CN104894010B - 一种拮抗土传真菌病害的复合微生物肥料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种拮抗土传真菌病害的复合微生物肥料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种拮抗土传真菌病害的复合微生物肥料及其制备方法和应用，所述肥料以腐殖酸为复配载体，包括含菌量为1.8×108~2.1×108 CFU/g的解淀粉芽孢杆菌HFJ‑7，还包括巨大芽孢杆菌B3。该复合微生物肥料中解淀粉芽孢杆菌HFJ‑7的保藏号是CGMCC No. 10011。解淀粉芽孢杆菌HFJ‑7菌株可拮抗立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉病原菌等多种土传病害病原真菌。解淀粉芽孢杆菌HFJ‑7与巨大芽孢杆菌B3复配后可显著提高对立枯丝核菌、辣椒根腐病病原菌的抗性，还可显著降低辣椒苗根腐病病情指数，可有效的预防及控制辣椒根腐病的发生及蔓延。

Description

一种拮抗土传真菌病害的复合微生物肥料及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物肥料领域，涉及复合微生物肥的制备与应用，具体涉及一种拮抗土传真菌病害的复合微生物肥料及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，以细菌防治植物病害取得了较大的进展。美国报道，用草生欧氏杆菌防治梨火疫病效果与链霉素相当。沈阳农业大学生物农药工程中心利用拮抗木霉和拮抗细菌混合发酵制成粉剂，成功地防治了保护地蔬菜和甜瓜的苗期病害，该项产品正处于中试阶段。其他报道的细菌杀菌剂还有：用来防治黄瓜及烟草炭疽病菌的地衣芽孢杆菌，防治甘蓝黑腐病的枯草芽孢杆菌, 以及防治水稻纹枯病的假单孢菌等。由于细菌的种类多、数量大、繁殖速度快，且易于人工培养和控制，因此，细菌杀菌剂的研究和开发具有较大的前景。用于生防的细菌以芽孢杆菌为主，主要有枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和短小芽孢杆菌等。由于芽孢杆菌具有抑制植物病害的能力，又是自然界中广泛存在的非致病细菌，对人畜无害，不污染环境, 因而备受关注。
解淀粉芽孢杆菌属于芽孢杆菌，多以芽抱形态广泛存在于各种自然环境中，可分泌生物素等抗性物质，对多种病原真菌等具有抗性。菌肥的应用与菌株的选择密切相关，分离筛选时具有多种病原真菌拮抗性的菌株，在实际农业生产中，往往表现出较强的防病抗病能力。然后，微生物复合肥料产品多采用两种或多种菌的组合，旨在综合多种菌的作用，互为补充，但菌与菌复配的前提是不能产生拮抗作用。本发明所述的一种拮抗土传真菌病害的复合微生物肥料，选用分离自辣椒根际土的芽孢杆菌HFJ-7，具有一定的原生特性，该菌经生理生化与分子鉴定后确定为解淀粉芽孢杆菌，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCC No.10011。该菌株筛选自辣椒根际土，可拮抗立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉病原菌等多种病原真菌，且与巨大芽孢杆菌无菌间拮抗作用，可以进行复配，并经过多批次不同规模的试验，验证了其防治病原真菌的效果，并确定了一种拮抗土传真菌病害的复合微生物肥料，可显著降低辣椒苗根腐病病情指数。
发明内容
本发明提供了一种拮抗土传真菌病害的复合微生物肥料及其制备方法和应用，所述解淀粉芽孢杆菌菌肥为新型复合微生物肥料，可显著降低辣椒苗根腐病病情指数，16d内仍具有较好的防病效果，防病率达55.02%。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种拮抗土传真菌病害的复合微生物肥料，它以腐殖酸为复配载体，还包括以下组分：含菌量为1.8×108~2.1×108 CFU/g的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7和含菌量为6.0×107~6.9×107 CFU/g巨大芽孢杆菌；所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的分类命名为解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.10011。
所述巨大芽孢杆菌选用巨大芽孢杆菌B3菌粉。
所述复合微生物肥料中各组分的复配质量比例为：解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的菌粉：巨大芽孢杆菌B3的菌粉：腐殖酸=0.9~1 : 2~2.3 : 1000。
本发明还提供了所述的拮抗土传真菌病害的复合微生物肥料的制备方法，它包括以下步骤：
（1）将解淀粉芽孢杆菌HFJ-7接种到装有种子培养基的灭菌种子罐中，37℃培养10h，形成种子培养液，所述种子培养基组分包括：糖蜜，24.5~25.0 g/L；蛋白胨，13.5~13.7g/L；磷酸二氢钾，1.7~1.8 g/L；柠檬酸钠，1.5~1.6 g/L；硝酸铵，1.5~1.6 g/L；硫酸镁，0.5~0.52 g/L；调节起始pH 至7.2；
