CN108283188A - 一种用于防治人参锈病的微生物菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于防治人参锈病的微生物菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于防治人参锈病的微生物菌剂及其制备方法和应用，涉及微生物技术领域，微生物菌剂的组成成分及其重量百分比为：生防菌剂0.1‑10%，腐殖酸5‑30%，蘑菇渣25‑65%，豆粉5‑30%；生防菌为枯草芽孢杆菌与甲基营养型芽孢杆菌；本发明还提供了一种用于防治人参锈病的微生物菌剂的制备方法和应用，微生物菌剂的制备包括菌种培养、种子罐发酵培养、大规模工业发酵培养、枯草芽孢杆菌菌剂与甲基营养型芽孢杆菌菌剂的制备、生防菌剂的制备与微生物菌剂的制备。本发明提供的微生物菌剂具有适应性强、稳定性好、增殖速度快及对病原菌拮抗性强等特点，且协同效果显著，应用于人参锈病的防治过程，对病原菌抑制率可达到80%以上。

Description

一种用于防治人参锈病的微生物菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种用于防治人参锈病的微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
微生物菌剂是针对作物栽培和育苗移载面积扩大，连作重茬增多，农作物病虫害日趋严重等问题，利用高新生物技术研制而成的新型生物抗病菌肥。微生物菌剂属于活菌制剂，具有活性强、代谢产物多、生防效果好、对人、畜、农作物和自然环境安全，以及不易产生抗药性等优点，广泛应用于经济作物种植、禽畜粪便腐熟、工业废弃物处理、环境改良等领域。目前市场上较为成熟的微生物农药产品，有苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等。
人参是我国名贵中药材，随着其在食品、药品、保健品等行业的广泛应用，市场需求量与日俱增，但土传病害严重制约着人参的质量和产量，影响其发展进程。人参锈病是人参生长过程中发生最普遍、危害最严重的根茎部病害之一，该病症由土壤传染的病原真菌引起，严重影响人参的质量和产量，而且在栽种过人参的土壤中发病尤为严重，连作障碍已成为人参种植中的主要障碍之一。
目前，对人参锈病的防治主要以化学防治为主，通常采用喷洒多菌灵、扑海因和杀毒矾等农药来进行防治，但这些方法多存在效果不稳定、易产生抗药性、有化学残留及污染环境等弊端，影响人参的质量和产量。因此，利用微生物菌剂对人参锈病进行防治，可在有效防治人参锈病的基础上，减少化学农药的使用，降低化学农药对土壤的污染；同时有效降低因化学农药作用而导致的病原菌抗药性的增强，保护土壤微生态系统平衡，改善人参生存环境并提高其抗病能力，对人参增产和品质提高有着重要意义。
发明内容
根据现有技术中存在的技术缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种用于防治人参锈病的微生物菌剂及其制备方法和应用，解决化学防治措施存在的效果不稳定、易产生抗药性、有化学残留、污染环境，以及影响人参的质量和产量等问题。
为了实现本发明的技术目的，本发明一种用于防治人参锈病的微生物菌剂及其制备方法和应用的技术方案是：
一种用于防治人参锈病的微生物菌剂，所述微生物菌剂的组成成分及其重量百分比为：生防菌剂0.1-10%，腐殖酸5-30%，蘑菇渣25-65%，豆粉5-30%。
作为本发明的进一步改进，所述生防菌剂的生防菌为枯草芽孢杆菌与甲基营养型芽孢杆菌。
作为本发明的进一步改进，所述微生物菌剂的制备方法包括如下步骤：
（1）菌种培养：将低温保存的所述枯草芽孢杆菌与所述甲基营养型芽孢杆菌菌株分别接种于NA固体培养基上，培养得到单菌落，挑取单菌落转接到NA斜面培养基上继续培养；挑取长势良好的单一菌落，接种至LB培养基中，振荡培养得到一级种子液；
（2）种子罐发酵培养：将步骤（1）得到的所述一级种子液，按种子罐所用培养基体积比的0.5-3％接种量分别接入种子罐，培养得到二级种子液；
（3）大规模工业发酵培养：将步骤（2）得到的所述二级种子液，按大规模工业发酵罐所用培养基体积比的5-10％接种量分别接入大规模工业发酵罐，完成发酵，得到最终生物量≥150亿/ml，芽孢形成率达98％以上的枯草芽孢杆菌发酵液与甲基营养型芽孢杆菌发酵液；
（4）枯草芽孢杆菌菌剂与甲基营养型芽孢杆菌菌剂的制备：将步骤（3）得到的所述枯草芽孢杆菌发酵液与所述甲基营养型芽孢杆菌发酵液，分别添加一定比例的可溶性淀粉为载体，搅拌均匀，直接进行喷雾干燥，得到枯草芽孢杆菌菌剂与甲基营养型芽孢杆菌菌剂；
（5）所述生防菌剂的制备：将步骤（4）得到的两种菌剂，按所述枯草芽孢杆菌菌剂与所述甲基营养型芽孢杆菌菌剂的质量比为1:0.2-5进行混合，得到所述生防菌剂；
