CN104263677A

CN104263677A - 一种复合微生物拌种剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104263677A
Application number: CN201410442481.1A
Authority: CN
Inventors: 李友国; 陈龙男
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2014-09-02
Filing date: 2014-09-02
Publication date: 2015-01-07
Anticipated expiration: 2034-09-02
Also published as: CN104263677B

Abstract

本发明公开了一种复合微生物拌种剂及其制备方法和应用，复合微生物拌种剂由费氏中华根瘤菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌及草炭复配而成。具有固氮、溶磷、解钾、分解纤维素和淀粉、产生植物生长激素、抗病等作用；还具有抗逆性的功能，彼此之间相容性好，培养条件容易控制等特点；可将该复合微生物拌种剂与种子一起拌匀、播种，复合肥作为基肥使用，以减少复合肥的使用，具有较高的市场价值。

Description

一种复合微生物拌种剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种复合微生物拌种剂，具体涉及一种对作物具有促生和抗病作用的复合微生物拌种剂及其制备方法，属于农用微生物菌剂技术领域。

背景技术

20世纪90年代后期，农用微生物菌剂已形成由单一菌种向复合菌种转化，由单一功能向多功能转化，由无芽孢菌种向芽孢菌种转化等趋势。现有农用微生物菌剂主要包括：根瘤菌及固氮菌剂、解磷细(真)菌菌剂、硅酸盐菌剂、促生菌剂、有机物料(秸秆)腐熟剂、放线菌菌剂、光合细菌菌剂、菌根真菌制剂、厌氧菌制剂、土壤(水体)修复剂等。

PGPR(plant growth promoting rhizobacteria,植物根际促生菌)是一类生活于植物根际，能促进植物生长和防治病虫害的有益微生物群。作用机理多样，可以概括为：A.分泌植物促生物质。如IAA、细胞分裂素、赤霉素、ACC脱氨酶等。B.改善植物根际的营养环境。PGPR在植物根际聚集，旺盛的代谢作用加强了土壤中有机物的分解，促进了植物对磷、钾等元素的吸收。C.对作物病害的生物控制作用。主要通过产生抗生素、水解酶、铁载体等物质，和信号干扰、诱导系统抗性、竞争营养和生态位、捕食寄生、解毒等作用来实现。D.对污染物的降解。主要是对三氯乙烯、芳香族化合物及除草剂的降解作用。E.对豆科植物结瘤的促生作用。某些PGPR菌的存在，可促进根瘤菌在豆科植物结瘤数量及瘤干重的增加。PGPR在近些年已成为研制和开发的热点，也已出现以促生、营养和抗病作用为主的PGPR微生物制剂。

最新研究发现，根瘤菌可侵入非豆科植物根内，以内生菌形式定殖于根的皮层细胞、细胞间隙及维管束中，具有促进植物生长和提高产量的作用。其机制是根瘤菌分泌植物生长素IAA刺激根发生变化，根的结构改变使作物增加了对土壤中氮和其它营养物质的摄取，或是产生胞外酸性化的磷酸酶(植酸酶)溶解了不溶性磷酸复合物，提高了植物对磷有效利用，以及提高了植株的抗性或加强叶的光合作用等。根瘤菌接种水稻、油菜、燕麦、玉米、马铃薯、棉花等作物已见报道。

但是，PGPR与根瘤菌混合接种非豆科植物，混合复合肥使用的专用拌种剂却未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种复合微生物拌种剂，包括费氏中华根瘤菌HN01、凝结芽孢杆菌LN1、地衣芽孢杆菌LN6、短小芽孢杆菌LN7和解淀粉芽孢杆菌LN9，该拌种剂具有对作物的促生作用，兼具抗病的功能。

