CN108865954A - 一种海水芽孢杆菌及其在酵素肥中的应用和应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种海水芽孢杆菌及其在酵素肥中的应用和应用方法，海水芽孢杆菌其分类命名为：海水芽孢杆菌（Bacillus aquimaris A‑11）,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.15832。本发明的一种海水芽孢杆菌（Bacillus aquimaris A‑11）和现有的海水芽孢杆菌相比，具有增殖速度快，有效活菌数高，发酵酵素产品的肥效高等特点，具有较强的重金属降解能力，可降解分解各种蔬菜水果、有机物垃圾、畜禽粪便、农林废弃物等物质；并且能够分泌大量淀粉酶，适合用于土壤的重金属处理或者农林有机废弃物的处理，以及降解具有植物毒性的间酪氨酸等，这些特性使其在农业方面具有巨大的应用潜力。

Description

一种海水芽孢杆菌及其在酵素肥中的应用和应用方法
技术领域
本发明涉及生物工程和农业技术领域，具体地说是一种海水芽孢杆菌及其在酵素肥中的应用和应用方法。
背景技术
酵素技术是有日本科学工作者研发成功，并且风靡于中国台湾、韩国和东南亚国家，自1994年引入中国大陆。一般是通过含有较强活力的水解酶的细菌、放线菌或者酵母菌等通过好氧或者厌氧发酵水果蔬菜或者其他有机质获得具有一定功能性的发酵产物。酵素广泛应用于保健、农业种植、养殖、环保等领域。
蛋白酶(Protease)属于水解酶类，是最重要的三大工业用酶之一，销售额约占全球酶制剂市场的60％。蛋白酶在食品、酿造、医药、纺织、皮革、日用化学、洗涤剂、饲料以及水产加工等多个行业有广泛应用，对国民经济的发展起着重要的作用。随着发酵技术的进步及基因工程的崛起和广泛应用，利用微生物产酶成为了商品酶制剂生产的主要方法。首先，微生物生长繁殖速度快，产酶量较高；其次，微生物无处不在，几乎在所有的环境中都有微生物存在，由于环境的不同，微生物的种类以及所产酶也不尽相同，从而不同类型以及特性的酶制剂几乎都能从微生物中获得，如高温酶、中温酶、低温酶、耐高盐酶、耐碱酶等；再次，微生物培养条件容易控制，可进行连续的发酵，并且可以大批量生产，不仅能降低生产成本，而且能保证酶制剂的供应量。
发明内容
本发明的技术任务是提供一种海水芽孢杆菌及其在酵素肥中的应用和应用方法。
本发明的技术任务是按以下方式实现的：
一种海水芽孢杆菌，其分类命名为：海水芽孢杆菌(Bacillus aquimaris A-11),已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.15832。
所述的海水芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，细胞形状为杆状，在固态培养基上菌落呈不规则圆形、淡黄色、半透明、表面光滑。
表1芽孢杆菌A-11菌株的主要生理生化指标
所述的海水芽孢杆菌的菌株从堆肥中分离得到，步骤如下：
1)堆肥样品采集处理：从麦秆堆肥的底部采集100g样品，用灭过菌的无菌袋-20℃保藏；
2)梯度稀释：将堆肥样品称取2g，放到10ml的无菌生理盐水中震荡混合均匀，然后称取1ml再转移到9ml的无菌生理盐水中震荡均匀，依次操作稀释 6次；
3)平板涂布：稀释好的样品取100ul置入LB平板涂布；
4)培养：将涂布好的平板置入培养箱30-40℃培养2天；
5)纯化：将平板上的菌落用接种环挑出在LB平板划线，然后30-40℃培养1天重复挑取划线纯化2-3次，即可得海水芽孢杆菌的菌株。
所述的海水芽孢杆菌在酵素肥中的应用。
所述的海水芽孢杆菌在酵素肥中的应用方法，步骤如下：
步骤1)将所述的海水芽孢杆菌用接种环接取至装有活化培养基4-10ml 的试管中，在30-37℃、150-220r/min的摇床中振荡培养24h，获得活化的菌液；
所述的活化培养基为LB培养基：蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,氯化钠10g/L， pH7；
步骤2)扩大培养将活化的菌液以重量比1：100的比例转接到装有发酵培养基的三角瓶中，在30-37℃、150-220r/min的摇床中振荡培养24h，获得菌液；
