CN104651286B - 一种大豆根瘤内生菌DEnt1302及其制备方法和应用，菌剂及其制备方法 - Google Patents

一种大豆根瘤内生菌DEnt1302及其制备方法和应用，菌剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大豆根瘤内生菌DEnt1302及其制备方法和应用，菌剂及其制备方法，属于微生物技术领域。本发明大豆根瘤内生菌DEnet1302，为肠杆菌(Enterobacter ludwigi)DEnt1302，其保藏编号为CCTCC NO：M2013621，具有溶解无机磷的能力，能够产生果胶酶和纤维素酶，ACC脱氨酶、吲哚乙酸，促进小麦幼苗生长。本发明大豆根瘤内生菌的制备方法，采用牛肉膏蛋白胨培养基，并采用单菌落划线分离纯化培养的方式，分离得到大豆根瘤内生菌，操作简便，易于控制，纯度高。本发明采用大豆根瘤内生菌的菌悬液与无菌水复配制备的菌剂具有促小麦幼苗生长的作用。

Description

一种大豆根瘤内生菌DEnt1302及其制备方法和应用，菌剂及 其制备方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种大豆根瘤内生菌DEnt1302及其制备方法和应用，菌剂及其制备方法。
背景技术
小麦是我国的大宗作物，每年施用大量化肥来提高作物小麦的生长和产量给土壤结构和生态环境带来极大的破坏。目前，开发和筛选生物促生菌株来研发生物促生菌剂，对保持绿色农业和生态环境的可持续发展具有重要意义。一些对草类和其他作物植物具有生长促进作用的土壤微生物菌株如Azospirillum sp.，Enterobacter sp.，Pseudomonassp.，Klebsiella sp.，Serratia sp.，Bacillus sp.，Enterobacter sp.，Pantoea sp.，Listeria sp.，Xanthomonas sp.和Micrococcus spp.。
已有报道，Bacillus分离自小麦和草类根际被认为是有效的固氮菌株；Azospirillum接种谷物和草类提高产量和干物质重量已引起特别的重视；MauricioShoebitz等在《Plant growth promoting properties of a strain of Enterobacterludwigii isolated from Lolium perenne rhizosphere》的研究报道表明，分离自黑麦草根际的Enterobacter ludwgii接种黑麦草，对茎、根的鲜重和高度都有显著的提高；StefanKutter等在《Colonization of barley(Hordeumvulgare)with Salmonella enteric andListeria spp》的研究报道中表明Gluconoacetobacter diazotrophicus，Herbaspirillumseropedicaeor能定殖在甘蔗、水稻和草类，具有固氮等功能；Dilafruz Juraeva等在《Study the possible mechanisms of plant growth promotion by wheatdiazotrophic bacteria grown in Uzbekistan soil》的研究报道中表明分离自小麦根部和根际的Bacillus licheniformis BL43和Xanthomonas sp.Xs148对冬小麦具有促生长作用；中国专利CN103952344A公开了一种高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46，该根瘤菌具有分泌吲哚乙酸的能力、具有溶无机磷、有机磷和溶钾能力、抗逆性强，属于Bradyrhizobiumdiazoefficiens；中国专利CN102796684A公开了一种Enterobacter ludwigii菌株MJM-11，产生ACC脱氨酶、吲哚乙酸、嗜铁素等促进植物生长，不具有溶解有机磷、无机磷、产生果胶酶和纤维素酶的作用。
产生果胶酶和纤维素酶的菌株均具有较强入侵能力，能够定殖在宿主植物体内，表现为较强的定殖功能，进入宿主植物组织内部、诱导宿主抗性(ISR)、抑制和防治植物病原真菌菌丝的生长和发展具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种能够分泌吲哚乙酸，具有产生果胶酶、纤维素酶、ACC脱氨酶，溶解无机磷的促小麦幼苗生长的大豆根瘤内生菌DEnt1302。
本发明的目的之二在于提供一种大豆根瘤内生菌DEnt1302的制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种促小麦幼苗生长的菌剂。
本发明的目的之四在于提供一种促小麦幼苗生长的菌剂的制备方法。
本发明的目的之五在于提供一种大豆根瘤内生菌DEnt1302在促小麦生长方面的应用。