本发明的另一目的是一种复合微生物拌种剂的制备方法，方法简便，易行，适于大规模生产。

本发明最后一个目的在于提供一种复合微生物拌种剂的应用，包括在对作物促生长中的应用和在作物抗病方面的应用。

本发明的目的是通过如下技术方案来实现的：

一种复合微生物拌种剂，它由以下组分按重量份混合而成：

所述的微量元素液的配方为：H₃BO₃5g，Na₂MoO₄5g，水1000ml。

以上所用菌剂均为菌液，其中费氏中华根瘤菌HN01菌液中有效菌含量为1×10⁸-15×10⁸cfu/g；凝结芽孢杆菌LN1菌液中有效菌含量为0.6×10⁸-9×10⁸cfu/g；地衣芽孢杆LN6菌液中有效菌含量为0.2×10⁸-3×10⁸cfu/g；短小芽孢杆菌LN7菌液中有效菌含量为0.8×10⁸-12×10⁸cfu/g；解淀粉芽孢杆菌LN9菌液中有效菌含量为0.3×10⁸–4.5×10⁸cfu/g。

所述的费氏中华根瘤菌Sinorhizobium fredii HN01，参考(莫才清，覃雅丽，周俊初，李阜棣；应用发光酶基因对快生型大豆根瘤菌HN01结瘤作用进行检测[J]；微生物学报；1998年03期)。

所述的凝结芽孢杆菌LN1，分类命名：凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans LN1，CCTCCNO：M 2014223，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏时间：2014年5月23日。

所述的地衣芽孢杆菌LN6，分类命名：地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis LN6，CCTCCNO：M 2014224，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏时间：2014年5月23日。

所述的短小芽孢杆菌LN7，分类命名：短小芽孢杆菌Bacillus pumulis LN7，CCTCC NO：M 2014225,保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏时间：2014年5月23日。

所述的解淀粉芽孢杆菌LN9，分类命名：解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens LN9，CCTCC NO：M 2014226，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏时间：2014年5月23日。