（2）将所述种子培养液转接至装有发酵培养基的生产罐中进行发酵培养，37℃培养24h，当孢子率超过95%时，停罐，获得发酵液，所述发酵培养基组成包括：豆粕粉，25.0~25.5 g/L；玉米浆干粉，18.5~19.4 g/L；氯化钠，4.0~4.2 g/L；磷酸二氢钠，2.8~2.9 g/L；磷酸氢二钾，1.2~1.3 g/L；氯化镁，0.55~0.58 g/L；硫酸锰，0.15~0.16 g/L；中性蛋白酶，2.0~2.1 g/L；糖化酶，1.5~1.6 g/L；消泡剂，1.3~1.4 g/L；调节起始pH 至 7.4，所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7发酵液的菌量达到450×108 CFU/g~500×108 CFU/g；
（3）将所述发酵液添加载体后进行喷雾干燥，获得含菌量2000×108 ~2200×108CFU/g的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉，所述载体为轻质碳酸钙，添加载体的量占所述发酵液的质量比为10%-15%；
（4）选择含菌量为300×108~330×108 CFU/g的巨大芽孢杆菌B3菌粉，按照各组分的质量比解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉：巨大芽孢杆菌B3菌粉：腐殖酸=0.9~1 : 2~2.3 :1000；混合均匀，最终控制复合微生物肥料中解淀粉芽孢杆菌HFJ-7含菌量1.8×108~2.1×108 CFU/g，巨大芽孢杆菌B3含菌量6.0×107~6.9×107 CFU/g。
所述喷雾干燥的进风温度为145℃-150℃，出风温度为65℃-70℃。
本发明还提供了所述的复合微生物肥料在制备拮抗土传真菌病害的肥料中的应用。
对上述技术方案的进一步改进：所述复合微生物肥中解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌株能拮抗土传病害病原真菌中的立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌和辣椒疫霉病原菌。
对上述技术方案的进一步改进：所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌株对黄瓜枯萎病病原菌的抗性最强。
对上述技术方案的进一步改进：所述复合微生物肥料中解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与巨大芽孢杆菌B3按照含菌量3:1的比例复配能显著提高对立枯丝核菌、辣椒根腐病病原菌的抗性。
对上述技术方案的进一步改进：所述复合微生物肥中解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌株与巨大芽孢杆菌B3复配能显著降低辣椒苗根腐病病情指数，16d内仍具有较好的防病效果。
与现有技术相比，本发明方法的优点和技术效果是：
1、本发明所述拮抗土传真菌病害的复合微生物肥料，采用分离筛选的解淀粉芽孢杆菌菌株，分离自辣椒根际土，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.10011，可应用于辣椒生产，具有较强的原位增强效应与仿生菌株效果。
2、本发明所述拮抗土传真菌病害的复合微生物肥料，主要组分解淀粉芽孢杆菌菌肥菌株HFJ-7，可拮抗立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉病原菌等多种土传病害病原真菌，且具有较好的发酵潜力，其发酵液中菌体是主要真菌抗性组分。
3、本发明所述拮抗土传真菌病害的复合微生物肥料，是由无菌间拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌菌肥菌株HFJ-7与巨大芽孢杆菌B3复配组成，复配后显著提高了对立枯丝核菌与根腐病病原菌的拮抗效果，且在降低辣椒苗根腐病病情指数方面，效果较好，对辣椒根腐病的防治效果也较强。按照含菌量3:1比例将两种菌粉复配为复合微生物肥，可显著降低辣椒苗根腐病病情指数，16d内仍具有较好的防病效果，防病率达55.02%。将复合微生物肥，源于辣椒，用于辣椒，具有较好的原位应用效果与市场开发前景。
结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他优点将变得更加清楚。
附图说明
图1表明解淀粉芽孢杆菌HFJ-7对多种土传病害病原真菌的拮抗特性；
图2表明解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与其他三株芽孢杆菌的对比生长曲线；
图3是解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉的生产工艺流程图；
图4表明解淀粉芽孢杆菌HFJ-7不同组分对多种土传病原真菌的抑制效果；
图5表明解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与其他芽孢杆菌菌株间的交叉拮抗特性；