所述的发酵培养基为增富培养基：蛋白胨20g/L,酵母膏10g/L,氯化钠 10g/L，pH7；
步骤3)将所述的菌液加入酵素肥原料中，在4-50℃发酵直至原料完全糖化、氨基酸降解和木质纤维素分解，发酵好后，即可获得酵素肥。
所述的步骤2)中，若活化的菌液的需求量大，可以根据需要以1：50的比例接种到生产规模的发酵罐系统，以获得大量菌液。
所述的步骤3)中的所述的酵素肥原料制备过程如下：
将有机物垃圾、畜禽粪便或者农林废弃物为原料粉碎，然后根据成分的不同加入碳源或者氮源混合均匀后，在115-126℃温度下灭菌后获得酵素肥原料。
所述的碳源为酵母膏、葡萄糖、红糖糖蜜或玉米浆中的一种。
所述的氮源为豆粕粉或蛋白胨。
所述的步骤3)中发酵好后的酵素肥，可以直接灌装做成液体酵素肥或者通过低温烘干、粉碎后做成粉剂或者造粒做成固体肥料，并且可以与其他肥料复配。
本发明的一种海水芽孢杆菌(Bacillus aquimaris A-11)和现有的海水芽孢杆菌相比，具有增殖速度快，有效活菌数高，发酵酵素产品的肥效高等特点，具有较强的重金属降解能力，可降解分解各种蔬菜水果、有机物垃圾、畜禽粪便、农林废弃物等物质；并且能够分泌大量淀粉酶，适合用于土壤的重金属处理或者农林有机废弃物的处理，以及降解具有植物毒性的间酪氨酸等，这些特性使其在农业方面具有巨大的应用潜力。
具体实施方式
实施例1：
海水芽孢杆菌的菌株从堆肥中分离：
1)堆肥样品采集处理：从麦秆堆肥的底部采集100g样品，用灭过菌的无菌袋-20℃保藏；
2)梯度稀释：将堆肥样品称取2g，放到10ml的无菌生理盐水中震荡混合均匀，然后称取1ml再转移到9ml的无菌生理盐水中震荡均匀，依次操作稀释 6次；
3)平板涂布：稀释好的样品取100ul置入LB平板涂布；
4)培养：将涂布好的平板置入培养箱30-40℃培养2天；
5)纯化：将平板上的菌落用接种环挑出在LB平板划线，然后30-40℃培养1天重复挑取划线纯化2-3次，即可得海水芽孢杆菌的菌株，放置在斜面培养基或者甘油冷冻保藏备用。
发酵液配制：
1)菌种扩繁，将冻存管菌种接种于6ml培养基的试管过夜培养，然后1： 100接种于三角瓶扩大培养，培养温度37度，18h，摇床振荡培养220rpm/min，获得菌液。
2)将水果(水果包括苹果、梨、香蕉)和蔬菜(蔬菜包括大白菜、菠菜、油菜)、豆粕、糖蜜、粉碎的秸秆(麦秆等)按照质量比例4：2：1：1：2混合均匀加入适量清水(总质量的50％)。
3)将步骤1获得的菌液按照质量比例1：50均匀拌入培养液，37度在发酵槽中发酵，每天翻抛一次，发酵七天。
4)将发酵成熟的酵素肥用震动流化床干燥至水分10％以下，干燥温度控制在进风口80℃，出风口40℃，保证菌和酶的活性。
5)检测、装袋分装，备用。
酵素肥原料制备：
将重量配比(kg)为：甘蔗渣5、粉碎后的秸秆25、腐植酸5、鸡粪25、猪粪30为原料粉碎，然后加入10kg酵母膏、葡萄糖、红糖糖蜜或玉米浆中的一种，混合均匀后，在115-126℃温度下灭菌后获得酵素肥原料。
酵素肥制备：
将酵素肥原料粉碎并混合均匀，然后加入80％的水，1：25接种上述发酵液，然后发酵10天，控制发酵温度为30-40℃，发酵过程中每天翻抛或者搅拌2-3次；发酵完后干燥造粒。
实施例2：
海水芽孢杆菌的菌株从堆肥中分离：
1)堆肥样品采集处理：从麦秆堆肥的底部采集100g样品，用灭过菌的无菌袋-20℃保藏；
2)梯度稀释：将堆肥样品称取2g，放到10ml的无菌生理盐水中震荡混合均匀，然后称取1ml再转移到9ml的无菌生理盐水中震荡均匀，依次操作稀释 6次；
3)平板涂布：稀释好的样品取100ul置入LB平板涂布；
4)培养：将涂布好的平板置入培养箱37℃培养2天；
5)纯化：将平板上的菌落用接种环挑出在LB平板划线，然后37℃培养1 天重复挑取划线纯化2-3次，即可得海水芽孢杆菌的菌株，放置在斜面培养基或者甘油冷冻保藏备用。
发酵液配制：
1)菌种扩繁，将冻存管菌种接种于6ml培养基的试管过夜培养，然后1： 100接种于三角瓶扩大培养，培养温度37度，18h，摇床振荡培养220rpm/min，获得菌液。
