CN110313475A - 一种枯草芽孢杆菌控释剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌控释剂，包含如下质量份数的组分：载体1‑5份、囊壁材料5‑10份、枯草芽孢杆菌发酵液10‑20份。该枯草芽孢杆菌控释剂的制备方法为：(1)枯草芽孢杆菌的培养；(2)囊壁材料的制备；(3)载体吸附枯草芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌发酵液；(4)喷雾干燥。本发明技术方案取得的有益效果为：(1)对枯草芽孢杆菌及其发酵产物微胶囊化，使其能够保持良好的活力和稳定性；(2)利用物理的方法，在有限的区域空间内，将活体微生物或微生物代谢产物固定在载体上，使其在使用中保持活性；(3)产品具有良好的微胶囊结构，并具有良好的机械强度和柔韧性，对囊芯微生物菌剂具有良好的控释作用。

Description

一种枯草芽孢杆菌控释剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生物制剂技术领域，更具体的说是涉及一种枯草芽孢杆菌控释剂及其制备方法。
背景技术
国内外对植物病害的防治主要以化学防治为主，但化学防治所造成的环境污染、病虫害耐药性增加、农药残留和土壤微生态破坏等问题日益突出。生物防治因其环境相容性好、病害不易产生耐药性和对人畜无危害等优点日益受到重视。枯草芽孢杆菌主要是通过诱导抗性、分泌抗菌或脂肽类物质、溶菌作用、营养和空间位点竞争等机制发挥生防功能。
目前，国内外枯草芽孢杆菌活菌制剂的剂型主要是可湿性粉剂，还有少量水剂、悬浮剂和水分散粒剂。但可湿性粉剂存在粉尘飞扬、污染环境、长时间贮存不能保持药效等问题。水分散粒剂是一种相对新型的生物农药剂型，可以解决可湿性粉剂的环境污染、粉尘飞扬等问题，但仍不能有效解决微生物活体农药制剂的贮藏不稳定问题。
因此，制备一种稳定性好的枯草芽孢杆菌制剂是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌控释剂及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种枯草芽孢杆菌控释剂，包括如下质量份数的组分：载体1-5份、囊壁材料5-10份、枯草芽孢杆菌发酵液10-20份。
所述载体为活性炭、高岭土、硅藻土、白炭黑中的一种或多种。
所述囊壁材料为玉米淀粉、海藻酸钠、琼脂、阿拉伯树胶、麦芽糊精中的一种或多种。
所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌HU2012 Bacillus subtilis HU2012，保藏在中国典型微生物保藏中心，保藏单位地址：中国湖北省武汉市武汉大学，保藏时间为2015年4月7日，保藏号为CCTCC NO：M2015206。
优选的，一种枯草芽孢杆菌控释剂，包括如下质量份数的组分：载体3份、囊壁材料7份、枯草芽孢杆菌发酵液15份。
一种枯草芽孢杆菌控释剂的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)枯草芽孢杆菌的培养：
将活化的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中发酵制备种子液，之后将制得的种子液接种到发酵罐中制备枯草芽孢杆菌发酵液；
所述枯草芽孢杆菌发酵液中包含枯草芽孢杆菌菌体和代谢产物，所述代谢产物包括酶类、脂肪酸、环二肽、环多肽、维生素；
(2)囊壁材料的制备：将囊壁材料配制成浓度为3-5％的囊壁材料溶液，灭菌备用；
(3)载体吸附：将载体与步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌发酵液混合均匀，在恒温摇床中，以转速120rpm震荡培养1-3h；
利用物理吸附方法将枯草芽孢杆菌及其代谢产物固定在载体上；