本发明的目的之六在于提供一种大豆根瘤内生菌DEnt1302在制备纤维素酶方面的应用。
本发明的目的之七在于提供一种大豆根瘤内生菌DEnt1302在制备果胶酶方面的应用。
本发明的目的之八在于提供一种大豆根瘤内生菌DEnt1302在制备ACC脱氨酶方面的应用。
本发明的目的之九在于提供一种大豆根瘤内生菌DEnt1302在制备吲哚乙酸方面的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种大豆根瘤内生菌DEnt1302，该大豆根瘤内生菌DEnt1302为肠杆菌(Enterobacter ludwigi)DEnt1302，于2013年12月1日保藏在位于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2013621。
上述大豆根瘤内生菌DEnt1302的制备方法，包括以下操作步骤：
1)对大豆根瘤进行表面消毒处理；
2)在无菌条件下，取表面消毒处理后的大豆根瘤汁液涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基平板上进行培养；
3)步骤2)培养获得的单菌落分别转移到牛肉膏蛋白胨培养基上进行划线分离，筛选获得菌体大小均一，形状一致的菌株，即得所述的大豆根瘤内生菌DEnt1302。
步骤1)中所述的大豆根瘤为选择开花期的大豆植株，筛选健康、饱满、粉红色大豆根瘤。
步骤1)中所述的表面消毒处理的具体方法为：将大豆根瘤用无菌水清洗后，经无水乙醇处理20～30s，再采用质量体积百分含量为3％的NaClO处理3～5min，再用无菌水洗涤5～8次。保留最后一次洗涤的水，涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上培养，观察培养基表面是否有菌落形成，如无菌落表明大豆根瘤表面消毒彻底。
步骤2)中所述大豆根瘤汁液的获取方法为：用无菌镊子在无菌条件下压迫根瘤，挤压出汁液，即得大豆根瘤汁液。
步骤2)中所述培养为28℃温度下倒置培养2～7天。
将上述步骤3)获得的菌株对应的单菌落接种到牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基上，28℃温度下培养3～5天，至管内菌苔饱满，4℃低温短期保藏7～30天。
或将上述步骤3)获得的菌株对应的单菌落接种到牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基上，28℃温度下培养3～5天，至管内菌苔饱满，采用体积浓度为30％的甘油将菌苔刮下制成菌悬液，-80℃低温冷冻长期保藏1～10年。
所述牛肉膏蛋白胨培养基的组成为：每1000ml水中含有牛肉膏2～4g，蛋白胨8～12g，NaCl 3～6g，琼脂15～20g。
一种促小麦幼苗生长的菌剂，由含有如权利要求1所述的大豆根瘤内生菌DEnt1302的菌悬液与无菌水复配而成；其中菌悬液的浓度为108CFU/ml，菌悬液与无菌水的体积比为(1～2)：(1～5)。
所述菌悬液与无菌水的体积比为1：2。
上述促小麦幼苗生长的菌剂的制备方法，其特征在于，包括采用YM液体培养基对如权利要求1所述的大豆根瘤内生菌DEnt1302进行活化培养后，收集菌体，制成浓度为108CFU/ml的菌悬液，将菌悬液与无菌水复配，即得所述的促小麦幼苗生长的菌剂。
所述YM液体培养基的组成为：甘露醇10g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl0.10g，酵母粉3.0g，H2O 1000mL，pH 6.8-7.0。
所述活化培养的条件为：28℃～30℃恒温130rpm振荡培养3～4天。
所述收集菌体的具体方法为：活化培养后在8000rpm条件下冷冻离心10min，收集沉淀菌体，并用无菌水清洗菌体。
上述大豆根瘤内生菌DEnt1302在促进小麦生长方面的应用。
上述大豆根瘤内生菌DEnt1302在制备纤维素酶方面的应用。在含有羧甲基纤维素和胰蛋白胨的NFB培养基中培养上述大豆根瘤内生菌DEnt1302，收集发酵产物，即得纤维素酶。其中所述NFB培养基的组成为：DL-苹果酸5.0g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.2g，Nacl0.1g，Cacl20.2g，微量元素2ml；每1000ml微量元素的配方为：Na2MoO4·2H2O0.2g，MnSO4·7H2O 0.2g，H3BO30.28g，CuSO4·5H2O 0.008g，ZnSO4·7H2O 0.024g，以0.2M KOH为溶质的质量百分含量为0.5％的溴百里香酚蓝2mL，质量浓度为1.64％的Fe3EDTA 4mL，NH4Cl1g，酵母提取物20mg，琼脂15g，生物素0.01g，维生素B60.02g，用0.1MKOH调节PH为6.5。其中羧甲基纤维素的质量百分含量为0.2％，胰蛋白胨的质量百分含量为0.5％。