图6展示了解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与巨大芽孢杆菌B3单独与复合后对两种病原真菌的抑制效果；
图7表明本发明所述复合微生物肥与解淀粉或巨大芽孢杆菌菌肥相比对辣椒苗根腐病病情指数的影响；
图8表明本发明所述复合微生物肥与解淀粉或巨大芽孢杆菌菌肥相比对辣椒苗根腐病防治效果的影响。
具体实施方式
为更好地了解该拮抗土传真菌病害的复合微生物肥料的功能，下面结合附图和具体实施例对本发明的产品引用特点做进一步详细的说明。
实施例1、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的分离筛选与鉴定保藏
一、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的分离筛选
2012年1月至2012年3月，从山东省潍坊市寿光市上口镇10家辣椒蔬菜大棚取30个辣椒根际土样本。土样分别充分研磨，于75℃水浴内加热处理20min，然后用无菌生理盐水中1000倍稀释，于营养琼脂NA平板上稀释涂布，挑取单菌落划线纯化，共筛选出68株纯菌，经镜检均为芽孢杆菌，其中包括菌株HFJ-7。
二、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与其他菌株的病原真菌抗性能力比较
采用平板对峙的方法，以立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉等土传病害病原真菌为靶标病原真菌，考察68株芽孢杆菌之间病原真菌拮抗特性的差异。先用打孔器获得6mm直径的病原菌菌块，接于PDA平板中央，在平皿四周，垂直据中心约3cm出，接种靶标菌菌线，长度约为1cm。考虑到不同病原真菌生长速度不同，立枯丝核菌预培养8h、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉病原菌预培养24h，然后每平皿接种4株待试菌株，28℃培养4d后，考察解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与其他芽孢杆菌相比，对多种土传病害病原真菌的拮抗特性。记录抑菌带宽度，即两种菌平行生长之间的无菌区域宽度。根据拮抗带的宽窄，选取对病原真菌有较强拮抗能力的菌株。
筛选结果显示，15株菌对立枯丝核菌有较强拮抗作用，13株菌对尖孢镰刀菌有较强拮抗作用，10株菌对根腐菌有较强拮抗作用，9株菌对黄瓜枯萎病病原菌有较强拮抗作用，7株菌对辣椒疫霉病原菌有较强拮抗作用。仅有4株菌同时对5种病原真菌靶标菌均具有拮抗作用，分别为：解淀粉芽孢杆菌HFJ-7、枯草芽孢杆菌G4和G11、地衣芽孢杆菌D2。其中，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与枯草、地衣、侧孢等芽孢杆菌相比，可对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉病原菌等多种土传病害病原真菌，产生明显的抑菌带，均大于等于5mm，其中对黄瓜枯萎病病原菌的抗性最强，抑菌带宽度高达8mm。
三、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的生理理化与分子遗传学分类鉴定
分别采用生理生化法语分子遗传学方法，对解淀粉芽孢杆菌HFJ-7进行鉴定。
经细菌生理生化方法初步鉴定，菌株HFJ-7为芽孢杆菌属，其生物学特性：革兰氏染色阳性，在营养琼脂平板上形成的菌落直径约3-3.5mm，边缘不整齐，中间褶皱，淡黄色。菌体形态呈杆状，芽孢椭圆形，端生，0.84×0.52μm。
接着采用分子遗传学方法，对菌株芽孢杆菌HFJ-7进一步分类鉴定。首先提取菌株HFJ-7的DNA，以该DNA为模板，16S rRNA通用引物为引物，对16S rRNA片段进行扩增，扩增片段进行序列测定。测序结果用Blast软件与GenBank中相关属种的16S rRNA序列进行比对，结果显示该菌株16S rRNA序列与GenBank基因库中芽孢杆菌属中的Bacillus pumilus的16s rRNA序列同源度最高，同源率达到99%。通过DNAMAN6.0对Genbank中已有的芽孢杆菌属的16S rRNA序列进行遗传进化分析，结果显示，菌株S3 16S rRNA与Bacillus amyloliquefaciens同源性最高，判定该菌株为芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌。
将筛选到的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2014年11月19日；解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens的保藏编号为CGMCC No. 10011。
实施例2、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7具有拮抗多种病原真菌的特性