（6）所述微生物菌剂的制备：按质量百分比，将步骤（5）得到的所述生防菌剂0.1-10%与所述腐殖酸5-30%，所述蘑菇渣25-65%，以及所述豆粉5-30%混合均匀，得到所述微生物菌剂。
作为本发明的进一步改进，所述步骤（1）中NA固体培养基的培养条件为：温度36-38℃，培养时间24-36h；NA斜面培养基的培养条件为：温度36-38℃，培养时间16-24h；LB培养基的培养条件为：转速200-260rpm/min，温度34-36℃，培养时间16-24h。
作为本发明的进一步改进，所述步骤（2）中种子罐的培养条件为：通气量0.4-1.5V／V·min，搅拌速度180-260rpm/min，温度36-38℃，培养时间18-24h。
作为本发明的进一步改进，所述步骤（3）中大规模工业发酵罐的培养条件为：通气量0.4-1.5V／V·min，搅拌速度180-260rpm/min，温度36-38℃，培养时间24-30h。
作为本发明的进一步改进，所述步骤（4）中喷雾干燥的条件为：进口温度150-200℃，出口温度50-90℃。
作为本发明的进一步改进，所述微生物菌剂在防治人参锈病中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的微生物菌剂具有生产周期短、活性高、成本低的优点，有利于工业化生产，应用的两株菌种具有适应性强、稳定性好、增殖速度快及对病原菌拮抗性强等特点，且协同效果显著，应用于人参锈病的防治过程，菌株能够稳定定植在作物的各个部位，占领病原菌的生态位，从而抑制病原菌的生长，对病原菌抑制率可达到80%以上，同时促进作物生长，增加作物产量，维护生态平衡。该微生物菌剂应用于人参锈病的防治，可在有效防治人参锈病的基础上，减少化学农药的使用，降低化学农药对土壤的污染；同时有效降低因化学农药作用而导致的病原菌抗药性的增强，保护土壤微生态系统平衡，改善人参生存环境并提高其抗病能力，对人参增产和品质提高有着重要意义。
具体实施方式
本发明提供的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,简称JQ-001菌株(已于2015年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11632)；甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus），简称JQ-018菌株(已于2015年12月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11838)。
为对本发明有益效果作进一步阐述，进行了以下具体实施例，特别说明的是，以下具体实施例旨在更好的理解本发明，绝不仅限于本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用实验材料，如无特殊说明，均为商店购买的常规生化制剂。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
人参锈病病菌：吉林省抚松县人参种植区内发病人参根茎上分离得到。
实施例中所采用的微生物菌株及菌液均为山东京青农业科技有限公司生产。
实施例1：生防菌株的筛选
活化实验室内多株生防菌，分别在适宜条件下培养；从活化的各生防菌平板上分离单菌落，将其与纯化培养的人参锈病菌进行平板对峙实验，对峙实验筛选过程及其结果如下：
在PDA培养基平板中央接入预先培养的病原菌（人参锈病菌），待生长大小合适时用直径9mm的打孔器打出菌斑，移至新的培养基平板中央，在距离病原菌菌斑2.5cm处接种菌种单菌落，每个处理重复3次，置于25℃生化培养箱中培养4-7天，观察各菌落直径，测定抑菌率，结果如表1，其中，抑菌率计算公式如下：
抑菌率(%)=（对照组直径-处理组直径）/对照菌落直径×100%。
表1 多种菌株单菌落对人参锈病菌处理的处理组直径（cm）
从表1可看出，JQ-001、JQ-018菌株对人参锈病的抑菌活性最高。继续进行菌株发酵液的拮抗实验完成菌株发酵液拮抗效果的测定，结果如表2、表3。
实施例2：菌株发酵液拮抗效果的测定
固体培养基：NA培养基、PDA培养基。
NA培养基：北京陆桥公司成品培养基，称取33g，溶于1000ml蒸馏水中，加热溶解后分瓶装，75/ml瓶，121℃灭菌30min，取出冷却后贮存备用。
PDA培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖和16g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，75/ml瓶，121℃灭菌30min，取出冷却后贮存备用。
液体LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，去离子水1000mL，pH 7.0-7.2，121℃高温灭菌30min，备用。
