CN111500489A - 一株凝结芽孢杆菌及其在茶叶种植上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体公开了一株凝结芽孢杆菌及其在茶叶种植上的应用，本发明公开的凝结芽孢杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020066。该菌株生长速度快，具有较强的吲哚乙酸产生能力，能快速发酵土豆淀粉废水转化为微生物叶面肥产品，同时具备茶树定殖能力，该叶面肥产品应用与茶树喷施，能能提高茶叶百芽鲜重、绿茶提取物和茶多酚含量。

Description

一株凝结芽孢杆菌及其在茶叶种植上的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种凝结芽孢杆菌及其在茶叶种植中的应用。

背景技术

叶面施肥是将作物所需养分以溶液喷雾方式直接喷施于作物叶片表面，作物通过叶面以渗透扩散方式吸收养分并输送到作物体内各部分，以满足作物体生长发育所需。它是作物获取养分的辅助方式。在农业生产实践中，常常有作物表现出对养分需求的迫切性，但通过土壤施肥却往往达不到预期效果或不能及时满足作物所需，而通过叶面施肥则往往能取得良好的效果，可表现出比土壤施肥更大的优越性。

茶树叶片能有选择地吸收吸附在叶表,并能进入叶片细胞的营养物质。叶片吸收的营养物质,主要通过叶片表面角质层化合物分子间隙向内渗透进人叶片细胞。这些物质进入细胞后,同根部吸收的营养物质一样被同化。近几年来,茶叶叶面施肥已日渐普及,随着叶面肥的广泛使用,商品叶面肥品种也日渐丰富。根据叶面肥的作用和功能,可将其分为营养型、调节型、生物型、复合型叶面肥四大类。其中，生物型叶面肥通常通过功能微生物发酵生产，产品富含微生物体及代谢物，如氨基酸、核苷酸、核酸类物质。主要功能是刺激作物生长，促进作物代谢，减轻和防止病虫害的发生等。据报道，生产菌株有圆褐固氮菌、胶冻样类芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌等。另有中国科学院建成(大连)农业技术有限公司开发的“中科绿宝一号”生物叶面肥，北京美澳生物科技有限公司生产“芽满楼”生物叶面肥，均未标明生产菌株和生产工艺。

综合目前的研究成果，大多数生物叶面肥采用传统微生物肥料菌株生产，并非茶叶种植专用，在实际应用中存在用量大、效果不理想等问题。寻求茶叶种植叶面肥专用高效的微生物菌株已然成为目前亟待解决的问题之一。

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，分类学上属于芽孢杆菌属，细胞呈杆状，革兰氏阳性菌，端生芽孢，无鞭毛。分解糖类生成L-乳酸，为同型乳酸发酵菌。最适生长温度为45-50℃，最适pH为6.6-7.0。具公开文献，凝结芽孢杆菌能产乳酸，作为益生菌株可以用于人类腹泻药物和动物微生物饲料添加剂，目前还未见将其用于茶叶种植上的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株可用于茶叶种植的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)，保藏编号为CCTCC NO：M2020066。

本发明的另一个目的在于提供了凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)B06在制备叶面肥中的应用，利用该菌株发酵生产的叶面肥能能提高茶叶鲜重、绿茶提取物和茶多酚含量。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，通过以下方法筛选得到：

1)从华中农业大学茶园采集多份茶树根部土壤，从土壤中挑选到一株IAA高产菌株，通过生理生化及16S rRNA基因序列鉴定为凝结芽孢杆菌。以此为出发菌株再经过常压室温等离子体诱变筛选获得一株IAA高产的凝结芽孢杆菌B06。

2)该菌株于2020年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，分类命名：凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans B06，保藏号为CCTCC NO：M2020066，地址：中国武汉武汉大学。

菌株B06具有典型的凝结芽孢杆菌特征：该菌株在MRS培养基上生长良好，48h形成直径2-3mm大小的圆形菌落，白色而有光泽，表面湿润、平坦，边缘整齐。革兰氏染色，油镜观察，菌株B06菌体形态为杆状，革兰氏阳性，单个、成对或链状排列，芽孢端生。

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)B06在制备叶面肥中的应用，包括利用本发明提供的B06菌株对淀粉废水发酵；

