CN113583907B - 防治果蔬土传病害的生防芽孢杆菌及其制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及防治果蔬土传病害的微生物制剂及其制备方法和应用，所述微生物为芽孢杆菌，尤其是TB918；所述微生物制剂对引起果蔬病害的病原菌辣椒疫霉、立枯丝核菌、番茄灰霉菌及瓜果腐霉菌具有优异的防效。

Description

防治果蔬土传病害的生防芽孢杆菌及其制剂
技术领域
本申请属于生物制剂领域，尤其是属于微生物制剂领域。
背景技术
土传病害是指发生在植物根部或茎部以土壤为传播媒介的侵染性病害，如：猝倒病、根腐病、青枯病、枯萎病。其危害巨大，造成果蔬品质下降，大幅减产甚至是绝收。目前，针对果蔬土传病害主要采用化学药剂进行防控，而随着化学药剂的长期使用，农药残留造成了环境污染，破坏生态平衡，威胁人类安全等严重后果。随着人们环保意识的增强，对食品安全问题的重视以及农业可持续发展的要求，高效且安全的生物防治植物病害逐渐成为植保领域研究和开发的热点。
芽孢杆菌属包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等，是一类研究和应用比较广泛的生物防治资源。因其具有良好的耐高温、耐酸、耐盐能力，对植物、人体以及环境无害，其代谢产物具有一定的杀菌、促生等作用，不引起植物的抗病性，且易于制剂化，广泛应用于农业生产中。
目前国内外芽孢杆菌制剂化主要体现在生物菌肥、复合肥、生物农药添加等方面，其制作工艺比较复杂，成本较高，不利于生防菌的推广和应用。芽孢杆菌液体菌悬剂的研究还处于瓶颈期，液体菌悬剂成分组成还处于探索阶段，菌悬剂的稳定性很难操控，开展芽孢杆菌液体菌悬剂的研究意义重大。
芽胞杆菌TB918是在辣椒根际土壤中分离获得，平板拮抗结果显示其对多种病原真菌有较好的拮抗能力。TB918液体菌悬剂，在田间应用后能迅速在蔬菜根际土壤中定殖并占据有利生态位，重塑土壤微生态结构，抑制植物病原菌，减少死苗、根腐等土传病害；合理使用该菌剂，可显著减少化学农药使用，起到提高蔬菜品质，增产稳产的效果。芽孢杆菌TB918液体菌悬剂的研制成功，不仅使芽孢杆菌制剂化工艺更加简单，节约了成本，提高了芽孢杆菌制剂化效率，更重要的是加快了优良生防芽孢杆菌菌株的推广和应用，减少化学药剂和化肥的使用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何减少化学药剂在果蔬田的应用从而提高果品蔬菜的安全性。
进一步的，本发明要解决的技术问题是如何安全高效的防治引起果蔬田真菌病害的病原真菌，尤其是辣椒疫霉菌、立枯丝核菌、番茄灰霉菌和瓜果腐霉菌。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是提供一种芽胞杆菌TB918，采用包含TB918菌的菌悬液处理病原真菌，具体包括采用包含TB918菌拮抗常见的引起果蔬病害的病原菌辣椒疫霉、立枯丝核菌、番茄灰霉菌及瓜果腐霉菌。
本发明的芽孢杆菌TB918已于2020年11月27日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号GDMCC No.61325，分类学名称为：Bacillus sp.。芽孢杆菌TB918所具有的形态、生理生化特征如下：
1.形态、培养特征
样品TB918为革兰氏阳性的杆状细菌，有芽孢，芽孢椭圆形，中生或偏端生，菌体单个或成对排列。在营养琼脂平板上培养48h，菌落呈白色，表面干燥，粗糙不透明，边缘不整齐；在营养肉汤培养基中培养48h后呈沉淀状混浊。
2.生理生化特性
Figure GDA0004053402380000021
(“+”表示为阳性反应，“-”表示为阴性反应)
更进一步的，本发明要解决的技术问题是如何制备包含TB918菌的稳定的菌悬液。
本发明提供一种TB918菌悬剂及其制备方法。为保持菌悬液的稳定，申请人经过创造性的劳动筛选出合适的助剂，申请人发现在菌悬液中添加渗透剂、防腐剂、增效剂、增稠剂和pH调节剂等助剂可有效保持菌液的稳定性，同时不影响菌液的生物活性。进一步优选的，所述渗透剂优选改性聚有机硅氧烷，防腐剂优选山梨酸钾，增效剂优选蔗糖，增稠剂优选黄原胶，pH调节剂优选硫酸铵。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1.本发明的TB918菌株对辣椒疫霉菌、立枯丝核菌、番茄灰霉菌和瓜果腐霉菌具有优异的拮抗活性，能够有效防治疫霉菌、立枯丝核菌、灰霉菌和腐霉菌引起的植物病害，尤其是水果或蔬菜上的相应病害。
2.与其它芽孢杆菌相比，TB918菌株具有更有益的抗菌活性。
3.本发明的菌液配方，尤其是渗透剂、防腐剂、增效剂、增稠剂和pH调节剂的添加，能够有效保持菌悬液的稳定性，即使保存长达90天，菌液仍没有明显变化，仍然保持生防活性，而且菌悬剂没有出现沉淀现象，稳定性好。
4.本发明的菌悬液尤其对草莓死苗具有优异的防治效果，且对草莓安全。
具体实施方式
以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
1.TB918菌株的筛选与拮抗能力测定
固体LB培养基配制：10g胰蛋白胨，10g氯化钠，5g牛肉浸膏粉，20g琼脂粉，蒸馏水定容至1升，100毫升三角瓶分装，121℃，湿热灭菌30分钟。
固体PDA培养基配制：200g土豆，20g葡萄糖，20g琼脂粉，煮沸30分钟，蒸馏水定容至1升，100毫升三角瓶分装，121℃，湿热灭菌30分钟。
采用土壤稀释法在LB培养基上分离培养芽胞杆菌：称取1克土壤放于盛有9毫升无菌水的三角瓶中，室温震荡30分钟，然后将土壤稀释液置于100℃水浴中5分钟灭活营养细胞，保留芽胞。按微生物稀释法操作，将土壤稀释液上清稀释到105-108稀释度，取最后三个稀释度，各取100微升涂布LB固体平板，30℃倒置培养24h以上，观察菌落，划线纯化备用。
采用平板对峙法测定菌株拮抗能力：以辣椒疫霉、立枯丝核菌、番茄灰霉菌及瓜果腐霉菌为靶标病原真菌，用直径5mm的打孔器取活化的病原菌菌饼转接于PDA平板中央，视病原真菌生长速度选择合适时期接种分离到的细菌。用高温灭菌的牙签蘸取之前分离到的系列芽孢杆菌细菌，等距离(距离病原菌2.5cm处)对称点接到PDA平板上，于25℃恒温培养，待对照皿中真菌菌丝即将长满皿时测量抑菌圈大小，根据抑菌圈大小筛选出对病原菌具有较强拮抗作用的菌株。
筛选得到拮抗菌TB918。平板对峙试验表明，TB918菌株对四种病原真菌的拮抗能力显著优于模式菌株芽孢杆菌3610、芽孢杆菌168以及实验室前期分离到的其它芽胞杆菌1502、1323和1260。
表1生防菌株对植物病原真菌的拮抗能力测定
Figure GDA0004053402380000041
2.TB918液体菌悬剂的制备
液体LB培养基配制：10g胰蛋白胨，10g氯化钠，5g牛肉浸膏粉，蒸馏水定容至1升，100毫升三角瓶分装，5毫升试管分装，121℃，湿热灭菌30分钟。
TB918种子液制备：LB固体平板活化菌株TB918，取活化好的单菌落接种于30毫升液体LB培养基中，160rpm，过夜培养，即为TB918种子液。
TB918发酵液制备：将制备好的种子液，1/1000接种于1升液体LB培养基中，160rpm，培养48-72h，即为制备好的TB918发酵液。
TB918菌悬剂制备：按照3％改性聚有机硅氧烷(JY1077)；0.6％山梨酸钾；4％蔗糖；0.18％黄原胶，4％硫酸铵的比例加入TB918发酵液，将混合液以200rmp/min的转速涡旋振荡充分混匀，可观察到菌悬剂不沉淀，均匀分散，即为TB918菌悬剂。放置室温保存。
不同菌株的菌悬剂的稳定性测试：
表2菌悬剂稳定性检测
Figure GDA0004053402380000042
菌悬剂稳定性检测结果显示，活菌菌落数在菌悬剂制备后3d、30d、90d，没有明显变化，仍然保持生防活性，而且菌悬剂没有出现沉淀现象，稳定性好。
3.TB918防治温室草莓死苗能力测定
草莓定植时，将上述制备好的菌悬剂，按照4-5L/亩的用量，随滴灌施入草莓根部，一个月后调查草莓死苗情况，计算防效。
相对防效(％)＝(对照病株率－处理病株率)/对照病株率×100％。
结果表明，TB918菌悬剂防治草莓死苗能力显著优于其他菌株。
表3不同菌株的菌悬剂防治草莓死苗能力测定
Figure GDA0004053402380000051
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (5)