实验方法：平板对峙培养法
1、病原菌的制备
取已经过鉴定的人参锈病原菌，在PDA培养基中于25℃恒温培养箱中培养6天后，用打孔器取病菌板备用。
2、拮抗菌发酵液的制备
将保存在斜面上的菌种用接种环接入营养琼脂平板上划线培养，37℃恒温培养24h活化；将活化的菌株接入装有50mL LB培养基的500mL三角瓶中，在34℃、230r/min 条件下，摇床振荡培养24-26 h，制备菌种发酵液，待其完全产孢后，测定发酵液菌量。
3、发酵液的处理
将测定好菌量的发酵液分别稀释成0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.5、2亿/ml的菌量，用移液枪分别取各个浓度的菌液3ml与灭菌并冷却至45℃熔融态的PDA培养基按1:25的比例混匀，制成带菌平板，平均每板含有1ml菌液；以不接拮抗菌的培养基平板为对照。
在平板中接入预先培养的锈病病菌，用直径5mm的打孔器打出菌板，接入凝固的培养皿内，每平板均匀接种两片，每项处理重复3 次，25℃恒温箱中倒扣培养6天。
4、试验数据的处理
待对照菌丝长满板时，观察菌体长势情况并采用十字交叉法测量菌落直径，抑菌圈直径，比较不同菌量对病原菌的抑制效果，按照如下公式计算抑菌率：
抑菌率(%)=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%。
5、结果展示
表2 JQ-001菌株发酵菌液不同菌量对锈病菌的抑制率（%）
表3 JQ-018菌株发酵菌液不同菌量对锈病菌的抑制率（%）
从表2，表3可以看出，菌株在较低浓度菌量下对人参锈病亦有较好的抑制作用。
实施例3、微生物菌剂的制备和应用
一、微生物菌剂的制备
微生物菌剂的组成成分及其重量百分比为：生防菌剂10%，腐殖酸30%，蘑菇渣65%，豆粉30%。
生防菌剂的生防菌为枯草芽孢杆菌与甲基营养型芽孢杆菌。
微生物菌剂的制备方法包括如下步骤：
（1）菌种培养：将低温保存的枯草芽孢杆菌与甲基营养型芽孢杆菌菌株分别接种于NA固体培养基上，培养得到单菌落，挑取单菌落转接到NA斜面培养基上继续培养；挑取长势良好的单一菌落，接种至LB培养基中，振荡培养得到一级种子液；
（2）种子罐发酵培养：将步骤（1）得到的一级种子液，按种子罐所用培养基体积比的3％接种量分别接入种子罐，培养得到二级种子液；
（3）大规模工业发酵培养：将步骤（2）得到的二级种子液，按大规模工业发酵罐所用培养基体积比的10％接种量分别接入大规模工业发酵罐，完成发酵，得到最终生物量≥150亿/ml，芽孢形成率达98％以上的枯草芽孢杆菌发酵液与甲基营养型芽孢杆菌发酵液；
（4）枯草芽孢杆菌菌剂与甲基营养型芽孢杆菌菌剂的制备：将步骤（3）得到的枯草芽孢杆菌发酵液与甲基营养型芽孢杆菌发酵液，分别添加一定比例的可溶性淀粉为载体，搅拌均匀，直接进行喷雾干燥，得到枯草芽孢杆菌菌剂与甲基营养型芽孢杆菌菌剂；
（5）生防菌剂的制备：将步骤（4）得到的两种菌剂，按枯草芽孢杆菌菌剂与甲基营养型芽孢杆菌菌剂的质量比为1:5进行混合，得到生防菌剂；
（6）微生物菌剂的制备：按质量百分比，将步骤（5）得到的生防菌剂10%与腐殖酸30%，蘑菇渣65%，以及豆粉30%混合均匀，得到微生物菌剂。
步骤（1）中NA固体培养基的培养条件为：温度36℃，培养时间16h；NA斜面培养基的培养条件为：温度36℃，培养时间24h；LB培养基的培养条件为：转速240rpm/min，温度34℃，培养时间24h。
步骤（2）中种子罐的培养条件为：通气量1.0V／V•min，搅拌速度240rpm/min，温度38℃，培养时间18h。
步骤（3）中大规模工业发酵罐的培养条件为：通气量1.0V／V•min，搅拌速度240rpm/min，温度38℃，培养时间24h。
步骤（4）中喷雾干燥的条件为：进口温度180℃，出口温度70℃。
本发明提供的微生物菌剂具有生产周期短、活性高、成本低的优点，有利于工业化生产，应用的两株菌种具有适应性强、稳定性好、增殖速度快及对病原菌拮抗性强等特点，且协同效果显著，应用于人参锈病的防治过程，菌株能够稳定定植在作物的各个部位，占领病原菌的生态位，从而抑制病原菌的生长，对病原菌抑制率可达到80%以上，同时促进作物生长，增加作物产量，维护生态平衡。
二、微生物菌剂大田试验的应用
1、供试药剂
本发明制备的用于防治人参锈病的微生物菌剂。
2、供试作物与防治对象
供试作物：长白山抚松人参；
防治对象：人参锈病。
3、试验地点
试验地点：长白山抚松县人参种植区。
4、大田试验
①试验设计及安排
小区设置：以宽1.5m，长10m为一帘，作为一个处理。
本试验设计了微生物菌剂2kg/帘（处理一）、4kg/亩（处理二）及空白对照（处理三）共3个处理，重复4次，共12个小区，每小区面积约15m2，各小区随机排列；施肥方式为整地时表面撒施。