以上所述的应用中，优选的，所述的淀粉废水为植物农作物淀粉废水，如玉米、马铃薯、小麦、大米等淀粉废水；

以上所述的应用中，优选的，是将培养的凝结芽孢杆菌B06种子液按3-7％(V/V)的接种量接种灭菌处理后的土豆淀粉废水，28-37℃培养48-72h，即得叶面肥产品。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明提供了一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)B06。该菌株生长速度快，产酸能力强，同时分泌大量吲哚乙酸，能将土豆淀粉废水发酵转化为叶面肥产品。该产品应用于茶叶喷施，能提高茶叶百芽鲜重、绿茶提取物和茶多酚含量。

该菌株能以在土豆淀粉废水中良好生长，将其转化为液体肥产品，变废为宝，具有广阔的应用前景和推广应用的潜力。

本发明的菌株具有茶叶叶面定向定殖能力，可延长其生化效应。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

凝结芽孢杆菌B06的筛选：

1)高产IAA的野生菌的筛选

培养基：

MRS液体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，牛肉浸粉10g/L，柠檬酸二铵2g/L，醋酸钠5g/L，吐温80 1g/L，磷酸氢二钾2g/L，pH6.5。

YPD液体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，pH自然。

固体培养基在液体培养基的基础上添加1.5％的琼脂，所有培养基115℃灭菌20min。

从华中农业大学茶园采集多份茶树根部土壤，取1g土样至MRS培养基中，37℃静置培养7d，80℃水浴15min，后取0.1ml转接MRS培养基固体平板，37℃培养。待菌落长出，随机挑取菌落，纯化，编号并保存。菌株转接YPD液体培养基37℃培养24h，测定发酵液中吲哚乙酸(IAA)的含量，挑选到一株IAA高产菌株，含量可达96.2mg/L。

通过生理生化及16S rRNA基因序列鉴定，该菌株16S rRNA基因与凝结芽孢杆菌相似性为99％，最终鉴定为凝结芽孢杆菌。

2)常压室温等离子体诱变选育凝结芽孢杆菌B06：

利用常压室温等离子体(ARTP)诱变仪对菌种进行诱变。诱变时的工作气体为氦气。按照处理功率100W，氦气流量12L/min，样品与等离子体发生器出口距离2mm，操作温度在25～35℃，每个金属载片上均匀涂布10μL的孢子菌悬液，分别按30、60、90、120、 150、180、210、240、270s不同的诱变照射时间来处理芽孢悬浮液，诱变后将金属载片置于装有1mL无菌生理盐水的EP管中，振荡悬浮，每个处理时间分别做10^-1、10^-2、10^-3三个稀释度进行涂板，每个稀释度涂3个平板，37℃培养2d后进行计数，通过菌落形成单位 (colony-forming units，CFU)来计算致死率、正突变率。对曲线数据进行分析，以正突变率最高的时间点作为最佳诱变时间点进行后续诱变处理，测定发酵液中的IAA含量。

经过3轮筛选，获得一株IAA高产菌株Bacillus coagulansB06，YPD液体培养基37℃培养24h发酵液中吲哚乙酸(IAA)的含量可达118.5mg/L，与出发菌株相比提高了23.2％。菌株经5代传代培养，IAA产量稳定。该菌株于2020年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，分类命名：凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans B06，保藏号为CCTCC NO：M2020066，地址：中国武汉武汉大学。

菌株B06特征：该菌株在MRS培养基上生长良好，48h形成直径2-3mm大小的圆形菌落，白色而有光泽，表面湿润、平坦，边缘整齐。革兰氏染色，油镜观察，菌株B06菌体形态为杆状，革兰氏阳性，单个、成对或链状排列，芽孢端生。

实施例2：

凝结芽孢杆菌B06在茶树叶片定向定殖能力的检测：

(1)抗利福平标记菌株的诱导与培养：首先测定B06菌株对利福平的敏感浓度为0.009 g/L，然后配制利福平浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.08、0.16和0.32g/L的YPD培养基及相应的YPD平板，接下来采用含利福平的YPD液体培养基梯度与平板梯度交替培养法对B06菌株进行诱导与培养，最终获得抗利福平标记菌株B06-r，该菌株可在0.32g/L的利福平的YPD培养基中正常生长，该菌株经检测除具有利福平抗性外，其余生理生化特性与 B06无显著性差异。

(2)B06-r在茶树和莴苣叶面的定殖及其数量检测：将活菌量为4.8×10⁷CFU/mL的菌悬液。B06-r菌悬液均匀喷施于茶树和莴苣叶面，分别于1、3、7、11、15、17和20d取样回收，采样按五点取样法，然后随机取20片，用直径为1cm的无菌打孔器取叶片组织块，称取其中10g叶片组织块放入含有90mL无菌水的三角瓶中(在瓶中加入玻璃珠)，150r/min 摇床振荡30min后，用无菌水对菌悬液做梯度稀释，每处理设3个重复。采用有0.32g/L 的利福平YPD琼脂平板系列稀释法测定菌数。