所述的草炭为市售原料。

一种复合微生物拌种剂，它由以下组分按重量份混合而成(最佳配比)：

如上所述复合微生物拌种剂的制备方法，可购买菌株和原料，通过常规的发酵方法发酵后混合制成。

一种复合微生物拌种剂的应用，其应用过程如下：

将该复合微生物拌种剂(5公斤/亩)与种子(种子的用量为常规的标准播种量)一起拌匀、播种，复合肥(30公斤/亩)作为基肥使用，优选用于非豆科植物。

具体的，将制备的复合微生物拌种剂(5公斤/亩)与小麦种子(10-15公斤/亩)一起拌匀、播种，复合肥(30公斤/亩)作为基肥使用。

将制备的复合微生物拌种剂(5公斤/亩)与玉米种子(0.5-1公斤/亩)，一起拌匀、播种，复合肥(30公斤/亩)作为基肥使用。

将制备的复合微生物拌种剂(5公斤/亩)与油菜种子(0.05-0.1公斤/亩)。一起拌匀、播种，复合肥(30公斤/亩)作为基肥使用。

拌种具体为，在荫凉处将接种剂倒在干净的盆内，加干种子重量的3-7％水，调成糊状后，倒在种子上反复拌匀，要求拌菌后的种子湿润爽手，荫干后即可播种，当天播完。

本发明中所用的费氏中华根瘤菌HN01为快生型大豆根瘤菌，生长速度快，既具有与豆科植物共生固氮的作用，又具有对非豆科植物的促生作用。

本发明中所用的凝结芽孢杆菌LN1(CCTCC NO.M 2014223)具有产生生长激素IAA的作用，并且具有分解淀粉、纤维素，解钾，分解有机磷的能力。

本发明中所用的地衣芽孢杆菌LN6(CCTCC NO.M 2014224)具有产生生长激素IAA的作用，并且具有分解淀粉、纤维素，解钾，分解无机磷和有机磷的能力。

本发明中所用的短小芽孢杆菌LN7(CCTCC NO.M 2014225)具有产生生长激素IAA的作用，并且具有分解淀粉、纤维素，分解有机磷的能力。

本发明中所用的解淀粉芽孢杆菌LN9(CCTCC NO.M 2014226)具有分解淀粉、纤维素、有机磷作用，并且具有抑制植物病原真菌生长能力。

本发明中所用的草炭：pH值中性、无毒、质轻、具有良好的团粒结构、通气性好、吸附性能强、持水保肥，有利于微生物活动，增强生物性能，营养丰富，既是栽培基质，又是良好的土壤调解剂，并富含的有机质，腐殖酸及其它营养成份。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明的复合微生物拌种剂有费氏中华根瘤菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌及草炭复配而成。具有固氮、溶磷、解钾、分解纤维素和淀粉、产生植物生长激素、抗病等作用；还具有抗逆性强，彼此之间相容性好，培养条件容易控制等特点；可将该复合微生物拌种剂与种子一起拌匀、播种，复合肥作为基肥使用，以减少复合肥的使用，具有较高的市场价值。

具体实施方式

本发明技术方案中，所述试剂，如未特别说明，均购自生化商店，所述技术方案如未特别说明，均为本领域的常规技术。

实施例1：

凝结芽孢杆菌LN1的分离鉴定：

申请人从华中农业大学试验农场的植物根际分离、筛选、鉴定得到，并于2014年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans LN1，保藏号为CCTCC NO：M 2014223。

凝结芽孢杆菌LN1为杆状细胞、形成中生、椭圆芽孢、芽孢囊不膨大，菌落黄色、湿润粘稠、隆起、边缘整齐，革兰氏染色阳性，过氧化氢酶试验阳性、VP试验阳性、VP反应最终pH 4.4，淀粉水解反应阳性、硝酸盐还原反应阳性、柠檬酸盐利用反应阳性、可在pH 5.7条件下生长、7％NaCl中不能生长，参照伯杰氏细菌手册(第八版)该菌符合凝结芽孢杆菌生理生化特征，确定为凝结芽孢杆菌。

分泌生长激素IAA的浓度为11.5μg/ml，分泌α-淀粉酶活力0.864U/ml，分泌纤维素酶活力53.118U/ml，与对照组相比，速效钾相对增加量11.11％，可溶性有机磷含量增加0.15mg/L。

菌株产生IAA量的测定(以下同)：

1)标准曲线的制作：配置浓度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg/ml的IAA标准溶液，并按体积比1:1与R1试剂混合，室温避光放置30min,然后分别测定各浓度的OD₅₃₀(以蒸馏水与R1试剂的1：1混合溶液为空白对照)。最后以IAA浓度为横坐标，OD₅₃₀为纵坐标作图，即得到IAA标准曲线。

2)菌液中IAA浓度的测定：活化待测菌株，接种于LB液体培养基中，在3、6、9、12、15、18、20、22、24h分别取出一瓶，4000r/min离心15min,然后各取上清液2ml与等体积的R1试剂混合。室温下避光放置30min,测定其OD530值(以未接菌的LB液体培养基与等体积R1试剂的混合溶液为对照)。通过IAA浓度与OD530的标准关系曲线计算相应的IAA浓度。

菌株α-淀粉酶活力的测定(DNS法)(以下同)：

酶液制备

挑取一环菌于5ml牛肉膏蛋白胨培养基中，37度，培养12h，作为一级种子液。取0.5ml一级种子液于5ml牛肉膏蛋白胨培养基中，37度，培养12h，作为二级种子液。以4％接种量接种于装有100ml 1号检测培养基的500ml三角瓶中，37度，220r/min，培养72h。4000r/min离心5min，取上清液。预留一瓶不接菌的培养基，离心取上清做对照。每株菌两个重复。

标准曲线绘制

取6支干净的具塞刻度25ml比色管，编号1-6，分别加入标准麦芽糖溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml；蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml；DNS试剂各2ml。混匀，置沸水浴中煮沸5min(沸水浴时不要加塞)。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至25ml。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定吸光度。以麦芽糖含量(mg)为横坐标，吸光度(OD)为纵坐标，绘制标准曲线。