2)将水果(水果包括苹果、梨、香蕉)和蔬菜(蔬菜包括大白菜、菠菜、油菜)、豆粕、糖蜜、粉碎的秸秆(麦秆、玉米秸秆等)按照质量比例4：2：1： 1：2混合均匀加入适量清水(总质量的50％)。
3)将步骤1获得的菌液按照质量比例1：50均匀拌入培养液，37度在发酵槽中发酵，每天翻抛一次，发酵七天。
4)将发酵成熟的酵素肥用震动流化床干燥至水分10％以下，干燥温度控制在进风口80℃，出风口40℃，保证菌和酶的活性。
5)检测、装袋分装，备用。
酵素肥原料制备：
将重量配比(kg)为：牛粪25、厨余垃圾30、秸秆15、糖蜜5、鸡粪15为原料粉碎，然后加入10kg豆粕粉或蛋白胨，混合均匀后，在121℃温度下灭菌后获得酵素肥原料。
酵素肥制备：
将酵素肥原料粉碎并混合均匀，然后加入70％的水，1：25接种实施例1 步骤1的发酵液，然后发酵10天，控制发酵温度为37℃，发酵过程中每天翻抛或者搅拌2-3次；发酵完后干燥，干燥后的酵素肥料可以添加10％左右的氮磷钾或者微量元素等增强营养并造粒。
对比检测实验：
取实施例1制备的生物酵素肥料，以及市售酵素肥料做对照，在水稻上进行施用效果检测。
选4亩水稻田，2亩为实施例1的酵素肥每次5kg，2亩为市售酵素肥每次 5kg。施用时间为水稻的苗期插秧后20天施用一次，然后生长到幼穗分化期再施用一次。实验田按照正常的排灌水、病虫防治除草等生产操作。记录有效穗数、剑叶、穗长、颗粒数、千粒重、亩产。
表2本发明酵素肥料与市售酵素肥料的实验结果比较
由表2可以看出，本发明的酵素肥使得水稻苗数、有效穗粒和亩产量均高于市售酵素肥，增产33斤/亩。
通过上面具体实施方式，所述技术领域的技术人员可容易的实现本发明。但是应当理解，本发明并不限于上述的几种具体实施方式。在公开的实施方式的基础上，所述技术领域的技术人员可任意组合不同的技术特征，从而实现不同的技术方案。
序列表
<110> 山东福田药业有限公司
江苏大学
<120> 一种海水芽孢杆菌及其在酵素肥中的应用和应用方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1025
<212> DNA
<213> Bacillusacidopullulyticus
<400> 1
cggggggggt gctatacatg caagtcgagc ggattgatgg gagcttgctc ccatcagtca 60
gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120
aaccggggct aataccggat aactcatttc ctcgcatgag gaaatgttga aaggtggctt 180
ttagctatca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240
ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300
ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360
ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aaactctgtt gttagggaag 420
aacaagtacc gttcgaatag ggcggtacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480
actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540
gtaaagcgcg cgcaggtggt tccttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct caaccgtgga 600
gggtcattgg aaactggggg acttgagtgc agaagaggaa agtggaattc caagtgtagc 660
ggtgaaatgc gtagatattt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactttc tggtctgtaa 720
