CN105132312A - 一种枯草芽孢杆菌和应用、含有该枯草芽孢杆菌的微生物杀菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌和应用、含有该枯草芽孢杆菌的微生物杀菌剂及其制备方法；其目的是提供由枯草芽孢杆菌(Bacillus？subtilis)HU2012产生的微生物杀菌剂。一种微生物杀菌剂的活性成分为(Bacillus？subtilis)HU2012。本发明提供的微生物杀菌剂对小麦赤霉病菌(Gibberella？zeae)、水稻纹枯病菌(Thanatephorus？cucumeris)和灰霉病菌(Botrytis？cinerea)等病原真菌有很好的抑制效果。
Description
技术领域
本发明涉微生物技术，具体涉及一种枯草芽孢杆菌和应用、含有该枯草芽孢杆菌的微生物杀菌剂及其制备方法。
背景技术
微生物是生物杀菌剂的重要来源，从中发现并商品化的品种多达几十种。相比化学杀菌剂，微生物杀菌剂具备选择性高、安全性好、易降解、用量少、残留少、污染小等优点。据统计，目前国际上生物农药产品已超过100多种，但90％以上是微生物杀虫剂。Philip(2002)预测第二个重要的商业化的生物农药将是微生物杀菌剂。微生物杀菌剂主要有农用抗生素、细菌杀菌剂、真菌杀菌剂等类型。由于细菌的种类多、数量大、繁殖速度快，可以通过功能基因的修饰、改造、转移等基因工程手段构建新型的工程菌，且易于人工培养和控制。因此，细菌杀菌剂的研究和开发具有较大的前景。
近年来，以细菌防治植物病害取得了较大的进展。在国外用放射土壤杆菌k84菌系防治果树的根癌病是最成功的例子，并且已商品化。美国报道，用草生欧氏杆菌防治梨火疫病效果与链霉素相当。在我国细菌生物防治剂的研究方面也取得了一定的成果。开发成功的细菌杀菌剂有亚宝(枯草芽孢杆菌)、力宝(假单胞菌)、增产菌(蜡质芽孢杆菌)，地衣芽孢杆菌制剂和荧光假单胞制剂也已商品化。沈阳农业大学生物农药工程中心利用拮抗木霉(绿色木霉TR-8)和拮抗细菌(芽孢杆菌B67)混合发酵制成健根宝粉剂，成功用于防治蔬菜和甜瓜的苗期病害。其他报道的细菌杀菌剂还有：用来防治黄瓜及烟草炭疽病菌的地衣芽孢杆菌，防治甘蓝黑腐病的枯草芽孢杆菌，以及防治水稻纹枯病的假单孢菌等。
细菌作为一种重要的微生物资源，其抑菌活性值得深入研究。用于生防的细菌以芽孢杆菌为主，主要有枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)和短小芽孢杆菌(B.pumilis)等。它们大量存在植物根际，定殖于植物根面，繁殖快，可产生嗜铁索和抗生素，在植物局部和空间微环境与目的菌竞争，对多种植物病原菌有抑制作用。由于芽孢杆菌具有抑制植物病害的能力，又是自然界中广泛存在的非致病细菌，对人畜无害，不污染环境，因而备受关注。
国内外学者先后分别报道了具有生物控制作用的各个不同株系的枯草芽孢杆菌的生物学特征、定殖条件、抗菌物质理化特性等相关研究及其在不同作物根部定殖情况、对腐霉、镰刀菌等引起的不同土传病害的防治效果、潜在的诱导植物产生抗病性及促进幼苗生长等方面的研究。已有研究表明，因芽孢杆菌能生产内生芽孢，具有极强的抗逆能力，相比其他类型的生防因子，更有利于菌剂的生产，剂型加工及在环境中存活，定殖与繁殖。
发明内容
为了使枯草芽孢杆菌在杀菌中的应用，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌和应用、含有该枯草芽孢杆菌的微生物杀菌剂及其制备方法。
本发明的技术方案是：一种枯草芽孢杆菌，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HU2012，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址是：中国湖北省武汉市武汉大学，保藏时间为2015年4月7日，保藏号为CCTCCNO:M2015206。
本发明还提供了一种上述枯草芽孢杆菌的微生物杀菌剂，其活性成分为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HU2012。
本发明进一步提供了如上述的枯草芽孢杆菌在制备抑制小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌或灰霉病菌药物中的应用。
本发明的进一步改进包括
上述的枯草芽孢杆菌，其培养基为PD培养基，其中含有马铃薯200g水煎液，葡萄糖12g，加水配制1000ml，并调节pH值7.0。