采用平板对峙的方法，以立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉等土传病害病原真菌为靶标病原真菌，考察不同芽孢杆菌之间拮抗特性的差异。先用打孔器获得6mm直径的病原菌菌块，接于PDA平板中央，在平皿四周，垂直据中心约3cm出，接种靶标菌菌线，长度约为1cm。考虑到不同病原真菌生长速度不同，立枯丝核菌预培养8h、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉病原菌预培养24h，然后接种拮抗细菌，包括解淀粉芽孢杆菌HFJ-7，地衣芽孢杆菌D2、D5、D8，枯草芽孢杆菌G1、G4、G7、G11，侧孢芽孢杆菌M9等，每板接4个细菌，28℃培养4d后，考察解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与其他芽孢杆菌相比，对多种土传病害病原真菌的拮抗特性。记录抑菌带宽度，即两种菌平行生长之间的无菌区域宽度。
图1展示了解淀粉芽孢杆菌HFJ-7对多种土传病害病原真菌的拮抗特性，其中a-1图表示在解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的四面接种的拮抗下，病原真菌立枯丝核菌的生长受到明显抑制。a-2图表示，与枯草芽孢杆菌G4、地衣芽孢杆菌D5、侧孢芽孢杆菌M9相比，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7具有更强立枯丝核菌拮抗效果；b图表示与枯草芽孢杆菌G1、G11、地衣芽孢杆菌D2等相比，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7能更好地拮抗靶标病原菌-尖孢镰刀菌菌，且抑菌带宽度为6mm；c图表示与枯草芽孢杆菌G7、地衣芽孢杆菌D8相比，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7能更好地拮抗靶标病原菌-根腐病病原菌，且抑菌带宽度为5mm；d图表示与地衣芽孢杆菌D8相比，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7能更好地拮抗靶标病原菌-黄瓜枯萎病病原菌，且抑菌带宽度为8mm；e图表示与枯草芽孢杆菌G4相比，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7能更好地拮抗靶标病原菌-辣椒疫霉，且抑菌带宽度为6mm。系列对比拮抗试验结果显示，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与枯草、地衣、侧孢等芽孢杆菌相比，可对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉病原菌等多种土传病害病原真菌，产生明显的抑菌带，均大于等于5mm，其中对黄瓜枯萎病病原菌的抗性最强，抑菌带宽度可达8mm。
实施例3、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7具有较强的液体发酵增殖能力
分别挑取枯草芽孢杆菌G4、侧孢芽孢杆菌M9、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与HFJ-8的单菌落，接种于含有5ml 灭菌LB液体培养基的试管内，37℃，160 rpm/min，震荡培养12h；以1%比例，转接于含有130ml LB液体培养基的500ml锥形瓶中，37℃，180 rpm/min震荡培养18h，采用恒平722可见分光光度计，采用比色法，跟踪监测OD 660nm；取样时间分别为0、2、4、6、8、10、12、15、18h。每试验组每个时间点3个重复。
图2展示了解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与其他三株芽孢杆菌的对比生长曲线。结果显示，在LB培养基内，几种芽孢杆菌的生长繁殖能力由强到弱的顺序依次为：解淀粉芽孢杆菌HFJ-7、解淀粉芽孢杆菌HFJ-8、枯草芽孢杆菌G4、侧孢芽孢杆菌M9。解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的对数增殖期为8-12h，倍增时间为2.5h。相较其他芽孢杆菌而言，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7有较强的发酵潜力，便于进行大生产。
实施例4、拮抗土传真菌病害的复合微生物肥的制备
本发明所述拮抗土传真菌病害的复合微生物肥料以腐殖酸为复配载体，还包括含菌量为1.8×108~2.1×108 CFU/g的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7，含菌量为6.0×107~6.9×107 CFU/g巨大芽孢杆菌B3。本发明所述解淀粉芽孢杆菌菌粉是由自主分离筛选的菌株解淀粉芽孢杆菌HFJ-7发酵后喷雾而成，其生产工艺流程图如图3所示。
本发明所述拮抗土传真菌病害的复合微生物肥的制备方法具体包括以下步骤：
（1）种子罐培养