②试验调查及计算方法
于人参收获期，调查每组发病率并统计产量。
每组分别统计人参总数和发病棵数，计算发病率，生防率和产量，具体公式如下：
发病率=发病棵数/总数×100%；
生防率=（对照组发病率-试验组发病率）/对照组发病率×100%。
③ 试验结果
本发明制备的微生物菌剂不同施加量对人参锈病的发病率与生防率的影响结果如表4。
表4 微生物菌剂不同施加量对人参锈病的发病率与生防率的影响
从表4可以看出，该微生物菌剂对人参锈病有较好的防治效果，其中4kg/帘防治效果最好，防治效果可达到87.57%。
④小结
从人参锈病的发病率与生防率来看，本发明的微生物菌剂对人参锈病有较好的防治效果，每帘施用4kg时效果最佳，防治效果可以达到87.57%，发病率明显小于对照处理组。
以上所述，仅是本发明的较好实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实例所作的任何简单修改、变换材料等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (8)

1.一种用于防治人参锈病的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂的组成成分及其重量百分比为：生防菌剂0.1-10%，腐殖酸5-30%，蘑菇渣25-65%，豆粉5-30%。
2.根据权利要求1所述的一种用于防治人参锈病的微生物菌剂，其特征在于：所述生防菌剂的生防菌为枯草芽孢杆菌与甲基营养型芽孢杆菌。
3.根据权利要求1所述的一种用于防治人参锈病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述微生物菌剂的制备方法包括如下步骤：
（1）菌种培养：将低温保存的所述枯草芽孢杆菌与所述甲基营养型芽孢杆菌菌株分别接种于NA固体培养基上，培养得到单菌落，挑取单菌落转接到NA斜面培养基上继续培养；挑取长势良好的单一菌落，接种至LB培养基中，振荡培养得到一级种子液；
（2）种子罐发酵培养：将步骤（1）得到的所述一级种子液，按种子罐所用培养基体积比的0.5-3％接种量分别接入种子罐，培养得到二级种子液；
（3）大规模工业发酵培养：将步骤（2）得到的所述二级种子液，按大规模工业发酵罐所用培养基体积比的5-10％接种量分别接入大规模工业发酵罐，完成发酵，得到最终生物量≥150亿/ml，芽孢形成率达98％以上的枯草芽孢杆菌发酵液与甲基营养型芽孢杆菌发酵液；
（4）枯草芽孢杆菌菌剂与甲基营养型芽孢杆菌菌剂的制备：将步骤（3）得到的所述枯草芽孢杆菌发酵液与所述甲基营养型芽孢杆菌发酵液，分别添加一定比例的可溶性淀粉为载体，搅拌均匀，直接进行喷雾干燥，得到枯草芽孢杆菌菌剂与甲基营养型芽孢杆菌菌剂；
（5）所述生防菌剂的制备：将步骤（4）得到的两种菌剂，按所述枯草芽孢杆菌菌剂与所述甲基营养型芽孢杆菌菌剂的质量比为1:0.2-5进行混合，得到所述生防菌剂；
（6）所述微生物菌剂的制备：按质量百分比，将步骤（5）得到的所述生防菌剂0.1-10%与所述腐殖酸5-30%，所述蘑菇渣25-65%，以及所述豆粉5-30%混合均匀，得到所述微生物菌剂。
4.根据权利要求3所述的一种用于防治人参锈病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中NA固体培养基的培养条件为：温度36-38℃，培养时间24-36h；NA斜面培养基的培养条件为：温度36-38℃，培养时间16-24h；LB培养基的培养条件为：转速200-260rpm/min，温度34-36℃，培养时间16-24h。
5.根据权利要求3所述的一种用于防治人参锈病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中种子罐的培养条件为：通气量0.4-1.5V／V•min，搅拌速度180-260rpm/min，温度36-38℃，培养时间18-24h。
6.根据权利要求3所述的一种用于防治人参锈病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中大规模工业发酵罐的培养条件为：通气量0.4-1.5V／V•min，搅拌速度180-260rpm/min，温度36-38℃，培养时间24-30h。
7.根据权利要求3所述的一种用于防治人参锈病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中喷雾干燥的条件为：进口温度150-200℃，出口温度50-90℃。
8.根据权利要求1所述的一种用于防治人参锈病的微生物菌剂的应用，其特征在于：所述微生物菌剂在防治人参锈病中的应用。
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