上述大豆根瘤内生菌DEnt1302在制备果胶酶方面的应用。在含有果胶的牛肉膏蛋白胨培养基中培养上述大豆根瘤内生菌DEnt1302，收集发酵产物，即得果胶酶。所述牛肉膏蛋白胨的组成为：牛肉膏2～4g，蛋白胨8～12g，NaCl 3～6g，琼脂15～20g，水1000mL；所述果胶的质量百分含量为0.5％。
上述大豆根瘤内生菌DEnt1302在制备ACC脱氨酶方面的应用。将上述大豆根瘤内生菌DEnt1302在无氮液体培养基中活化培养后，离心收集菌体，将收集的菌体用SM液体培养基洗涤而后，置于SMA液体培养基中培养，收集发酵产物，即得ACC脱氨酶。所述无氮培养基的组成为：甘露醇10g，MgSO4.7H2O 0.2g，KH2PO40.2g，NaCl 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO4.2H2O0.2g，CaCO35g，1000ml蒸馏水，pH7.0～7.2。所述SM液体培养基的组成为：KH2PO40.4g，K2HPO42g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl20.1g，Fe2SO45mg，H3BO32mg，ZnSO4.7H2O 5mg，Na2MoO41mg，MnSO43mg，CoSO41mg，CuSO41mg，NiSO41mg，pH6.4；所述SMA液体培养基为在SM液体培养基中加入1-氨基环丙烷-1-羧酸，使其终浓度为3mmol/L。
上述大豆根瘤内生菌DEnt1302在制备吲哚乙酸方面的应用。在改良的刚果红液体培养基中培养上述大豆根瘤内生菌DEnt1302，收集发酵产物，即得吲哚乙酸。所述改良的刚果红液体培养基的组成为：MgSO4·7H2O 0.2g，Na Cl 0.1g，K2HPO4·3H2Og，酵母膏1.0g，甘露醇10g，0.25％刚果红10mL，硝酸铵1g，色氨酸0.1g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
本发明大豆根瘤内生菌DEnet1302，为分离自河南大豆根瘤内微环境的Enterobacter ludwigii类菌株，具有溶解无机磷的能力，磷是植物生长所需的最重要的营养元素之一，自然界中大部分磷是以不能被植物直接吸收的有机态或无机态难溶磷形式存在。具有溶磷能力的内生菌在宿主根际将不溶性磷转化为可被植物吸收利用的磷形式，对于增加土壤中有效磷的含量，提高小麦等农作物的产量，减少田间化学磷肥的施用量，保护田间的生态环境；能够产生果胶酶和纤维素酶，定殖在宿主植物体内，表现为较强的定殖能力，进入宿主植物组织内部，诱导宿主抗性，抑制和防治植物病原真菌菌丝的生长和发展，促进植物健康生长；具有产生ACC脱氨酶的能力，将ACC分解成α-酮丁酸和NH3，降低植物细胞合成乙烯的水平，减轻乙烯对幼苗生长的影响；具有代谢产生吲哚乙酸的能力，能够促进宿主植物的根系细胞伸长和发育。本发明的大豆根瘤内生菌DEnt1302对于促进小麦幼苗生长具有突出的效果。
本发明大豆根瘤内生菌的制备方法，采用牛肉膏蛋白胨培养基，并采用单菌落划线分离纯化培养的方式，分离得到大豆根瘤内生菌，操作简便，易于控制，纯度高。
本发明促小麦幼苗生长的菌剂，采用本发明的大豆根瘤内生菌的菌悬液与无菌水复配，并通过限定其复配的比例，使制备的菌剂具有促小麦幼苗生长的作用。
附图说明
图1实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302在牛肉膏蛋白胨培养基上形成的菌落；
图2实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302经革兰氏染色后的菌体；
图3实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302在牛肉膏蛋白胨液体培养基中的生长曲线；
图4实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302对液体无机磷的溶解量；
图5实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302产生纤维素酶；
图6实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302产生果胶酶；
图7牛血清白蛋白与OD值间的线性关系；
图8α-丁酮酸浓度和OD值间的线性关系；
图9吲哚乙酸的浓度与OD值间的线性关系；
图10接种实施例2、实施例3、实施例7和无菌水培养的小麦幼苗的生长情况；图中CK为无菌水。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
本实施例大豆根瘤内生菌DEnt1302，其保藏编号为CCTCC NO：M2013621。
本实施例大豆根瘤内生菌DEnt1302的制备方法，具体操作步骤为：
1)大豆根瘤表面消毒处理：从河南省种植的大豆中选择开花期的大豆植株，采集健康、饱满、粉红色根瘤，用无菌水清洗后，经无水乙醇处理25s，有效率含量3％(m/v)NaClO处理4min，再用无菌水洗涤6次，并保留最后一次洗涤的水，涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上，培养后观察培养基上无菌落产生；