所述的微生物杀菌剂，包括枯草芽孢杆菌和无水CaCO3；将3倍重量的CaCO3和沸石粉混合物按重量比1∶1缓慢加入活菌体中，边加边搅拌，直至均匀；于真空干燥箱中50℃烘干30min至粉末状。
本发明还提供了上述微生物杀菌剂的使用方法，具体是兑水使用，微生物杀菌剂∶水按重量比例为1∶1000，此时菌剂溶液中活芽孢数为1×106cfu/g。
本发明进一步提供了上述的微生物杀菌剂的制备方法，具体包括以下步骤：(1)菌种活化，将保存在4℃冰箱里的MHA的试管斜面上的菌种取出，在室温下放置10min然后用接种环以平板划线法接入预先制作好的MHA平板上，36-38℃下进行活化培养24h，备用；(2)种子液的制备，将平板上培养的活化菌株接入到装有100mlPD培养基的250ml三角瓶中，36-38℃，130r·min-1，振荡培养24h；(3)发酵培养，将上述培养好的种子液，按1％的体积比例接种至PD培养基中，28℃，振荡培养36h，(4)分离菌体与发酵液，将发酵培养好的培养物，在转速8000rpm下离心10min，然后分别收集湿菌体和发酵液；(5)活菌体制剂，按重量比将上所述湿菌体与3倍重量的CaCO3∶沸石粉＝1∶1混合并搅拌均匀，之后在50℃真空干燥箱中干燥30min；将干燥好的物质研磨成干粉即得干粉菌剂。
本发明提供的微生物杀菌剂对小麦赤霉病菌(Gibberellazeae)、水稻纹枯病菌(Thanatephoruscucumeris)和灰霉病菌(Botrytiscinerea)等病原真菌有很好的抑制效果。
附图说明
图1枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HU2012的显微照片。
图2枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HU2012系统发育树的构建。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做详细说明。
所述的微生物杀菌剂可按如下方法获得：在PD培养基中发酵枯草芽孢杆菌，将得到的发酵液与活体菌分离。
所述的PD培养基中含有马铃薯200g，葡萄糖12g，加水1000ml，PH值约为7.0左右。
该活体菌制剂是经过下述方法制成的：
(1)菌种活化
将保存在4℃冰箱里的(MHA的试管斜面上的)菌种取出，在室温下放置10min。然后用接种环以平板划线法接入预先制作好的MHA平板上，37±1℃下进行活化培养24h，备用。
(2)种子液的制备
将平板上培养的活化菌株接入到装有100mlPD培养基的250ml三角瓶中，37±1℃，130r.min-1，振荡培养24h。
(3)发酵培养
将上述培养好的种子液，按1％的体积比例接种至PD培养基中，28℃，振荡培养36h。
(4)分离菌体与发酵液
将发酵培养好的培养物，在转速8000rpm下离心10min，然后分别收集湿菌体和发酵液。
(5)活菌体制剂
将上述湿菌体与3倍重量的CaCO3∶沸石粉＝1∶1混合并搅拌均匀，之后在50℃真空干燥箱中干燥30min。将干燥好的物质研磨成干粉即得活体菌制剂。
该发酵液制剂的制作方法：
发酵液7-8份与填料1-1.2混合制成母液，经喷雾干燥机干燥制成母粉。在母粉里添加分散剂0.5-0.7份、润湿剂0.4-0.5份、稳定剂CMC-Na0.15-0.3份、保护剂FWA0.01-0.02份，以上添加物混合均匀后经气流粉碎机粉碎即可制得发酵液制剂。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HU2012干粉菌剂的制备
(1)菌种活化
将保存在4℃冰箱里的(MHA的试管斜面上的)菌种取出，在室温下放置10min。然后用接种环以平板划线法接入预先制作好的MHA平板上，37±1℃下进行活化培养24h，备用。
(2)种子液的制备
将平板上培养的活化菌株接入到装有100mlPD培养基的250ml三角瓶中，37±1℃，130r.min-1，振荡培养24h。
(3)发酵培养
将上述培养好的种子液，按1％的体积比例接种至PD培养基中，28℃，振荡培养36h。
(4)分离菌体与发酵液
将发酵培养好的培养物，在转速8000rpm下离心10min，然后分别收集湿菌体和发酵液。
(5)活菌体制剂
将上述湿菌体与3倍重量的CaCO3∶沸石粉＝1∶1混合并搅拌均匀，之后在50℃真空干燥箱中干燥30min。将干燥好的物质研磨成干粉即得活体菌制剂。
二、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HU2012发酵液制剂的制备