所述的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌株，以NA培养基进行划线培养，37℃培养24h，保证孢子率>99%的，作为一级种子。将一级种子，接种到装有种子培养基的灭菌种子罐中，37℃培养10h，形成大量营养体，作为二级种子培养液；活化为100%孢子率的种子后，接种到装有种子培养基的灭菌种子罐中，37℃培养10h，形成大量营养体，作为种子培养液。种子培养基组成（g/L）：糖蜜，24.5；蛋白胨，13.5；磷酸二氢钾，1.7；柠檬酸钠，1.5；硝酸铵，1.5；硫酸镁，0.5；用50%氢氧化钠流加，调节起始pH 至7.2；种子罐体积为500L，培养基定容至300L，实消条件：恒温121℃保持30min；培养条件：恒温37℃+1℃，罐压0.05Mpa，转速0-6h130rpm、6-10h 160rpm；通风量0-6h 5.1 m3/h、6-10h 8.8 m3/h。
（2）发酵罐培养
将种子罐中种子培养液转接至装有发酵培养基的30吨生产罐进行发酵培养，37℃培养24h，当孢子率超过95%时，停罐，获得发酵液。发酵培养基组成（g/L）：豆粕粉，25.0；玉米浆干粉，18.5；氯化钠，4.0；磷酸二氢钠，2.8；磷酸氢二钾，1.2；氯化镁，0.55；硫酸锰，0.15；中性蛋白酶，2.0；糖化酶，1.5；消泡剂，1.3；用50%氢氧化钠流加，调节起始pH 至7.4；种子罐体积为30000L，培养基定容至21000L，实消条件：恒温116℃保持30min；培养条件：恒温37℃+1℃，罐压0.05Mpa，转速0-10h 140rpm、10-18h 180rpm、18-24h 160rpm；通风量0-10h 165m3/h、10-18h 215m3/h、18-24h 180m3/h。所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7发酵液在放罐时的菌量一般达到450×108 CFU/g~500×108 CFU/g。
（3）将发酵液与载体混合进行后处理，获得解淀粉芽孢杆菌菌菌粉。
所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7后处理过程：喷雾干燥塔，LPG-6000型，进风温度为145℃-150℃，出风温度为65℃-70℃，载体为轻质碳酸钙，添加载体占发酵液的质量比例为：10%-15%。所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7筛分与质检过程：超过90%菌粉均过80目筛，并参考国标GBT 26428-2010饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测，测定解淀粉芽孢杆菌菌量，质检合格，制备为解淀粉芽孢杆菌菌粉。所述解淀粉芽孢杆菌HJF-7菌粉中含菌量范围2000×108 ~2200×108 CFU/g。
（4）解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与巨大芽孢杆菌B3的复配。
选择市售巨大芽孢杆菌B3菌粉，其含菌量为300×108~330×108 CFU/g。按照各组分的质量比复配菌粉， 解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉：巨大芽孢杆菌B3菌粉：腐殖酸=0.9~1 :2~2.3 : 1000，采用SLHSJ双轴桨叶式高效混合机，混合18min~20min，保证均匀度，最终控制复合微生物肥料中解淀粉芽孢杆菌HFJ-7含菌量1.8×108~2.1×108 CFU/g和巨大芽孢杆菌B3含菌量6.0×107~6.9×107 CFU/g。
实施例5、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7发酵液不同组分对多种土传病原真菌的抑制效果
对照组：灭菌水；试验组：解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的发酵液、菌体和上清液；菌体与上清液制备过程：4000rpm，离心20min，转移上清，用等体积灭菌水重新悬浮菌体，混匀，备用；土传病害真菌作为试验靶标菌：立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉病原菌；鉴于本次试验比较对象既有菌，又有发酵液上清等代谢物质，公平期间，选用土壤浸出液培养基，该培养基各方面性质接近土壤，可在平皿体系内模拟土壤环境，细菌、真菌都能生长；土壤浸出液培养基制作方法： 1000g平度蔬菜大棚土壤，加1000ml水，于200rpm，18℃，震摇48h，使土壤养分等充分浸出；4000rpm，离心10min，过滤除去杂质，获取暗黄色土壤浸出液，均匀清澈；添加2%琼脂法，煮沸三次，配成土壤浸出液培养基。
试验基本过程：在18*180试管内，加入15ml土壤浸出液培养基，加软胶塞，灭菌；放置于70℃水浴内；冷却后在每管内加入1ml对照组与试验组液体，颠倒试管，混匀培养基与发酵液组分，然后倾注于灭菌空平皿内；待培养基冷却后，用灭菌打孔器在真菌平板上打孔，然后用镊子将各个真菌菌块(8mm)接种于培养基中央，最初正放，一天后倒置培养，25℃培养5d，观察并统计真菌菌丝生长直径，计算抑制率；真菌抑制率：抑菌率=100%*（D对照-D试验）/ D对照。综合用于Excel与SPSS 17.0进行数据分析。