2)用无菌镊子在无菌条件下压迫步骤1)表面消毒后的大豆根瘤，挤压出汁液涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，28℃恒温倒置培养5天，把形成的单菌落再经转移到牛肉膏蛋白胨培养基上划线分离，经染色、镜检获得菌体大小均一、形状一致的菌株，即得所述的大豆根瘤内生菌DEnt1302。
本实施例大豆根瘤内生菌的保藏方式：将步骤2)分离出的菌株对应的单菌落接种到牛肉膏蛋白胨的固体斜面培养基上，28℃培养3～5天，待管内菌苔饱满，4℃低温保藏7～30天；
或在试管斜面内加入体积百分含量为30％的甘油刮下菌苔制成菌悬液，移到甘油管-80℃低温冷冻保藏1～10年。
其中牛肉膏蛋白胨培养基的组成为：牛肉膏2～4g，蛋白胨8～12g，NaCl 3～6g，琼脂15～20g，水1000ml。
实施例2
本实施例促小麦幼苗生长的菌剂，其制备方法的具体操作步骤为：
1)将实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302菌株在YM液体培养基中29℃条件下恒温130rpm震荡培养4天得混合液，将混合液在8000rpm冷冻离心10min，收集沉淀菌体，用无菌水清洗菌体后，加入无菌水制成浓度为108CFU/ml的菌悬液；
2)步骤1)制备的菌悬液与无菌水按照1：1的体积比复配，即得所述的促小麦幼苗生长的菌剂。
实施例3
本实施例促小麦幼苗生长的菌剂，其制备方法的具体操作步骤为：
1)将实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302菌株在YM液体培养基中28℃条件下恒温130rpm震荡培养3天得混合液，将混合液在8000rpm冷冻离心10min，收集沉淀菌体，用无菌水清洗菌体后，加入无菌水制成浓度为108CFU/ml的菌悬液；
2)步骤1)制备的菌悬液与无菌水按照1：2的体积比复配，即得所述的促小麦幼苗生长的菌剂。
实施例4
实施例3本实施例促小麦幼苗生长的菌剂，其制备方法的具体操作步骤为：
1)将实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302菌株在YM液体培养基中30℃条件下恒温130rpm震荡培养4天得混合液，将混合液在8000rpm冷冻离心10min，收集沉淀菌体，用无菌水清洗菌体后，加入无菌水制成浓度为108CFU/ml的菌悬液；
2)步骤1)制备的菌悬液与无菌水按照1：3的体积比复配，即得所述的促小麦幼苗生长的菌剂。
实施例5
实施例3本实施例促小麦幼苗生长的菌剂，其制备方法的具体操作步骤为：
1)将实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302菌株在YM液体培养基中29℃条件下恒温130rpm震荡培养4天得混合液，将混合液在8000rpm冷冻离心10min，收集沉淀菌体，用无菌水清洗菌体后，加入无菌水制成浓度为108CFU/ml的菌悬液配；
2)步骤1)制备的菌悬液与无菌水按照1：4的体积比复配，即得所述的促小麦幼苗生长的菌剂。
实施例6
实施例3本实施例促小麦幼苗生长的菌剂，其制备方法的具体操作步骤为：
1)将实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302菌株在YM液体培养基中29℃条件下恒温130rpm震荡培养4天得混合液，将混合液在8000rpm冷冻离心10min，收集沉淀菌体，用无菌水清洗菌体后，加入无菌水制成浓度为108CFU/ml的菌悬液；
2)步骤1)制备的菌悬液与无菌水按照1：5的体积比复配，即得所述的促小麦幼苗生长的菌剂。
实施例7
实施例3本实施例促小麦幼苗生长的菌剂，其制备方法的具体操作步骤为：
1)将实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302菌株在YM液体培养基中29℃条件下恒温130rpm震荡培养4天得混合液，将混合液在8000rpm冷冻离心10min，收集沉淀菌体，用无菌水清洗菌体后，加入无菌水制成浓度为108CFU/ml的菌悬液；
2)步骤1)制备的菌悬液与无菌水按照2：1的体积比复配，即得所述的促小麦幼苗生长的菌剂。
试验例1实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302培养特征和生长特性试验
A：培养特征：将实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302在牛肉膏蛋白胨培养基上28℃条件下培养3天，菌落呈乳白色，稍带黄色，经36小时培养菌落大小在3-5mm，菌落边缘有缺刻，表面无光泽、无突起，无皱褶，如图1所示；
