌数为4×1010。
3、将制备好的解淀粉芽孢杆菌菌剂、胶质芽孢杆菌菌剂、绿色木霉菌剂、土曲霉菌剂按照表4的复配比例进行掺混，即得到复合菌剂。
表4复合菌剂实例
Figure GDA0002426543870000121
Figure GDA0002426543870000131
对上述制备的复合菌剂的田间抗病效果进行验证，试验于山东省临沂市进行，具体如下：
选取5个草莓大棚，共10亩，分别设置对照组1、对照组2、实验组，对照组1不使用菌剂，仅进行常规施肥，对照组2除了进行常规施肥之外，还施用市场采购的复合菌剂，各实验组除了进行常规施肥之外，还施用上述制备的复合菌剂。其他田间管理相同。其结果如下表5所示：
表5草莓大棚试验结果
Figure GDA0002426543870000132
Figure GDA0002426543870000141
从表5可以看出，使用本发明所述的微生物复合菌剂，与对照相比，草莓植株生理指标均有提升，果实饱满，畸形果少，味甜、口感好，发病率为10％以下，与外购市场菌剂相比发病率明显降低，甜度与市场菌剂相比普遍增加。
实施例6肥料
实施例6提供了一种肥料，包括生物有机肥和复合菌剂，通过以下步骤制备：
1、按照实施例5的方法制备复合菌剂。
2、按照发酵牛粪含量为40％，炭基肥含量为30％，小分子有机料含量为20％，硅酸钙含量为10％，称取不同物料，获得生物有机肥。掺混后均匀加入占生物有机肥含量1-5‰由步骤1得到的复合菌剂，得到生物有机肥。下表6中列出了应用不同的生物有机肥制备的肥料示例，为了同下面实施例7中所制备的肥料区分，该实施例所制备的肥料以生物有机肥编号命名。
表6生物有机肥实例
Figure GDA0002426543870000142
Figure GDA0002426543870000151
对所制备的肥料进行田间促生及抗病效果的验证，试验于山东省临沂市莒南县道口镇进行，包括如下步骤：
选取1个草莓大棚，共2亩，分别设置空白对照组和对照组，其中空白对照组中所使用的肥料中与各实验组相比不含有菌剂，对照组使用市场采购菌剂替代上述复合菌剂制备微生物肥料使用。各实验组使用上述制备的各微生物肥料，其他田间管理相同。结果如下表7所示。
表7实验结果
Figure GDA0002426543870000152
Figure GDA0002426543870000161
实施例7解淀粉芽孢杆菌在制备肥料中的应用
本发明所述的复合菌剂，可以在有机复合肥、有机无机复混肥、无机复合肥造粒后，在包膜工段添加，制备成肥料。具体本实施例提供了如下肥料：
分别将实施例5中制备的复合菌剂在有机复合肥、有机无机复混肥、无机复合肥包膜工段与防结粉混合均匀后按照1-5‰添加，待稳定生产后所得相应的肥料。如表8、表9所示。为了便于区分，表8～表11中所制备的肥料以相应的基础肥料命名。
其中，表8中所用到的有机无机复混肥为有机无机复混肥15-40(16-12-12/S)其中15-40指的是有机肥和无机肥的比例，16-12-12/S指的是氮磷钾的比例)，表9中所用到的无机复合肥为15-15-15(指氮磷钾的含量分别为15％，15％，15％)。
表8菌剂与有机无机复混肥混合实例
Figure GDA0002426543870000171
Figure GDA0002426543870000181
表9菌剂与无机复合肥混合实例
Figure GDA0002426543870000182
Figure GDA0002426543870000191
将所制备的肥料进行田间效果的验证，实验在山东莒南县道口镇草莓棚试验区域进行，包括：
棚内设3个处理，每个处理3小区，每个小区66.6平方米，肥料施用量为120Kg/亩。对照组1为常规施肥，对照组2为施用市场购买的微生物菌肥，其他试验组为施用上述肥料。其具体效果表现见表10、表11。
表10有机无机复混肥草莓大棚田间试验结果
Figure GDA0002426543870000192
Figure GDA0002426543870000201
表11无机复合肥草莓大棚田间试验结果
Figure GDA0002426543870000202
Figure GDA0002426543870000211
上述结果表明，使用本发明所述的肥料，与对照相比，草莓植株生理指标均有显著提升，且草莓根腐病的田间发病率显著降低。
本文中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 中化农业（临沂）研发中心有限公司
<120> 解淀粉芽孢杆菌CGMCC No. 17843及其应用
<130> PIDC3194245
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 564
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 解淀粉芽孢杆菌
<400> 1
acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga 60
tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc 120
cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt 180
ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg 240
ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag 300
acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc 360
tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg 420
gaagaacaag tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg 480
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt 540
gggcgtaaag ggctcgcagg cggt 564

Claims (13)

1.一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 17843。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包括权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为干粉状，每克所述微生物菌剂中含有所述解淀粉芽孢杆菌的有效活菌数至少为1×1011 CFU。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，每克所述微生物菌剂中含有所述解淀粉芽孢杆菌的有效活菌数为4×1011 CFU。
5.一种复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括第一微生物菌剂和不同于所述第一微生物菌剂的第二微生物菌剂，所述第一微生物菌剂为权利要求2-4任一项所述的微生物菌剂；
所述第二微生物菌剂包括选自胶质芽孢杆菌菌剂、绿色木霉菌剂、土曲霉菌剂中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括1~3重量份的所述第一微生物菌剂，以及选自下列第二微生物菌剂中的至少一种：
1~3重量份的所述胶质芽孢杆菌菌剂；
1~3重量份的所述绿色木霉菌剂；
1~3重量份的所述土曲霉菌剂。
7.根据权利要求5所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括1~1.5重量份的所述第一微生物菌剂，以及选自下列第二微生物菌剂中的至少一种：
1~1.5重量份的所述胶质芽孢杆菌菌剂；
1~1.5重量份的所述绿色木霉菌剂；
1~1.5重量份的所述土曲霉菌剂。
8.一种肥料，其特征在于，所述肥料包括权利要求2-4任一项所述的微生物菌剂或者权利要求5-7任一项所述的复合菌剂。
9.根据权利要求8所述肥料，其特征在于，所述肥料进一步包括基础肥料，所述基础肥料包括选自生物有机肥、无机复合肥、有机复合肥或者有机无机复混肥中的至少一种，所述微生物菌剂或者所述复合菌剂的含量为所述基础肥料含量的1‰~5‰。
10.根据权利要求9所述的肥料，其特征在于，所述生物有机肥包括30~50重量份的发酵牛粪、20~40重量份的炭基肥、10~30重量份的小分子有机料和5~15重量份的硅酸钙。
11.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在制备微生物菌剂、复合菌剂或者肥料中的应用。
12.一种防治根腐病的方法，其特征在于，包括：
对植物施用有效量的解淀粉芽孢杆菌，微生物菌剂，复合菌剂或者肥料，其中所述解淀粉芽孢杆菌为权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，所述微生物菌剂为权利要求2-4任一项所述的微生物菌剂，所述复合菌剂为权利要求5-7任一项所述的复合菌剂，所述肥料为权利要求8-10任一项所述的肥料；所述根腐病为拟盘多毛孢和/或镰刀菌引起的根腐病。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述植物为草莓。
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