图4展示了解淀粉芽孢杆菌HFJ-7不同组分对多种土传病原真菌的抑制效果。结果显示，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7对多种土传病害病原真菌均有抑制作用，尤其是其发酵液与菌体对尖孢镰刀菌的抑制作用，真菌抑制率均可达97%。综合解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的的发酵液与菌体对各种土传病害病原真菌的真菌抑制率数据，可知发酵液与菌体的病原菌抑制效果无显著差异（p>0.05）发酵液效果略强，两者都显著强于上清液的抑菌效果（p<0.05）。因此，在解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的后处理模式，会首选保持发酵液各组分的喷雾干燥模式，以保证其在施用于土壤中后，能有较好的抑制病原真菌的效果。
实施例6、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与其他芽孢杆菌菌株间的交叉拮抗特性
采用营养琼脂培养基，在同一个平皿上交叉划线，长度约为1cm，考察解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与其他菌株间交叉接触部位的菌落生长情况，以确定菌株间的交叉拮抗特性。试验菌株分别为枯草芽孢杆菌G4、巨大芽孢杆菌B3、侧孢芽孢杆菌M9，三者均为市售菌粉的原始菌株。在营养琼脂平板上，划线纯化各个菌株，并于37℃培养箱内培养48h，充分活化。
图5展示了解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与其他芽孢杆菌菌株间的交叉拮抗特性，其中1号图表示解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与枯草芽孢杆菌G4之间交叉接触部位菌落难以生长，说明二者有较强菌间拮抗作用，不适于复配；2号图表示解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与巨大芽孢杆菌B3交叉接触部位无任何长势减弱等情况发生，说明两种菌无任何拮抗作用，可以共存或复配；3号图表示解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与侧孢芽孢杆菌M9交叉接触部位，M9的菌线略微变淡，且J7的菌线明显变细，说明两者之间有微弱拮抗作用，不适于复配。综合结果显示，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与枯草芽孢杆菌G4、侧孢芽孢杆菌M9都有拮抗作用，但与巨大芽孢杆菌B3间无拮抗现象，两种菌株可复配使用。
实施例7、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与巨大芽孢杆菌B3单独与复合后对两种病原真菌的抑制效果
对照组：灭菌水；试验组1：解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉，2.4×108 CFU/g；试验组2：巨大芽孢杆菌B3菌粉，2.4×108 CFU/g；试验组3：解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉：巨大芽孢杆菌B3菌粉=3:1（含菌量比)，即解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉1.8×108 CFU/g，巨大芽孢杆菌B3菌粉6×107 CFU/g。病原真菌靶标菌：立枯丝核菌、根腐病病原菌。选用土壤浸出液培养基作为试验培养基，其制作方法如下： 1000g平度蔬菜大棚土壤，加1000ml水，于200rpm，18℃，震摇48h，使土壤养分等充分浸出；4000rpm，离心10min，过滤除去杂质，获取暗黄色土壤浸出液，均匀清澈；添加2%琼脂法，煮沸三次，配成土壤浸出液培养基。
试验基本过程：在18*180试管内，加入15ml土壤浸出液培养基，加软胶塞，灭菌；放置于70℃水浴内；冷却后在每管内加入1ml对照组与试验组液体，颠倒试管，混匀培养基与发酵液组分，然后倾注于灭菌空平皿内；待培养基冷却后，用灭菌打孔器在真菌平板上打孔，然后用镊子将各个真菌菌块(8mm)接种于培养基中央，最初正放，一天后倒置培养，25℃培养5d，观察并统计真菌菌丝生长直径，计算抑制率；真菌抑制率：抑菌率=100%*（D对照-D试验）/ D对照。综合用于Excel与SPSS 17.0进行数据分析。