将实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302用革兰氏进行染色，观察菌体经染色后呈紫色，杆状，菌体大小为(0.6-1.1)×(1.2-2.5)μm，无芽孢，生殖方式为二分裂，如图2所示。
B：生长特性：将实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302在牛肉膏蛋白胨液体培养基上130rpm振荡培养48h，在600nm波长下测定OD值，以培养时间为以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标，测定菌株的生长曲线，如图3所示，当菌株接种至培养基上培养2h(潜伏期)，开始进入对数生长期，持续12h；到14h菌体进入平稳期生长(大约为30个小时)，培养至44h菌株开始进入衰亡期。
试验例2对实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302进行分子鉴定
将实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302接种到牛肉膏琼脂液体培养基，培养3-5天，12000rpm离心10min收集菌体。采用细菌基因组DNA试剂盒OSR-M502(天根生化科技有限公司)提取细菌基因组DNA，进行16S rRNA基因的扩增，(具体给出所用引物、扩增体系、反应条件)，对扩增产物进行测序，，根据测序结果，将扩增得到的序列在GenBank中进行BLAST分析，用DNAMAN6.0进行序列相似性分析，结果表明实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302与Enterobacter ludwigii EN-119T(AJ853891)的相似率为98.3％。16S rRNA基因扩增序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
试验例3实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302的促生长特性
A：溶解无机磷特性：
1)菌悬液制备
将实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302在YM液体培养基(甘露醇10g，K2HPO40.5g，MgSO4.7H2O 0.2g，NaCl 0.10g，酵母粉3.0g，H2O 1000mL，pH 6.8-7.0)培养24h得混合液，将混合液倒入2mL离心管中，8000r/min离心10min，收集沉淀菌体，用无菌水清洗菌体后加入无菌水，涡旋振荡制成菌悬液，调节OD值为0.8(约108～109CFU/mL)以备用；
2)溶磷性大豆根瘤内生菌初筛
采用多点接种法，分别吸取1)中制备的菌悬液100ml加入多点接菌器每个槽内，接种至预先制备的无机磷培养基(葡萄糖10g，Ca3(PO4)25g，MgCl25g，MgSO4.7H2O0.25g，KCl0.2g，(NH4)2SO40.1g，琼脂15g，去离子水1000mL，pH7.0)平板上，每个平板接种5个菌样，28℃～30℃下培养4-7d，观察有无溶磷圈形成，测定溶磷圈直径(D)、菌落直径(d)，根据能否产生溶磷圈和D/d值大小来判断菌株有无溶磷能力及溶磷能力大小；
3)溶磷性大豆根瘤内生菌复筛
对初筛获得的溶磷能力较强菌株采用与初筛相同的方法进行复筛，复筛3次后置于28℃条件下恒温培养4～7d，观察并测定溶磷圈直径和菌落直径大小，结果如下表1所示：
表1 大豆根瘤内生菌DEnt1302溶磷性复筛结果
菌株 溶磷圈直径(D/cm) 菌落直径(d/cm) 比值(D/d)
DEnt1302 3.93±0.121 0.47±0.041 3.460±0.146
4)液体培养基中内生菌的溶磷效果
在盛有无机磷液体培养基(葡萄糖10g，Ca3(PO4)25g，MgCl25g，MgSO4.7H2O0.25g，KCl 0.2g，(NH4)2SO40.1g，去离子水1000mL，pH7.0)的三角瓶中按体积百分含量2％接菌量接入实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302，每株3个重复，以接入等体积无菌水的无机磷液体培养基为对照。置于28℃、150r/min震荡培养7d后，将菌液经8000r/min 4℃冷冻离心15min，取上清液1mL于100mL容量瓶中，采用钼锑抗比色法测定培养液中有效磷含量，采用波长为700nm处测定吸光度值，测定结果如图4所示，结果表明菌株DEnt1302的溶磷能力为539mg/L，比无菌水高出15.4倍。
上述试验结果表明实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302具有持久性的溶解无机磷的能力。
B：产生纤维素酶的特性：
1)纤维素酶活性菌株初筛