样品测定

取1ml上清液(可考虑稀释10倍)，40度水浴保温5min，加入1.0ml 1％淀粉溶液(预先40度水浴保温5min)，40度水浴保温10min，加入2.0ml DNS，沸水浴5min，冷却定容至25ml，在540nm波长下，以对照组为参比调零点，测定吸光度。

结果计算

α-淀粉酶活力(U/ml)＝麦芽糖生产量(mg)×N/10

N—酶液稀释倍数

10—反应时间

菌株纤维素酶活的测定(滤纸法)(以下同)：

酶液制备

挑取一环菌于5ml牛肉膏蛋白胨培养基中，37度，培养12h，作为一级种子液。取0.5ml一级种子液于5ml牛肉膏蛋白胨培养基中，37度，培养12h，作为二级种子液。以4％接种量接种于装有100ml牛肉膏蛋白胨培养基的500ml三角瓶中，37度，220r/min，培养72h。取培养液5ml于三角瓶中，加入一定体积的柠檬酸盐缓冲液，200r/min，培养30min。5000r/min离心10min，取上清液。(推荐用柠檬酸盐缓冲液做适当稀释，浓度范围：酶活力7U/ml～32U/ml)

标准曲线绘制

分别取葡萄糖标准溶液0、2、3、4、6、8、10ml，用柠檬酸盐缓冲液溶解并定容至50ml，配成浓度为0、400、600、800、1200、1600、2000ug/ml的葡萄糖标准溶液。

分别取上述溶液各1ml于25ml具塞比色管中，各加2ml水、2ml DNS试剂，沸水浴5min。冷却至室温，加水定容至25ml。在540nm波长下，以0ug/ml葡萄糖标准溶液为空白对照调零点，测定吸光度。以吸光度为横坐标，标准葡萄糖溶液浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

样品测定

吸取10ml酶液，50度水浴10min。

在25ml具塞比色管中加入滤纸条(对称剪成32片全部放人)，加1ml柠檬酸盐缓冲液，50度水浴10min。再依次加入2.0ml DNS试剂、0.5ml酶液、5.0ml水，50度水浴60min，再沸水浴5min，冷却至室温，加水定容至25ml。在540nm波长下，以0ug/ml葡萄糖标准溶液为空白对照调零点，测定吸光度A1。

在25ml具塞比色管中加入滤纸条(对称剪成32片全部放人)，加1ml柠檬酸盐缓冲液，50度水浴10min。再依次加入0.5ml酶液、5.0ml水，50度水浴60min。加入2.0ml DNS试剂，再沸水浴5min，冷却至室温，加水定容至25ml。在540nm波长下，以0ug/ml葡萄糖标准溶液为空白对照调零点，测定吸光度A2。

结果计算

纤维素酶活力(U/ml)＝[(A₂-A₁)×K+b]×D/t

A₂—酶空白样的吸光度

A₁—酶反应样的吸光度

K—标准曲线的斜率

b—标准曲线的截距

D—试样的总稀释倍数

t—反应时间(min)

菌株解钾能力的测定(以下同)：

钾矿石处理

钾矿石粉用20％HCl溶液淋洗(酸洗，洗去速效钾和缓效钾)，再用蒸馏水淋洗至中性。样品制备

挑取一环活化好的斜面菌种接入50ml 2号检测培养基中，150r/min，37度培养至对数期(菌体含量不少于2×108CFU/ml)。取5ml上述菌液，加入装有95ml 3号检测培养基的500ml三角瓶中，28度，150r/min，培养7天(加入等量灭活菌液的3号检测培养基为对照)。将上述菌液转入蒸发皿中，在水浴锅中浓缩至10ml左右，加2.0ml H2O2溶液，继续蒸发，并不断搅动，反复加20％H2O2溶液几次至粘性物质完全消化。3500r/min离心10min，将上清液收集在50ml容量瓶中，用蒸馏水定容。