图6展示了解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与巨大芽孢杆菌B3单独与复合后对两种病原真菌的抑制效果，其中图A-0显示对照组，由水拮抗立枯丝核菌，无任何效果，病原真菌长满平皿；图A-1显示试验组1结果，即巨大芽孢杆菌B3拮抗立枯丝核菌，抑菌率可达63.12+3.15%；图A-2显示试验组2结果，即解淀粉芽孢杆菌HFJ-7拮抗立枯丝核菌，抑菌率可达76.55 +3.83%；图A-3显示试验组3结果，即解淀粉芽孢杆菌HFJ-7：巨大芽孢杆菌B3=3:1（菌量比），可拮抗立枯丝核菌，抑菌率可达78.58 + 3.92%；图B-0显示对照组，由水拮抗立枯丝核菌，无任何效果，病原真菌在平皿内逐渐蔓延；图B-1显示试验组1结果，即巨大芽孢杆菌B3拮抗根腐病病原菌，抑菌率可达53.41 + 2.66%；图B-2显示试验组2结果，即解淀粉芽孢杆菌HFJ-7拮抗根腐病病原菌，抑菌率可达93.76 + 4.68 %；图B-3显示试验组3结果，即解淀粉芽孢杆菌：巨大芽孢杆菌=3:1（菌量比），可拮抗根腐病病原菌，抑菌率可达95.38 + 4.78%；结果显示，单菌株状态下，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7对立枯丝核菌与根腐病病原菌的抑制效果要显著强于巨大芽孢杆菌B3（p<0.05），当两种菌株以解淀粉芽孢杆菌HFJ-7：巨大芽孢杆菌B3=3:1（菌量比）的配比组合后，对两种病原真菌的抑制率相对于巨大芽孢杆菌B3，也显著提高了（p<0.05），相对于解淀粉芽孢杆菌HFJ-7，也有一定程度的增加。之所以与巨大芽孢杆菌复配，同时也考虑到巨大芽孢杆菌在解磷、促生方面的优势，且前期试验也证明二者无交叉拮抗左右，促生菌与拮抗菌复配后，可有效提高菌肥在植物生产中的应用价值。
实施例8、拮抗土传真菌病害的复合微生物肥对辣椒苗根腐病的防治效果
试验地点：青岛龙力生物工业园叶菜类蔬菜大棚。供试材料：辣椒苗、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌肥，菌量2.4×108 CFU/g；巨大芽孢杆菌B3菌肥，菌量2.4×108 CFU/g；本发明所述复合微生物肥，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉：巨大芽孢杆菌B3菌粉=3:1（菌量比)，即解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉1.8×108 CFU/g，巨大芽孢杆菌B3菌粉6×107 CFU/g。所有试验组均以腐殖酸为载体。靶标真菌：辣椒根腐病病原菌。试验采用105孔的育苗穴盘进行，每盘可定植辣椒苗105棵。取1g各试验组菌肥，溶于100ml蒸馏水中，制备成0.024亿/ml的菌肥溶液。对照组用10ml蒸馏水处理后，接种辣椒根腐病原真菌菌丝液；巨大芽孢杆菌试验组用10ml 巨大芽孢杆菌菌肥液处理后，3d后接种辣椒根腐病原真菌菌丝液；解淀粉芽孢杆菌试验组用10ml 解淀粉芽孢杆菌菌肥液处理后，3d后接种辣椒根腐病原真菌菌丝液；复合微生物肥试验组用10ml 复合微生物肥液处理后，3d后接种辣椒根腐病原真菌菌丝液；第4d开始取样观察发病情况，每天观察4次记录萎焉状况。每隔两天取样检测一次发病率等指标，连续检测5次。
病情方面：统计各组病害自接种4d起每天的的发病率，病情指数，防治效果。病情分级（0-5级）：0级：根系健全，无病斑；1级：根系上有零星病斑，但不连片；2级：根部斑连片但小于根部周长的1/4；3级：根部斑大于根部周长的1/4但小于根部周长的1/2；4级：根部斑大于根部周长的1/2但小于根部周长的3/4；5级：整个根部都有斑包围，根部腐烂。统计计算：
发病率 = 处理发病株数 / 处理总株数×100%；
病情指数 =∑（各级病株数×该病级值）/（植株总数×最高级值）×100%；
防治效果 =（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%；
分级计数，计算病情指数和拮抗效果。
图7展示了本发明所述复合微生物肥与解淀粉或巨大芽孢杆菌菌肥相比对辣椒苗根腐病病情指数的影响。随着病害接种时间延长，辣椒苗的根腐病病情指数逐渐增高。与对照组相比，三个试验组都能在一定程度上控制根腐病病情的蔓延。复合微生物肥组的病情指数要低于单菌株菌肥组，而这种差异在10d后逐渐显著（p<0.05）。
图8展示了本发明所述复合微生物肥与解淀粉或巨大芽孢杆菌菌肥相比对辣椒苗根腐病防治效果的影响。在7d内，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7组与复合微生物肥组的防治效果无显著差异（p<0.05），均高于77%。随着病害接种时间延长，菌肥对辣椒苗根腐病的防治效果逐渐减弱，但复合微生物肥组的防治效果始终强于解淀粉芽孢杆菌HFJ-7组，也显著强于巨大芽孢杆菌B3组（p<0.05）。在16d严重发病时，三个试验组的防治效果依次为55.02%、34.60%、25.49%，复合微生物肥组对辣椒苗根腐病的防治效果，仍显著强于其他两个试验组（p<0.05）。
综合以上数据，复合微生物肥组能够更加有效的预防及控制辣椒根腐病的发生及蔓延，在7d时防治效果最高可达84.02%，严重发病时依然可以保证大部分辣椒苗的正常生长，有效减少因辣椒根腐病造成的减产绝产现象。