配制NFB培养基：DL-苹果酸5.0g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.1g，CaCl20.2g，微量元素2ml；其中酶1000ml微量元素的配方为：Na2MoO4·2H2O 0.2g，MnSO4·7H2O 0.2g，H3BO30.28g，CuSO4·5H2O 0.008g，ZnSO4·7H2O 0.024g，以0.2mKOH为溶质的质量百分含量为0.5％的溴百里香酚蓝2mL，质量浓度为1.64％的Fe3EDTA 4mL，NH4Cl 1g，酵母提取物20mg,琼脂15g，生物素0.01g，维生素B60.02g，用0.1MKOH调节PH＝6.5；
在NFB培养基中，按照质量百分含量添加0.2％羧甲基纤维素和0.5％胰蛋白胨，点接实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302，一个培养皿中接种5株菌，30℃培养48h后，用刚果红溶液浸润30分钟，倒去多余的染液，用1M NaCl使琼脂脱色，平板保持过夜4天，检查接菌处周围透明圈。菌落周围有较澄清的晕环者为阳性，菌株具有产生纤维素酶的特性，无晕环者为阴性，菌株无产生纤维素酶的特性。
2)纤维素酶活性菌株复筛
点接初筛获得的纤维素酶活性较强的菌株，一个培养皿中一株菌均匀的点接三个位置，30℃培养48h后，用刚果红溶液浸润30分钟，倒去多余的染液，用1M NaCl使琼脂脱色，平板保持过夜4天，检查接菌处周围透明圈。菌落周围有较澄清的晕环者为阳性，菌株具有产生纤维素酶的特性，无晕环者为阴性，菌株无产生纤维素酶的特性，如图5所示。
C：产生果胶酶的特性：
1)果胶酶活性菌株初筛
牛肉膏蛋白胨培养基中按照质量体积百分含量添加0.5％果胶，点接实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302，一个培养皿中接种5点，在30℃下恒温培养5天，培养基表面用质量浓度为2％的十六烷基三甲基溴化铵溶液浸润30min，倒去十六烷基三甲基溴化铵溶液，用1M NaCl溶液清洗培养基表面，观察菌落周围区域。菌落周围有透明圈产生者为阳性；没有透明圈产生者为阴性，透明圈越大说明产生果胶酶的活力越强。
2)果胶酶活性菌株复筛
点接初筛中果胶酶活性菌株，一个培养皿中一株菌均匀点接三个位置，在30℃下培养5天，培养基表面用质量浓度为2％的十六烷基三甲基溴化铵溶液浸润30min，倒去十六烷基三甲基溴化铵溶液，用1M NaCl溶液清洗培养基表面，观察菌落周围区域，如图6所示，实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302具有产生果胶酶的特性。
D：产生ACC脱氨酶的特性：
1)制备培养基：
无氮液体培养基：甘露醇10g，MgSO4.7H2O 0.2g，KH2PO40.2g，NaCl 0.2g，NaCl0.2g，CaSO4.2H2O 0.2g，CaCO35g，1000ml蒸馏水，pH7.0-7.2。
SM培养基：KH2PO40.4g，K2HPO42g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl20.1g，Fe2SO45mg，H3BO32mg，ZnSO4.7H2O 5mg，Na2MoO41mg，MnSO43mg，CoSO41mg，CuSO41mg，NiSO41mg，pH6.4。
SMA培养基：向SM培养基中添加经滤器过滤除菌的1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)，使其终浓度为3mmol/L。
2)ACC脱氨酶的测定
具体操作步骤为：a：将实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302用无氮液体培养基28℃活化震荡培养48h后，经8000rpm冷冻离心10min收集沉淀菌体，用SM培养基离心洗涤菌体2-3次，将菌体重悬于SMA液体培养基中，28℃恒温180rpm震荡培养24h，以诱导产生ACC脱氨酶，4℃收集并记录菌体重量；
b：将步骤a收集的菌体用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)12000r/min冷冻离心5min，并洗涤菌体2-3次，重悬于600μL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)中，加入30μL甲苯并迅速振荡30s破碎细胞，得粗酶液；
c：取步骤b制备的粗酶液100μL，4℃贮存用于测定蛋白浓度；
取步骤b制备的粗酶液200μL加入0.5mol/L ACC 20μL混匀，以不添加ACC的空白为对照，置于30℃水浴反应15min，加入1mL 0.56mol/L HCl终止反应，12000r/min离心5min，取1mL上清，加入800μL 0.56mol/L HCl和300μL质量浓度0.2％2，4-二硝基苯肼溶液(2mol/L HCl)中溶解，30℃保温30min，加入2mL 2mol/L NaOH混匀，在540nm波长下测定吸光度值。