发酵液7-8份与填料1-1.2混合制成母液，经喷雾干燥机干燥制成母粉。在母粉里添加分散剂0.5-0.7份、润湿剂0.4-0.5份、稳定剂CMC-Na0.15-0.3份、保护剂FWA0.01-0.02份，以上添加物混合均匀后经气流粉碎机粉碎即可制得发酵液制剂。
实施例1：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HU2012发酵培养基的探索实验
培养基的制作
BPM：牛肉膏蛋白胨发酵液，牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，自来水1000ml，pH7.0左右。
MH培养基：牛肉粉2.0g，可溶性淀粉1.5g，酸性水解酪蛋白17.5g，蒸馏水1000ml，pH为7.0左右。
PD培养基：马铃薯200g，葡萄糖12g，自来水1000ml，pH为7.0左右。
PS培养基：马铃薯200g，蔗糖12g，自来水1000ml，pH为7.0左右。
LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水1000ml，pH为7.0左右。
发酵培养
用恒温水浴振荡器37℃培养24h后的枯草芽孢杆菌发酵液(MH发酵液、PD发酵液、PS发酵液、LB发酵液、牛肉膏蛋白胨发酵液)，再用孔径0.45μm滤膜的尼龙滤芯和10ml的注射器过滤，取滤液，备用。
供试菌种
小麦赤霉病菌，水稻纹枯病菌，灰霉病菌。供试菌种提前一周转接至PDA平板上供试。试验方法
采用生长速率法对不同培养基培养的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HU2012发酵液的抑菌活性进行测定。用移液枪吸取1ml过滤好的发酵液于25ml刻度试管，用熔化的PDA培养基定容至10ml，混匀后倒入直径90mm培皿中制成带药平板，发酵液浓度为10x稀释。同理再用移液枪吸取2ml过滤好的发酵液于25ml刻度试管，用熔化的PDA培养基定容至10ml，混匀后倒入直径90mm培皿中制成带药平板，发酵液浓度为5x稀释。用灭菌后的打孔器在培养好的供试菌种上打菌饼(直径为4mm)，然后将菌饼倒扣在带药平板中央，每处理重复3次。设置等量的PDA培养基作为对照，对照重复3次。接好的菌种平板放入恒温培养箱(25±1℃)培养72h后用十字交叉法测量菌丝直径。按以下公式计算抑制率。
菌落生长直径＝菌落直径-4
表1枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HU2012发酵产物对3种真菌的抑制率
注：表中数据为三次重复的平均值，同列数据后不同小写字母表示枯草芽孢杆菌发酵液提取物对三种真菌的抑制作用数据间差异显著(P＜0.05)，Duncan新复极差法。
结果分析
活性测定结果表明，枯草芽孢杆菌发酵液提取物对水稻纹枯病菌的抑制率都在96.07％～100.00％之间，对灰霉病菌的抑制率都在82.19％～100.00％之间，但是5种发酵液提取物对小麦赤霉病菌的抑制率都普遍偏低，在78.94％～90.79％，其中，48h时，5×PD对小麦赤霉病菌的抑制率为89.47％，5×PS对小麦赤霉病菌的抑制率为90.79％。72h时，5×PD对小麦赤霉病菌的抑制率为93.16％，5×PS对小麦赤霉病菌的抑制率为93.17％，相对来说PD和PS发酵液提取物对小麦赤霉病菌的抑制率还是比较高的。综合考虑，对三种病原真菌的抑制率都较高的为PD发酵液提取物。
实施例2：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HU2012菌体抑菌活性测定
将细菌枯草芽孢杆菌及7种供试病原真菌置于PDA固体培养基平板上生长5d，让病原真菌处于生长旺盛阶段。用灭菌的打孔器在各长满菌丝的平板上打制直径为4mm的菌饼备用。分别挑取已制好的枯草芽孢杆菌菌饼及供试病原真菌菌饼各一块，接于PDA平板中央，相距约为3cm。将各平板放置于恒温培养箱中培养，3d后开始观察长势结果。
通过实验，发现枯草芽孢杆菌菌体对小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、小麦纹枯病菌这3种病原真菌有明显的对峙抑菌效果。
实施例3：枯草芽孢杆菌抑病原真菌活性测定
采用生长速率法检测了枯草芽孢杆菌对病原真菌：苹果炭疽病菌、水稻纹枯病菌、小麦纹枯病菌、小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、棉花黄萎病菌、辣椒疫霉病菌的抑菌活性。