试验在华中农业大学校内茶园和蔬菜试验基地进行，喷施含抗利福平标记菌株B06-r 菌液后15d内，平均每天气温15-28℃，风力1-2级，其间无降雨。从表1结果可知，1-15d，B06菌株表现出在茶树叶片上良好的定殖能力，菌数先上升再缓慢下降。18d时有明显降雨，菌量大幅下降至＜10⁵CFU/g成熟叶。而在莴苣叶片上，B06菌株菌数持续快速下降，15d时菌数低于10⁴CFU/g成熟叶，可能是由于莴苣叶片环境或代谢物不适合该菌株生长。综上所述，B06菌株能在茶树叶面上定向定殖，定殖时间长达15d以上。

表1菌株B06在植物叶片上的定殖动态

实施例3：

凝结芽孢杆菌B06叶面肥的发酵：

将在YPD液体培养基中生长了24h的凝结芽孢杆菌B06种子液按5％(V/V)的接种量接种121℃灭菌30min处理后的土豆淀粉废水，37℃培养48h，用NaOH调整其pH到6.0，测定其成分如下表2所示。

表2土豆淀粉废水发酵前后成分测定表

实施例4：

凝结芽孢杆菌叶面肥在茶叶上的应用：

应用试验在华中农业大学茶学试验基地完成，试验茶园总面积为1000m²，全部为平地，坡度小于5°，茶树生长一致，茶园四周没有严重植被和山体遮挡。茶树品种为当地群体种 (有性系)，树龄20年左右，群体种均为中叶种，播种时间一致，且试验茶园往年(至种植以来)的水肥管理和采摘模式均相同。

试验共设2个处理，即喷施灭菌土豆淀粉废水(实施例3中未发酵的土豆淀粉废水稀释50倍，喷施液中活菌数为0，IAA含量为0)和喷施叶面肥(实施例3中制得的叶面肥稀释50倍，最终喷施液中的凝结芽孢杆菌B06活菌数的终浓度为0.5×10⁷CFU/mL，IAA终浓度为0.33mg/L)1次。各处理于2019年3月2日在试验区进行喷施，用细嘴喷雾器将灭菌土豆淀粉废水或叶面肥均匀喷撒于茶树叶片正反面，直至叶面有液滴下流为度。每个处理设3 次重复(以1行为1个小区)，随机排列，每个小区之间均间隔2m设置保护区，共计9 个试验小区。

百芽质量采用33cm×33cm样框调查，每个小区3个重复样框调查。产量按照生产模式计重测算。茶树新梢样品采用微波炉杀青固样，烘箱80℃烘干后研磨成茶粉低温干燥储藏直至分析检测。茶叶茶多酚总量、绿茶提取物含量的测定均参照国标方法。

表3不同处理对茶叶百芽质量的影响

组别	喷施后1周(g)	喷施后2周(g)
			实验组	21	28.5
对照组	19	23

由表3可知，喷施叶面肥的春茶百叶重高于对照组，喷施两周百叶重提高23.9％，可以有效提高春茶产量。

表4不同处理对绿茶提取物的影响

组别	喷施后1周(％)	喷施后2周(％)
			实验组	36.5	41.5
对照组	32	37

由表4表5可知，喷施叶面肥的春茶绿茶提取物和茶多酚含量均高于对照组，喷施两周绿茶提取物含量提高12.2％，茶多酚含量提高16.6％，可以有效提高春茶品质。

表5不同处理对茶多酚含量的影响

组别	喷施后1周(％)	喷施后2周(％)
			实验组	22.5	24.6
对照组	16.3	21.1

Claims (4)

1.一株分离的凝结芽孢杆菌，所述的凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌凝结芽孢杆菌B06（Bacillus coagulans），保藏编号为CCTCC NO：M2020066。

2.权利要求1所述的凝结芽孢杆菌在制备茶树叶面肥中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，所述的茶树叶面肥是利用权利要求1所述的凝结芽孢杆菌发酵淀粉废水获得。

4.根据权利要求3所述的应用，应用过程是：将培养的凝结芽孢杆菌B06种子液按3-7%（V/V）的接种量接种灭菌处理后的土豆淀粉废水，28-37℃培养48-72 h，即得叶面肥产品。