分别检测不同浓度的α-丁酮酸浓液的吸光度值，以吸光度值(OD)为横坐标，以α-丁酮酸的浓度为纵坐标绘制α-丁酮酸浓液的标准曲线(如图8所示)：y＝1.1289x-0.0259(R2＝0.9769)；
分别检测不同浓度的牛血清白蛋白浓度的吸光度值，以吸光度值(OD)为纵坐标，以牛血清白蛋白浓度为横坐标绘制蛋白浓度的标准曲线，如图7所示，y＝0.7382x-0.0073(R2＝0.9922)(以牛血清白蛋白作为标准物)；
根据步骤c测定的吸光度值计算粗酶液中α-丁酮酸的浓度和蛋白含量，进而计算菌株的酶活性。
ACC脱氨酶表示方法为：每毫克菌体蛋白每小时催化ACC脱氨形成α-丁酮酸的微摩尔数，单位是(μmolα-丁酮酸/h·mg蛋白)。
蛋白质测定采用比色法，测定结果为3次重复平均值。
酶活力的计算公式为：
实验结果表明，实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302的产生的ACC脱氨酶活力为9.36±0.1(μmolα-丁酮酸/h·mg蛋白)。
E：产生吲哚乙酸的特性：
该试验中采用的改良的刚果红液体培养基：MgSO4·7H2O 0.2g，Na Cl 0.1g，K2HPO4·3H2Og，酵母膏1.0g，甘露醇10g,0.25％刚果红10mL，硝酸铵1g，色氨酸0.1g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
比色液：0.5mol/m L FeCl3l7.5mL，H2SO430mL，蒸馏水50mL。
具体操作步骤为：
1)接种：将实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEnt1302接种到盛有50mL改良的刚果红液体培养基的150mL三角瓶中，置于28℃转速200rpm摇床中培养96h，制得培养液；每一菌株3个重复，培养的过程中，每天都要观察培养液的变化，培养液变浑浊说明接种成功；
2)测定OD值：将步骤1)制备的培养液移入离心管，1000rpm冷冻离心15min，取2mL上清液与2mL比色液试剂混合，在室温28℃黑暗环境中培养30min，有粉色出现说明有吲哚乙酸生成，将有粉色出现的上清液和比色液的混合液用530nm波长测OD值。
3)吲哚乙酸产量的测定：
配置浓度为5，20，40，60，80，100，120g/mL的吲哚乙酸溶液，使用722分光光度计530nm处测定OD值，绘制吲哚乙酸浓度标准曲线，如图9所示；然后将步骤2)中测得的能产生吲哚乙酸菌株的OD值带入标准曲线，求得该菌株产吲哚乙酸的量，即将OD值带入公式y＝59.667x+0.3675，计算出吲哚乙酸的量，计算结果为实施例1制备的菌株DEnt1302产生吲哚乙酸的量为34.17±0.02mg/L。
试验例4实施例2～7制备的促小麦幼苗生长的菌剂的性能鉴定
A：选用周麦18(国家审定小麦品种)为研究材料，进行实验室内盆栽接种试验。用SPSS 11.0软件统计分析，评价实施例2～7制备的菌剂对幼苗植株生长的影响。
试验组1～6分别为实施例2～7制备的菌剂；
试验组7为菌悬液与无菌水的体积比为3：1复配的菌剂；
试验组8为菌悬液与无菌水的体积比为4：1复配的菌剂；
试验组9为菌悬液与无菌水的体积比为5：1复配的菌剂；
试验组10为无菌水。
B：试验方法的具体操作步骤为：
1)小麦种子的处理与菌剂的接种试验
a：挑选饱满、健康无霉变、大小均一、无破损的小麦种子，先用无菌水冲洗表面的灰尘，再用无水乙醇进行表面消毒20s以去除表面蜡纸，用3-5％次氯酸钠进行表面消毒2-3分钟，之后使用无菌水冲洗5-8次，最后一次冲洗的无菌水取100μL涂布在牛肉膏蛋白胨固体培养基上，倒置恒温培养48小时，观察培养基表面是否有菌落形成，若无说明小麦表面消毒彻底；
b：分别在装有菌剂和无菌水的烧杯中浸泡消毒过的小麦种子3～4h，使种子充分吸胀，然后滤除小麦种子，使用沾有相应菌剂或无菌水的无菌纱布盖在种子表面，使种子保持潮湿环境，置于25～30℃恒温培养箱，直到种子露白；
c：把露白的种子播种在直径为13cm口径、深10cm盛有190g无菌蛭石的花盆中，保持播种深度约1cm，每盆播种40粒种子，然后每盆喷洒5mL无菌水，置于14h光周期22℃，暗周期20℃，相对湿度为65％的温室环境，培养3天苗子均一长出时，每隔一天浇一次对应的菌剂或无菌水，每3天浇1次无菌水以保持盆内的相对湿度，2周后每个一周测定小麦苗子的叶绿素含量，4周后测定小麦苗子的株高、根长、鲜重等指标；每个处理3个重复；
d：小麦幼苗生物量及叶绿素含量的测定：测定结果如表2和表3所示：