(4)喷雾干燥：步骤(3)震荡培养完成后，加入步骤(2)制备的囊壁材料溶液混匀，将混合液进行喷雾干燥，控制进风温度120-150℃，进样流量700-800ml/h，喷雾压力0.1-0.3MPa。
优选的，步骤(1)中所述的发酵制备种子液，发酵温度35-40℃，发酵时间12-36h。
优选的，所述种子培养基包含如下质量份数的组分：马铃薯水煎液200-300 份、葡萄糖10-20份，加水配制至1000份，并调节pH值至7.0。
优选的，步骤(1)中所述的制备枯草芽孢杆菌发酵液，种子液接种量为发酵培养基体积的1-5％，发酵罐压力为0.05-0.25MPa，发酵温度为25-35℃，发酵时间24-48h。
优选的，步骤(1)中制备的枯草芽孢杆菌发酵液的菌含量为 7×108-9×108cfu/ml。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为： (1)对枯草芽孢杆菌及其代谢产物微胶囊化，以减小外界环境对细菌活性的影响，使其具有良好的稳定性；(2)利用物理的方法，在有限的区域空间内，将活体微生物或微生物代谢产物固定在载体上，使其在使用中保持活性；(3)喷雾干燥工艺简单，适宜连续化生产；(4)产品具有良好的微胶囊结构，并具有良好的机械强度和柔韧性，对囊芯微生物菌剂具有良好的控释作用。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)菌种活化：
将保存在4℃冰箱里的枯草芽孢杆菌HU2012取出，在室温下放置10min。然后用接种环以平板划线法接入预先制作好的MHA培养基上，37±1℃下进行活化培养24h，备用。
(2)制备种子培养基：
种子培养基组分为：马铃薯水煎液200g、葡萄糖20g，加水配制1000ml，并调节pH值至7.0。
(3)制备种子液：将活化的枯草芽孢杆菌HU2012接种于上述种子培养基中，发酵温度40℃，发酵时间12h。
(4)制备发酵液：将上述种子液接种到发酵培养基，接种量为发酵培养基体积的1％，发酵罐压力为0.25MPa，发酵温度为25℃，发酵时间48h。
(5)将500kg玉米淀粉配制成质量浓度为3％的溶液，灭菌备用。
(6)将100kg活性炭和1000kg枯草芽孢杆菌发酵液混合均匀，在恒温摇床中，以转速120rpm培养震荡1h。
(7)培养震荡完成后，加入步骤(5)灭菌备用的玉米淀粉溶液混匀，将混合液进行喷雾干燥，控制进风温度120℃，进样流量700ml/h，喷雾压力0.3MPa。
实施例2
(1)菌种活化：
将保存在4℃冰箱里的枯草芽孢杆菌HU2012取出，在室温下放置10min。然后用接种环以平板划线法接入预先制作好的MHA培养基上，37±1℃下进行活化培养24h，备用。
(2)制备种子培养基：
种子培养基组分为：马铃薯水煎液300g、葡萄糖10g，加水配制1000ml，并调节pH值7.0。
(3)制备种子液：将活化的枯草芽孢杆菌HU2012接种于上述种子培养基中，发酵温度35℃，发酵时间36h。
(4)制备发酵液：将上述种子液接种到发酵培养基，接种量为发酵培养基体积的5％，发酵罐压力为0.05MPa，发酵温度为35℃，发酵时间24h。
(5)将1000kg海藻酸钠配制成浓度为5％的溶液，灭菌备用。
(6)将500kg高岭土和2000kg枯草芽孢杆菌发酵液混合均匀，在恒温摇床中，以转速120rpm培养震荡3h。
(7)培养震荡完成后，加入步骤(5)灭菌备用的质量浓度为5％的海藻酸钠溶液混匀，将混合液进行喷雾干燥，控制进风温度150℃，进样流量800ml/h，喷雾压力0.1MPa。
实施例3
(1)菌种活化：
将保存在4℃冰箱里的枯草芽孢杆菌HU2012取出，在室温下放置10min。然后用接种环以平板划线法接入预先制作好的MHA培养基上，37±1℃下进行活化培养24h，备用。
(2)制备种子培养基：
种子培养基组分为：马铃薯水煎液250g、葡萄糖15g，加水配制1000ml，并调节pH值7.0。
(3)制备种子液：将枯草芽孢杆菌HU2012接种子上述种子培养基中，发酵温度37℃，发酵时间24h。