ctgacactga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780
ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc 840
attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 900
gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960
tcttgacatc ctctgacaac cctagagata gggctttccc cttcggggga cagagtgaca 1020
gtggt 1025

Claims (10)

1.一种海水芽孢杆菌，其特征在于，其分类命名为：海水芽孢杆菌Bacillus aquimarisA-11,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.15832。
2.根据权利要求1所述的海水芽孢杆菌，其特征在于，所述的海水芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，细胞形状为杆状，在固态培养基上菌落呈不规则圆形、淡黄色、半透明、表面光滑。
3.根据权利要求1所述的海水芽孢杆菌，其特征在于，所述的海水芽孢杆菌的菌株从堆肥中分离得到，步骤如下：
1)堆肥样品采集处理：从麦秆堆肥的底部采集100g样品，用灭过菌的无菌袋-20℃保藏；
2)梯度稀释：将堆肥样品称取2g，放到10ml的无菌生理盐水中震荡混合均匀，然后称取1ml再转移到9ml的无菌生理盐水中震荡均匀，依次操作稀释6次；
3)平板涂布：稀释好的样品取100 ul 置入LB平板涂布；
4）培养：将涂布好的平板置入培养箱30-40℃培养2天；
5）纯化：将平板上的菌落用接种环挑出在LB平板划线，然后30-40℃培养1天重复挑取划线纯化2-3次，即可得海水芽孢杆菌的菌株。
4.根据权利要求1所述的海水芽孢杆菌在酵素肥中的应用。
5.根据权利要求1所述的海水芽孢杆菌在酵素肥中的应用方法，其特征在于，步骤如下：
步骤1）将所述的海水芽孢杆菌用接种环接取至装有活化培养基4-10 ml的试管中，在30-37℃、150-220 r/min的摇床中振荡培养24 h，获得活化的菌液；
所述的活化培养基为LB培养基：蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,氯化钠10g/L，pH7；
步骤2）扩大培养将活化的菌液以重量比1：100的比例转接到装有发酵培养基的三角瓶中，在30-37 ℃、150-220 r/min的摇床中振荡培养24 h，获得菌液；
所述的发酵培养基为增富培养基：蛋白胨20g/L,酵母膏10g/L,氯化钠10g/L，pH7；
步骤3）将所述的菌液加入酵素肥原料中，在4-50℃发酵直至原料完全糖化、氨基酸降解和木质纤维素分解，发酵好后，即可获得酵素肥。
6.根据权利要求5所述的海水芽孢杆菌在酵素肥中的应用方法，其特征在于，所述的步骤2）中，若活化的菌液的需求量大，可以根据需要以1：50的比例接种到生产规模的发酵罐系统，以获得大量菌液。
7.根据权利要求5所述海水芽孢杆菌在酵素肥中的应用方法，其特征在于，所述的步骤3）中的所述的酵素肥原料制备过程如下：
将有机物垃圾、畜禽粪便或者农林废弃物为原料粉碎，然后根据成分的不同加入碳源或者氮源混合均匀后，在115-126℃温度下灭菌后获得酵素肥原料。
8.根据权利要求7所述海水芽孢杆菌在酵素肥中的应用方法，其特征在于，所述的碳源为酵母膏、葡萄糖、红糖糖蜜或玉米浆中的一种。
9.根据权利要求7所述海水芽孢杆菌在酵素肥中的应用方法，其特征在于，所述的氮源为豆粕粉或蛋白胨。
10.根据权利要求5所述海水芽孢杆菌在酵素肥中的应用方法，其特征在于，所述的步骤3）中发酵好后的酵素肥，可以直接灌装做成液体酵素肥或者通过低温烘干、粉碎后做成粉剂或者造粒做成固体肥料。
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