CN108753615A - 一种利用穗花狐尾藻内生菌溶解低品位磷矿粉的方法 - Google Patents

一种利用穗花狐尾藻内生菌溶解低品位磷矿粉的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用穗花狐尾藻内生菌溶解低品位磷矿粉的方法，涉及磷矿开采加工技术领域，先将穗花狐尾藻内生菌分离，再筛选、扩繁，得到高活性溶磷内生菌，再将内生菌与培养基、低品位磷矿粉混合培养，利用穗花狐尾藻内生菌分泌的有机酸、酶等物质将不溶性磷转化为可溶性磷。本发明能源消耗低，溶磷效果优良，不产生污染环境的废气，极具实用价值。

Description

一种利用穗花狐尾藻内生菌溶解低品位磷矿粉的方法
技术领域
本发明涉及磷矿开采加工技术领域，尤其涉及一种利用穗花狐尾藻内生菌溶解低品位磷矿粉的方法。
背景技术
我国是一个磷矿资源丰富的国家，但大部分都是中低品位磷矿。在我国磷矿探明储量中，磷矿平均品位约在17％左右，矿石品位大于30％的富矿不超过总储量的10％。矿石品位低于30％的中低品位磷矿矿石嵌布粒度细，矿物组成复杂，并且杂质含量高。这些因素决定了在采用传统湿法或热法磷肥生产工艺处理这些中低品位磷矿时，生产成本高，经济效益低下。
目前我国大多数磷矿开采企业采用的是“采富弃贫”的开发模式，如果按照现在的开采规模，我国现有的富磷矿资源将会在几年内消耗殆尽，中国的磷矿资源保障能力较弱的问题将日渐突出。国土资源部已将磷矿列为2010年后不能满足国民经济发展要求的20个矿种之一。因此，如何加强我国中低品位磷矿资源的开发利用，对于科学利用资源、提高资源利用效率以及维持国内磷肥工业的健康可持续发展意义重大。
基于降低成本、节约资源以及日渐严重的环保问题，许多研究者都在积极寻求合理充分利用中低品位磷矿资源的新途径，比如生物方法。微生物在自然界磷的循环中发挥着关键作用，自然界中存在着数量庞大的溶磷微生物。近年来，利用溶磷微生物作为接种体溶解中低品位磷矿并将其转化为可溶性磷的研究已经引起了人们越来越多的关注。目前在微生物溶解中低品位磷矿方面的研究虽然取得了一些不错的进展，但也存在着一定的不足，即目前的研究大多采用单一或已知成分的几个菌种，少有利用天然的、与植物协同生长的微生物菌群溶解中低品位磷矿的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用穗花狐尾藻内生菌溶解低品位磷矿粉的方法，该方法具有溶磷率高、工艺简单、生产成本低的特点。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种利用穗花狐尾藻内生菌溶解低品位磷矿粉的方法，包括如下步骤：
（1）内生菌的分离筛选：
a、穗花狐尾藻内生菌分离：
在野外采集植株完整、生长健壮的的穗花狐尾藻，用自来水冲洗干净，然后再用无菌水冲洗8-10次，用无菌滤纸将其吸干，依次用70%乙醇溶液浸泡3-5min、0.8%-1.2%的次氯酸钠溶液浸泡2-3min、0.1%氯化汞溶液中浸泡1-2min，最后用无菌水再反复冲洗8-10次并吸干，将植株剪切成0.8-1.5cm的小段，纵向切开，将切面贴合在牛肉膏蛋白胨固体培养基表面上，将制备完的平板置于25℃恒温培养箱中培养1-2周得到菌体；
b、穗花狐尾藻内生菌筛选：
在无菌条件下，选择步骤a中长势良好、外观完整的菌落，用灭菌的接种环挑出，在牛肉膏蛋白胨固体培养基制作的平板中横向划3-4条直线，纵向划3-4条直线，盖上玻璃盖，在25℃下培养，直至平板中菌落形成，再次挑选长势良好、完整的菌落，重复划线操作，培养形成菌落，得到纯化内生菌;
（2）穗花狐尾藻内生菌的扩繁：
在无菌条件下，将经纯化的内生菌用灭菌的刀片刮下，与缓冲液混合，得到原始菌液；将原始菌液接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，培养7-10天，得到穗花狐尾藻内生菌液；