(4)制备发酵液：将上述种子液接种到发酵培养基，接种量为发酵培养基体积的3％，发酵罐压力为0.15MPa，发酵温度为30℃，发酵时间36h。
(5)将700kg琼脂配制成质量浓度为4％的溶液，灭菌备用。
(6)将300kg白炭黑和1500kg枯草芽孢杆菌发酵液混合均匀，在恒温摇床中，以转速120rpm培养震荡2h。
(7)培养震荡完成后，加入步骤(5)灭菌备用的浓度为3％的琼脂溶液混匀，将混合液进行喷雾干燥，控制进风温度130℃，进样流量750ml/h，喷雾压力0.2MPa。
对比例1
枯草芽孢杆菌发酵剂不经过载体吸附处理，其余操作同实施例3。
对比例2
(1)菌种活化：
将保存在4℃冰箱里的枯草芽孢杆菌HU2012取出，在室温下放置10min。然后用接种环以平板划线法接入预先制作好的MHA培养基上，37±1℃下进行活化培养24h，备用。
(2)制备种子培养基：
种子培养基组分为：马铃薯水煎液250g、葡萄糖15g，加水配制1000ml，并调节pH值7.0。
(3)制备种子液：将枯草芽孢杆菌HU2012接种于上述种子培养基中，发酵温度37℃，发酵时间24h。
(4)制备发酵液：将上述种子液接种到发酵培养基，接种量为发酵培养基体积的3％，发酵罐压力为0.15MPa，发酵温度为30℃，发酵时间36h。
(5)将步骤(3)制得的发酵液过滤，冷冻干燥得菌粉。
对比例3
(1)菌种活化：
将保存在4℃冰箱里的枯草芽孢杆菌HU2012取出，在室温下放置10min。然后用接种环以平板划线法接入预先制作好的MHA培养基上，37±1℃下进行活化培养24h，备用。
(2)制备种子培养基：
种子培养基组分为：马铃薯水煎液250g、葡萄糖15g，加水配制1000ml，并调节pH值7.0。
(3)制备种子液：将枯草芽孢杆菌HU2012接种于上述种子培养基中，发酵温度37℃，发酵时间24h。
(4)制备发酵液：将上述种子液接种到发酵培养基，接种量为发酵培养基体积的3％，发酵罐压力为0.15MPa，发酵温度为30℃，发酵时间36h。
(5)将300kg白炭黑和1500kg枯草芽孢杆菌发酵液混合均匀，在恒温摇床中，以转速120rpm培养震荡2h。
(6)培养震荡完成后，37℃鼓风干燥，制得可湿性粉剂。
试验1
以实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3所述的方法制备枯草芽孢杆菌菌剂，测定其菌体存活率，菌体存活率的计算方法如下：
菌体存活率(％)＝干燥后活菌数/干燥前活菌数×100％
试验结果如表1所示。
表1不同制备方法枯草芽孢杆菌菌剂的菌含量和菌体存活率
由表1结果可知，采用本发明技术方案制得的枯草芽孢杆菌控释剂的菌体存活率远高于对比例其他方法。
试验2
以实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3所述的方法制备枯草芽孢杆菌菌剂，测定其热贮稳定性。
热贮稳定性按照GB/T 19136-2003测定。将制剂置于恒温烘箱内，54±2℃条件下14d热贮藏，每隔2d计数一次，测定其贮藏存活率。
贮藏存活率＝贮藏前活菌数/贮藏后活菌数×100％
试验结果如表2所示。
表2不同制备方法枯草芽孢菌剂热贮稳定性
由表2结果可知，采用本发明技术方案制得的枯草芽孢杆菌控释剂的贮藏存活率远高于对比例其他方法。
试验3
(1)试验对象：醉金香葡萄。
(2)栽培条件：选择近年来灰霉病连续发病的园区，土壤肥力中等，供试地块面积1.5亩，地块连续，行距2.5米，株距1.2米。本次试验前后均未用过其他农药。
(3)施药用量见表3：
表3施药用量
编号 药剂名称 处理方法
1 实施例3制得的枯草芽孢杆菌控释剂 800倍稀释
2 50％腐霉利可湿性粉剂 2000倍稀释
3 40％嘧霉胺悬浮剂 1000倍稀释
4 空白对照 清水喷施
(4)施药方法：喷雾。
(5)施药时间和次数：共施药3次，第一次在开花前一星期，第二次在开花期，第三次在初果期。均匀喷洒花穗或果穗及其附近葡萄叶背面。
(6)使用量：15kg/亩。