标准曲线绘制

吸取钾标准溶液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，7.50，10.00ml分别置于8个50ml容量瓶中。加10.00ml硝酸溶液，用水定容，即制成钾浓度为0.00，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00，15.00，20.00μg/ml的标准溶液。在火焰光度计上用空白溶液调零，以最高浓度的标准溶液调节仪器满刻度至80分度处，测量其他标准溶液，根据钾浓度和仪器读数绘制标准曲线。

样品测定

吸取试样5.00ml于150ml三角瓶中，加人50.0ml硝酸溶液(样液比为1:10)，盖上表面皿或插上小漏斗，在电炉上微煮沸10min，趁热过滤入250ml容量瓶中，用热水洗涤4～5次，冷却后用水定容，此溶液直接用火焰光度计测定。

结果计算

速效钾相对增加量(％)＝(P₁-P₀)×100/P₀

P₁—实验组样品中速效钾的含量(mg/L)

P₀—对照组样品中速效钾的含量(mg/L)

菌株解磷能力的测定(以下同)：

样品制备

挑取一环菌于5ml牛肉膏蛋白胨培养基中，37度，培养12h，作为一级种子液。取0.5ml一级种子液于5ml牛肉膏蛋白胨培养基中，37度，培养12h，作为二级种子液。以4％接种量接种于装有100ml牛肉膏蛋白胨培养基的500ml三角瓶中，37度，220r/min，培养72h(以加入等量无菌水的牛肉膏蛋白胨培养基为空白对照)。

标准曲线绘制

分别吸取磷标准溶液0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml于50ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至30ml，加二硝基酚指示剂2滴，用氢氧化钠溶液或稀硫酸溶液调节pH至溶液刚呈微黄色。加入钼锑抗显色剂5ml，摇匀，定容，即得磷浓度0.0mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L、0.6mg/L的标准溶液。室温下静置30min，在700nm波长下，以0.0mg/L标准溶液为空白对照调零点，测定吸光度。以吸光度为纵坐标，磷浓度为横坐标，绘制标准曲线。

样品测定

将样品4000r/min离心20min，吸取上清液5～10ml于50ml容量瓶中，加水稀释至30ml，加二硝基酚指示剂2滴，用氢氧化钠溶液或稀硫酸溶液调节pH至溶液刚呈微黄色。然后加入钼锑抗显色剂5ml，摇匀，定容。室温下静置30min，在700nm波长下，以空白试液作参比调零点，测定吸光度。

结果计算

培养液中磷的含量(mg/L)＝(P×V₁×K)/V₂

P—标准曲线查得磷的浓度(mg/L)

K—稀释倍数

V₁—显色液体积(ml)

V₂—吸取上清液体积(ml)

地衣芽孢杆菌LN6的分离鉴定：

申请人从华中农业大学试验农场的植物根际分离、筛选、鉴定得到，并于2014年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis LN6，保藏号为CCTCC NO：M 2014224。

地衣芽孢杆菌LN6为杆状细胞、形成近中生、柱状芽孢、芽孢囊不膨大，菌落白色、干燥、隆起、边缘不整齐，革兰氏染色阳性，过氧化氢酶试验阳性、VP试验阳性、VP反应最终pH 5.4，淀粉水解反应阳性、硝酸盐还原反应阳性、柠檬酸盐利用反应阳性、可在pH 5.7条件下生长、可在7％NaCl中生长，参照伯杰氏细菌手册(第八版)该菌符合地衣芽孢杆菌生理生化特征，确定为地衣芽孢杆菌。

分泌生长激素IAA的浓度为2.40μg/ml，分泌α-淀粉酶活力0.695U/ml，分泌纤维素酶活力55.593U/ml，与对照组相比，速效钾相对增加量7.41％，可溶性无机磷含量增加0.015mg/L，可溶性有机磷含量增加0.03mg/L。