叶绿素的测定：当小麦生长到2周时，对每组小麦进行取样，随机挑取每个花盆中小麦，用剪刀从根部剪断，将每株小麦中最绿的一片叶子取出，则每组小麦共取了三片叶子，将这三片叶子剪碎从中称取0.2g小麦叶子碎片，把从每组样品中称取0.2g小麦叶子碎片分别放入含有25ml乙醇-丙酮(v:v＝1:1)混合液中的三角瓶中，用封口膜将瓶口封好，在40℃下保持24h，用分光光度法测定叶绿素含量。具体方法为：在波长665nm、645nm和652nm下测定吸光度，以乙醇-丙酮混合液为空白对照，即可用朗伯—比尔定律计算出提取液中各叶绿素的含量，即根据经验公式计算出总叶绿素的含量，公式为：C总＝20.21A645+8.02A663；或C总＝A652*V/(34.5*1000*m)。生长3周、4周时，再各测一次叶绿素含量，小麦幼苗生长到4周的叶绿素含量为三次测定结果的平均值；
其他性能的测定：培养4周后，停止给无菌水和菌剂，把花盆里的蛭石倒出，挑出麦苗，用水慢慢冲洗去根部粘附的蛭石，使用吸水纸吸干表面的水，从幼苗生根处剪开茎和根，分别称量苗高、根长、鲜重；实施例2、实施例3、实施例7与对照组10的小麦幼苗实际生长情况如图10所示。
表2 不同的菌剂对小麦幼苗生物量及叶绿素含量的影响
实例 苗高(cm) 根长(cm) 鲜重(g/棵) 叶绿素含量(mg/g wt)
试验组1 38.16±0.80a 6.98±0.38b 6.95±0.15d 1.87±0.10b
试验组2 42.92±0.43b 8.56±0.45a 9.68±0.13a 2.67±0.15a
试验组3 36.23±0.22ab 8.23±0.36ac 9.47±0.31b 2.58±0.12ac
试验组4 34.12±0.35c 8.01±0.28bc 8.26±0.18ab 2.42±0.33ab
试验组5 33.78±0.33cd 7.15±0.34cd 8.06±0.34bc 2.33±0.28cd
试验组6 32.64±1.74bc 7.22±0.96abc 7.22±0.20b 2.36±0.14ab
试验组7 30.72±0.51eh 7.08±0.31bc 7.35±0.31bc 2.27±0.14cd
试验组8 27.65±0.73fh 6.85±0.27d 7.27±0.18cd 2.15±0.21cd
试验组9 26.35±0.29gh 6.37±0.33de 7.21±0.23e 2.09±0.14e
试验组10 25.36±1.08ach 6.22±0.09bcd 6.88±0.19bde 1.37±0.03bce
*表中数据为测得3次重复的平均值±标准差，数据后不同小写字母表示差异显著(p＜0.05).
表3 采用不同的菌剂小麦幼苗生长中各项指标增加量
实例 苗高(％) 根长(％) 鲜重(％) 叶绿素含量(％)
试验组1 50.47 12.11 1.01 36.50
试验组2 69.24 37.62 40.70 94.89
试验组3 42.86 32.32 37.64 88.32
试验组4 34.54 28.78 20.06 76.64
试验组5 33.20 14.95 17.15 70.07
试验组6 28.71 16.08 4.94 72.26
试验组7 21.14 13.83 6.83 65.69
试验组8 9.03 10.13 5.67 56.93
试验组9 3.90 2.41 4.80 52.55
上述表2和表3的试验结果表明，本发明实施例2～7制备的菌剂对小麦幼苗的生长均具有促进作用，而且实施例3制备的菌剂得到的麦苗的苗高、根长、鲜重、叶绿素含量与其他菌剂相比均显示出最高值，该试验结果表明本发明制备的促小麦幼苗生长的菌剂对小麦幼苗的生长均有显著的促进作用。

Claims (8)

1.一种大豆根瘤内生菌DEnt1302，其特征在于，所述大豆根瘤内生菌DEnt1302为肠杆菌(Enterobacter ludwigi)DEnt1302，其保藏编号为CCTCC NO：M2013621。
2.一种促小麦幼苗生长的菌剂，其特征在于，由含有如权利要求1所述的大豆根瘤内生菌DEnt1302的菌悬液与无菌水复配而成；其中菌悬液的浓度为108CFU/ml，菌悬液与无菌水的体积比为1：(2～3)。
3.一种如权利要求2所述的促小麦幼苗生长的菌剂的制备方法，其特征在于，包括采用YM液体培养基对如权利要求1所述的大豆根瘤内生菌DEnt1302进行活化培养后，收集菌体，制成浓度为108CFU/ml的菌悬液，将菌悬液与无菌水复配，即得所述的促小麦幼苗生长的菌剂。
4.一种如权利要求1所述的大豆根瘤内生菌DEnt1302在促进小麦生长方面的应用。
5.一种如权利要求1所述的大豆根瘤内生菌DEnt1302在制备纤维素酶方面的应用。
6.一种如权利要求1所述的大豆根瘤内生菌DEnt1302在制备果胶酶方面的应用。
7.一种如权利要求1所述的大豆根瘤内生菌DEnt1302在制备ACC脱氨酶方面的应用，其特征在于：将上述大豆根瘤内生菌DEnt1302在无氮液体培养基中活化培养后，离心收集菌体，将收集的菌体用SM液体培养基洗涤后，置于SMA液体培养基中培养，收集发酵产物，即得ACC脱氨酶。
8.一种如权利要求1所述的大豆根瘤内生菌DEnt1302在制备吲哚乙酸方面的应用，其特征在于：在改良的刚果红液体培养基中培养上述大豆根瘤内生菌DEnt1302，收集发酵产物，即得吲哚乙酸。
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