1.一种防治果蔬土传病害的方法，其特征在于：采用芽孢杆菌作为活性成分，所述芽孢杆菌为保藏编号 GDMCC No.61325 的芽孢杆菌 TB918，其分类学名称为 Bacillus sp.，所述土传病害的病原菌为辣椒疫霉菌、立枯丝核菌、番茄灰霉菌及瓜果腐霉菌中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述芽孢杆菌采用滴灌的形式施用。
3. 一种防治果蔬土传病害的微生物制剂，其特征在于：所述微生物制剂是以芽孢杆菌为活性成分，所述芽孢杆菌为保藏编号 GDMCC No.61325 的芽孢杆菌 TB918, 其分类学名称为Bacillus sp., 所述土传病害的病原菌为辣椒疫霉、立枯丝核菌、番茄灰霉菌及瓜果腐霉菌中的一种或多种。
4. 如权利要求 3 所述的微生物制剂，其特征在于：所述微生物制剂包括芽孢杆菌、渗透剂、防腐剂、增效剂、增稠剂和 pH 调节剂。
5. 如权利要求 4 所述的微生物制剂，其特征在于：所述渗透剂选自改性聚有机硅氧烷，防腐剂选自山梨酸钾，增效剂选自蔗糖，增稠剂选自黄原胶，pH调节剂选自硫酸铵。
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