解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌株可拮抗立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉病原菌等多种土传病害病原真菌，且具有较好的发酵潜力，其发酵液中菌体是主要真菌抗性组分。解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与巨大芽孢杆菌B3之间无交叉抗性，复配后可显著提高对立枯丝核菌、辣椒根腐病病原菌的抗性，以3:1菌量比例复配为复合微生物肥，可显著降低辣椒苗根腐病病情指数，16d内仍具有较好的防病效果，防病率达55.02%，是较为理想的拮抗多种土传病原真菌的复合微生物肥。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种拮抗土传真菌病害的复合微生物肥料，其特征在于它由以下组分组成：以腐殖酸为复配载体，还包括以下组分：含菌量为1.8×108~2.1×108 CFU/g的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7和含菌量为6.0×107~6.9×107 CFU/g巨大芽孢杆菌B3；所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的分类命名为解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.10011；所述复合微生物肥料中各组分的复配质量比例为：解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉：巨大芽孢杆菌B3菌粉：腐殖酸=0.9~1 :2~2.3 : 1000。
2.权利要求1所述的拮抗土传真菌病害的复合微生物肥料的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：
（1）将解淀粉芽孢杆菌HFJ-7接种到装有种子培养基的灭菌种子罐中，37℃培养10h，形成种子培养液，所述种子培养基组分包括：糖蜜，24.5~25.0 g/L；蛋白胨，13.5~13.7 g/L；磷酸二氢钾，1.7~1.8 g/L；柠檬酸钠，1.5~1.6 g/L；硝酸铵，1.5~1.6 g/L；硫酸镁，0.5~0.52 g/L；调节起始pH 至7.2；
（2）将所述种子培养液转接至装有发酵培养基的生产罐中进行发酵培养，37℃培养24h，当孢子率超过95%时，停罐，获得发酵液，所述发酵培养基组成包括：豆粕粉，25.0~25.5g/L；玉米浆干粉，18.5~19.4 g/L；氯化钠，4.0~4.2 g/L；磷酸二氢钠，2.8~2.9 g/L；磷酸氢二钾，1.2~1.3 g/L；氯化镁，0.55~0.58 g/L；硫酸锰，0.15~0.16 g/L；中性蛋白酶，2.0~2.1g/L；糖化酶，1.5~1.6 g/L；消泡剂，1.3~1.4 g/L；调节起始pH 至 7.4，所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7发酵液的菌量达到450×108 CFU/g~500×108 CFU/g；
（3）将所述发酵液添加载体后进行喷雾干燥，获得含菌量2000×108 ~2200×108 CFU/g的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉，所述载体为轻质碳酸钙，添加载体的量占所述发酵液的质量比为10%-15%；所述喷雾干燥的进风温度为145℃-150℃，出风温度为65℃-70℃；
（4）选择含菌量为300×108~330×108 CFU/g的巨大芽孢杆菌B3菌粉，按照各组分的质量比解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉：巨大芽孢杆菌B3菌粉：腐殖酸=0.9~1 : 2~2.3 : 1000；混合均匀，最终控制复合微生物肥料中解淀粉芽孢杆菌HFJ-7含菌量1.8×108~2.1×108 CFU/g，巨大芽孢杆菌B3含菌量6.0×107~6.9×107 CFU/g。
3.权利要求1所述的复合微生物肥料在制备拮抗土传真菌病害的肥料中的应用，其特征在于：所述复合微生物肥中解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌株能拮抗土传病害病原真菌中的立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌和辣椒疫霉病原菌。
4.根据权利要求3所述的复合微生物肥料在制备拮抗土传真菌病害的肥料中的应用，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌株对黄瓜枯萎病病原菌的抗性最强。
5.根据权利要求3所述的复合微生物肥料在制备拮抗土传真菌病害的肥料中的应用，其特征在于：所述复合微生物肥料中解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与巨大芽孢杆菌B3按照含菌量3:1的比例复配能显著提高对立枯丝核菌、辣椒根腐病病原菌的抗性。
6.根据权利要求3所述的复合微生物肥料在制备拮抗土传真菌病害的肥料中的应用，其特征在于：所述复合微生物肥中解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌株与巨大芽孢杆菌B3复配能显著降低辣椒苗根腐病病情指数，16d内仍具有较好的防病效果。
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