(7)调查方法：每个处理随机抽取50株花穗，调查记录发病穗数及病级，计算病情指数和防效。
(8)病情分级方法：
0级：花穗无病斑；
1级：花穗初现零星小病斑；
2级：病斑占花穗1/4以下；
3级：病斑占花穗1/4-1/2；
4级：病斑占花穗1/2以上。
(9)药效计算方法：
调查数据及药效计算结果见表4。
表4调查数据及药效计算结果
由表4结果可以看出，本发明实施例3技术方案制得的枯草芽孢杆菌控释剂的药效原高于目前常用的农药，病情指数为21.5，远远低于其他处理。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的较为简单，相关之处参见方法部分说明即可。
本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.一种枯草芽孢杆菌控释剂，其特征在于，包括如下质量份数的组分：载体1-5份、囊壁材料5-10份、枯草芽孢杆菌发酵液10-20份；
所述载体为活性炭、高岭土、硅藻土、白炭黑中的一种或多种；
所述囊壁材料为玉米淀粉、海藻酸钠、琼脂、阿拉伯树胶、麦芽糊精中的一种或多种；
所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌HU2012，保藏在中国典型微生物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2015206。
2.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌控释剂，其特征在于，包括如下质量份数的组分：载体3份、囊壁材料7份、枯草芽孢杆菌发酵液15份。
3.如权利要求1-2任一所述的一种枯草芽孢杆菌控释剂的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：
(1)枯草芽孢杆菌的培养：
将活化的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中发酵制备种子液，之后将制得的种子液接种到发酵罐中制备枯草芽孢杆菌发酵液；
所述枯草芽孢杆菌发酵液中包含枯草芽孢杆菌菌体和代谢产物，所述代谢产物包括酶类、脂肪酸、环二肽、环多肽、维生素；
(2)囊壁材料溶液的制备：将囊壁材料配制成浓度为3-5％的囊壁材料溶液，灭菌备用；
(3)载体吸附：将载体与步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌发酵液混合均匀，在恒温摇床中，以转速120rpm震荡培养1-3h；
(4)喷雾干燥：步骤(3)震荡培养完成后，加入步骤(2)制备的囊壁材料溶液混匀，将混合液进行喷雾干燥，控制进风温度120-150℃，进样流量700-800ml/h，喷雾压力0.1-0.3MPa。
4.如权利要求3所述的一种枯草芽孢杆菌控释剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的发酵制备种子液，发酵温度35-40℃，发酵时间12-36h；
所述种子培养基包含如下质量份数的组分：马铃薯水煎液200-300份、葡萄糖10-20份，加水配制至1000份，并调节pH值至7.0。
5.如权利要求3所述的一种枯草芽孢杆菌控释剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的制备枯草芽孢杆菌发酵液，种子液接种量为发酵培养基体积的1-5％，发酵罐压力为0.05-0.25MPa，发酵温度为25-35℃，发酵时间24-48h。
6.如权利要求3所述的一种枯草芽孢杆菌控释剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中制备的枯草芽孢杆菌发酵液的菌含量为7×108-9×108cfu/ml。
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