短小芽孢杆菌LN7的分离鉴定：

申请人从华中农业大学试验农场的植物根际分离、筛选、鉴定得到，并于2014年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，短小芽孢杆菌Bacillus pumulis LN7，保藏号为CCTCCNO：M 2014225。

短小芽孢杆菌LN7杆状细胞、形成中生、椭圆芽孢、芽孢囊不膨大，菌落略带黄色、干燥、扁平、边缘整齐，革兰氏染色阳性，过氧化氢酶试验阳性、VP试验阳性、VP反应最终pH 5.4，淀粉水解反应阴性、硝酸盐还原反应阴性、柠檬酸盐利用反应阳性、可在pH 5.7条件下生长、可在7％NaCl中生长，参照伯杰氏细菌手册(第八版)该菌符合短小芽孢杆菌生理生化特征，确定为短小芽孢杆菌。

分泌生长激素IAA的浓度为3.54μg/ml，分泌α-淀粉酶活力0.087U/ml，分泌纤维素酶活力65.141U/ml，与对照组相比，可溶性有机磷含量增加0.03mg/L。

解淀粉芽孢杆菌LN9的分离鉴定：

申请人从华中农业大学试验农场的植物根际分离、筛选、鉴定得到，并于2014年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens LN9，保藏号为CCTCC NO：M 2014226。

解淀粉芽孢杆菌LN9杆状细胞、形成中生、椭圆芽孢、芽孢囊不膨大，菌落白色、干燥、隆起、边缘整齐。将其16SrRNA基因进行克隆测序，结果在NCBI进行Blast比较，确定LN9为解淀粉芽孢杆菌。

所述的解淀粉芽孢杆菌LN9可以有效抑制14种常见植物病原真菌生长。包括：拟盘菌，核盘菌，纹枯菌，稻瘟菌，棉花枯萎菌，叶枯丝核菌，尖孢镰刀菌，小麦赤霉，甜瓜枯萎菌，草莓灰霉，柿子黄萎病病原菌，玉米小斑病病原菌，苹果轮纹病病原菌，甘蔗凤梨病病原菌。

计算抑制率的实验过程具体如下：

LB平板中心接种真菌菌块，在距平板中心2.5cm处对称放置4张小滤纸圆片，每张纸片上滴加5ul解淀粉芽孢杆菌LN9菌液，重复2个平皿；对照为LB琼脂平板小滤纸圆片上滴加5ul无菌水。28度培养，待对照组真菌长满平板或长至纸片时取出平板，测量真菌直径。

抑菌率(％)＝[1-(实验组真菌直径/对照组真菌直径)]×100

病原真菌	抑菌率(％)
		尖孢镰刀菌	44.58
核盘菌	81.25
		甘蔗凤梨病病原菌	62.13
苹果轮纹病病原菌	61.76
		玉米小斑病病原菌	62.68
甜瓜枯萎病	56.25
		小麦赤霉	45.63
棉花枯萎菌	61.86
		稻瘟病	62.5
纹枯病	53.87
		柿子黄萎病病原菌	51.56
叶枯丝核菌	38.13
		草莓灰霉	34.21
拟盘菌	46.3

实施例2：

一种复合微生物拌种剂，其制备步骤如下：

凝结芽孢杆菌LN1、地衣芽孢杆菌LN6、短小芽孢杆菌LN7、解淀粉芽孢杆菌LN9菌液的制备：接种于种子培养基中，37度培养12小时为1级种子液，1级种子液转接于种子培养基中，37度培养12小时为2级种子液。2级种子液接种于发酵培养基中，37度，接种量4％，装液量25/50L，压力0.05-0.1MPa，起始转速220r/min，起始pH 7，起始空气流量1L/min，实时消泡和控制溶氧在30％以上，发酵结束时间24小时。

种子培养基：牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，水1000ml，pH 7.4-7.6)