用移液枪移取枯草芽孢杆菌1ml加入20ml的刻度试管中(以加入等量无菌水作为对照)，用PDA培养基定容至10ml，混匀后倒入直径为9cm已灭菌的培养皿中制成带药平板。酒精灯外焰灼烧打孔器(直径为4mm)至发红，冷却后，在已培养的处于生长旺盛阶段的供试菌种上打制菌饼。以接种针挑取菌饼倒扣在平板中央，每皿放置1个菌饼，每个处理重复3次。处理好的培养皿放置于培养间里培养72h检查结果，按以下公式计算抑制率：
菌落生长直径＝菌落直径-4
表2枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HU2012对供试病原真菌的抑制作用
注：供试浓度为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HU2012按体积稀释10倍；多重比较采用Duncan新复极差法；均值代表对各菌的平均抑制率。
实验结果表明，枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌发酵后经离心过滤得到的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HU2012具有较为广泛的抑菌作用，对七种病原菌具有很强的抑菌活性，其中对苹果炭疽病菌、水稻纹枯病菌、小麦纹枯病菌、小麦赤霉病菌、灰霉病菌、棉花黄萎病菌等六种病原菌的抑菌活性都在90％以上，对苹果炭疽病菌、水稻纹枯病菌、小麦纹枯病菌、小麦赤霉病菌的抑菌活性甚至达到了100％。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (7)
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HU2012，保藏在中国典型微生物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCNO:M2015206。
2.一种含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌的微生物杀菌剂，其特征在于，其活性成分为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HU2012。
3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备抑制小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌或灰霉病菌药物中的应用。
4.根据权利要求1-3任一项所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，其培养基为PD培养基，其中含有马铃薯200g水煎液，葡萄糖12g，加水配制1000ml，并调节pH值7.0。
5.根据权利要求2所述的微生物杀菌剂，其特征在于，包括枯草芽孢杆菌和无水CaCO3；将3倍重量的CaCO3和沸石粉混合物按重量比1:1缓慢加入活菌体中，边加边搅拌，直至均匀；于真空干燥箱中50℃烘干30min至粉末状。
6.如权利要求5所述微生物杀菌剂的使用方法，其特征在于，兑水使用，微生物杀菌剂：水按重量比例为1:1000，此时菌剂溶液中活芽孢数为(0.8-1.2)×106cfu/g。
7.如权利要求2所述的微生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)菌种活化，将保存在4℃冰箱里的MHA的试管斜面上的菌种取出，在室温下放置10min；然后用接种环以平板划线法接入预先制作好的MHA平板上，36-38℃下进行活化培养24h，备用；(2)种子液的制备，将平板上培养的活化菌株接入到装有100mlPD培养基的250ml三角瓶中，36-38℃，130r.min-1，振荡培养24h；(3)发酵培养，将上述培养好的种子液，按1％的体积比例接种至PD培养基中，28℃，振荡培养36h，(4)分离菌体与发酵液，将发酵培养好的培养物，在转速8000rpm下离心10min，然后分别收集湿菌体和发酵液；(5)活菌体制剂，按重量比将上所述湿菌体与3倍重量的CaCO3：沸石粉＝1:1混合并搅拌均匀，之后在50℃真空干燥箱中干燥30min；将干燥好的物质研磨成干粉即得干粉菌剂。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20151209 |