发酵培养基：

凝结芽孢杆菌LN1、地衣芽孢杆菌LN6：玉米粉26g/L，豆粕12.5g/L，酵母粉2.7g/L，KH₂PO₄2.0g/L，MgSO₄0.5g/L，pH 7

短小芽孢杆菌LN7、解淀粉芽孢杆菌LN9：玉米粉20g/L，豆粕19.5g/L，酵母粉2.3g/L，KH₂PO₄1.8g/L，MgSO₄0.5g/L，pH 7

在线补加消泡剂：泡敌。

费氏中华根瘤菌HN01菌液的制备：

接种于种子培养基中，28度培养12小时为1级种子液，1级种子液转接于种子培养基中，28度培养12小时为2级种子液。2级种子液接种于发酵培养基中，28度，接种量4％，装液量25/50L，压力0.05-0.1MPa，起始转速220r/min，起始pH 7，起始空气流量1L/min，实时消泡和控制溶氧在50％以上，发酵结束时间24小时。种子培养基：TY培养基(蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，NaCl 5.0g，水1000ml，pH 7.0)

发酵培养基：BSE培养基[甘露醇(或蔗糖)10.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，K₂HPO₄0.5g，NaCl 0.1g，CaCl₂·5H₂O 0.1g，Rh微量元素液4ml，豆芽汁1000ml(500g豆芽+1500ml H₂O煮沸30分钟后用纱布过滤两次)，pH 6.8-7.0]

Rh微量元素液：H₃BO₃5g，Na₂MoO₄5g，水1000ml。

在线补加消泡剂：泡敌。

草炭的处理:

草炭为市售原料，去除草炭基质中明显的石块等大颗粒机械杂质，在布袋中湿热高压蒸汽灭菌1小时。灭菌前注意用手感检查一下草炭是否含一定水分，太干燥的草炭其灭菌的效果不理想，必要时在灭菌前可以加少量水于草炭中，用手混匀。但是载体基质又不能太潮湿，否则添加菌液时难以混合均匀，草炭的含水量灭菌后控制在<4％。

按比例称取各成分原料，具体如下：

以上所用菌剂均为菌液，其中费氏中华根瘤菌HN01菌液中有效菌含量为3×10⁸cfu/g；凝结芽孢杆菌LN1菌液中有效菌含量为1.8×10⁸cfu/g；地衣芽孢杆LN6菌液中有效菌含量为0.6×10⁸cfu/g；短小芽孢杆菌LN7菌液中有效菌含量为2.4×10⁸cfu/g；解淀粉芽孢杆菌LN9菌液中有效菌含量为0.9×10⁸cfu/g。

所述的费氏中华根瘤菌HN01Sinorhizobium fredii HN01，参考(莫才清，覃雅丽，周俊初，李阜棣；应用发光酶基因对快生型大豆根瘤菌HN01结瘤作用进行检测[J]；微生物学报；1998年03期)。

所述的凝结芽孢杆菌LN1，CCTCC NO：M 2014223。

所述的地衣芽孢杆LN6，CCTCC NO：M 2014224。

所述的短小芽孢杆菌LN7，CCTCC NO：M 2014225。

所述的解淀粉芽孢杆菌LN9，CCTCC NO：M 2014226。

所述的草炭为市售原料。

灭菌后的草炭置于一个大的塑料盆(洗干净，并用70％酒精消毒)中，将混合菌液体和微量元素液一起一次性加入草炭中，混匀，湿度为19％。要求混合均匀很重要，成品为松散的颗粒状，用于实施例3。

实施例3：

一种复合微生物拌种剂在对作物促生、抗病方面的应用，其应用过程如下：

在湖北枣阳武汉蔬菜所的试验基地，对油菜(品种为中油2号)、小麦(品种为河南9023)、玉米(品种为玉龙102)进行随机区组试验，每一个小区面积为20.25m²，按照以下5个处理施肥，每个处理重复3次。由武汉市蔬菜所人员，严格按照各个处理配方数量进行施肥和田间管理，并测定产量。

处理1：复合微生物拌种剂5公斤/亩分别与种子一起拌匀、播种，播种量：小麦12.5公斤/亩，玉米0.75公斤/亩，油菜0.075公斤/亩。

处理2：单施复合肥做基肥，50公斤/亩，播种量：小麦12.5公斤/亩，玉米0.75公斤/亩，油菜0.075公斤/亩。

处理3：单施复合肥做基肥，75公斤/亩，播种量：小麦12.5公斤/亩，玉米0.75公斤/亩，油菜0.075公斤/亩。

处理4：复合微生物拌种剂(3公斤/亩)分别与种子一起拌匀、播种，复合肥(50公斤/亩)做基肥。播种量：小麦12.5公斤/亩，玉米0.75公斤/亩，油菜0.075公斤/亩。

处理5：复合微生物拌种剂(5公斤/亩)分别与种子一起拌匀、播种，复合肥(30公斤/亩)做基肥。播种量：小麦12.5公斤/亩，玉米0.75公斤/亩，油菜0.075公斤/亩。

结果如下：

油菜籽产量(kg/hm²)：

小麦产量(kg/hm²)：

玉米产量(kg/hm²)：

从上述结果可见：处理5【复合微生物拌种剂(5公斤/亩)与种子一起拌匀、播种，复合肥(30公斤/亩)做基肥】产量最高，对比处理3(单施复合肥做基肥，75公斤/亩)，油菜、小麦、玉米产量分别提高5.9％、13.6％和17.5％，并可节约45公斤复合肥。

Claims

1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：解淀粉芽孢杆菌LN9 Bacillus amyloliquefaciens LN9，CCTCC NO：M 2014226。

2.一种复合微生物拌种剂，包含费氏中华根瘤菌 HN01；凝结芽孢杆菌 LN1，CCTCC NO：M 2014223；地衣芽孢杆菌 LN6，CCTCC NO：M 2014224；短小芽孢杆菌 LN7，CCTCC NO：M 2014225和解淀粉芽孢杆菌 LN9 ，CCTCC NO：M 2014226。

3.一种复合微生物拌种剂，由以下组分按重量份混合而成：

组分重量份

费氏中华根瘤菌 HN01 1-15

凝结芽孢杆菌 LN1 1-15

地衣芽孢杆菌 LN6 1-15

短小芽孢杆菌 LN7 1-15

解淀粉芽孢杆菌 LN9 1-15

草炭 80-90

微量元素液 0.1-1

所述的凝结芽孢杆菌LN1 Bacillus coagulans LN1，CCTCC NO：M 2014223；

所述的地衣芽孢杆LN6 Bacillus licheniformis LN6，CCTCC NO：M 2014224；

所述的短小芽孢杆菌LN7 Bacillus pumulis LN7，CCTCC NO：M 2014225；

所述的解淀粉芽孢杆菌LN9 Bacillus amyloliquefaciens LN9，CCTCC NO：M 2014226。

4.根据权利要求3所述的复合微生物拌种剂，其特征在于：

组分重量份

费氏中华根瘤菌 HN01 3

凝结芽孢杆菌 LN1 3

地衣芽孢杆菌 LN6 3

短小芽孢杆菌 LN7 3

解淀粉芽孢杆菌 LN9 3

草炭 84.6

微量元素液 0.4。

5.根据权利要求3所述的复合微生物拌种剂，其特征在于，所述的微量元素液的配方为： H₃BO₃ 5g，Na₂MoO₄ 5g，水1000 ml。

6.权利要求2或3所述的拌种剂在制备复合微生物拌种剂中的应用。

7.权利要求2或3所述的拌种剂在制备促生长微生物菌剂中的应用。

8.权利要求2或3所述的拌种剂在制备抗病微生物菌剂中的应用。

9.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在制备抗病微生物菌剂中的应用。