（3）内生菌溶解低品位磷矿粉：
a、将穗花狐尾藻干燥，研磨，过80目筛，得到穗花狐尾藻粉;
b、按质量比取葡萄糖10-12、(NH4)2SO40.3-0.8、NaCl0.2-0.5、KCl0.1-0.3、MgSO4·7H2O0.2-0.4、FeSO4·7H2O0.02-0.04、MnSO4·7H2O0.04-0.06、水950-980混合，调pH=7.1，100-130℃灭菌2-2.5h得到培养基;
c、将低品位磷矿粉、穗花狐尾藻粉、培养基按质量比(15-20)∶(3-5)∶（950-1000）混合，在120-160r·min－1、25℃下培养15-18天，得到可溶性磷。
所述低品位磷矿粉的粒径为100-150目。
所述步骤（2）中缓冲液包含如下质量比的原料：水10-12、麦芽糖2-3、甘露醇1-2。
所述步骤（2）中纯化内生菌与缓冲液的质量比为1∶（3-5）
所述步骤（2）中原始菌液接种量为牛肉膏蛋白胨液体培养基质量的1%-1.2%。
所述步骤（2）中原始菌液培养温度为25℃。
所述步骤（3）中低品位磷矿粉、穗花狐尾藻粉、培养基的质量比为(15-20)∶(3-5)∶（950-1000）。
本发明的有益效果：
1、本发明中以价格相对低廉且容易获得的低品位磷矿作为穗花狐尾藻内生菌生长过程中的能量来源，节约了生产成本，并且在内生菌溶解磷矿中加入一定比例的穗花狐尾藻干粉，增加溶解体系中的营养物质，利于内生菌的繁殖，对磷矿的中磷的溶出效率起到了积极的作用。
2、本发明中穗花狐尾藻内生菌生长的合适温度为25℃，和常温环境相似，无需大量能量的维持，并且菌落生长迅速，分泌有机酸含量高，可以提高中低品位磷矿粉的溶解效率，同时还无污染，经济效益显著。
3、该方法对中低品位磷矿的溶磷率高，可以较为充分的利用我国丰富的中低品位磷矿资源，对于科学利用资源、提高资源利用效率、维持我国农业可持续发展以及磷肥工业环境治理具有重要的现实意义。
4、本发明工艺简单，环境友好。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。所用牛肉膏蛋白胨固体培养基组分为：牛肉膏:3.0g蛋白胨:10.0g、NaCl:5.0g琼脂:20、水:1000ml；所用牛肉膏蛋白胨液体培养基，组分为：牛肉膏:3.0g蛋白胨:10.0g、NaCl:5.0g琼脂:20、水:1000ml；所用低品位磷矿粉的P2O5含量为11.67%。
实施例1
一种利用穗花狐尾藻内生菌溶解低品位磷矿粉的方法，包括如下步骤：
（1）内生菌的分离筛选：
a、穗花狐尾藻内生菌分离：
在野外采集植株完整、生长健壮的的穗花狐尾藻，用自来水冲洗干净，然后再用无菌水冲洗10次，用无菌滤纸将其吸干，依次用70%乙醇溶液浸泡5min、1.2%的次氯酸钠溶液浸泡3min、0.1%氯化汞溶液中浸泡2min，最后用无菌水再反复冲洗10次并吸干，将植株剪切成1.5cm的小段，纵向切开，将切面贴合在牛肉膏蛋白胨固体培养基表面上，将制备完的平板置于25℃恒温培养箱中培养2周得到菌体；
b、穗花狐尾藻内生菌筛选：
在无菌条件下，选择步骤a中长势良好、外观完整的菌落，用灭菌的接种环挑出，在牛肉膏蛋白胨固体培养基制作的平板中横向划4条直线，纵向划4条直线，盖上玻璃盖，在25℃下培养，直至平板中菌落形成，再次挑选长势良好、完整的菌落，重复划线操作，培养形成菌落，得到纯化内生菌;
（2）穗花狐尾藻内生菌的扩繁：
在无菌条件下，将经纯化的内生菌用灭菌的刀片刮下，与其质量5倍的缓冲液混合，得到原始菌液；将原始菌液接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，接种量为牛肉膏蛋白胨液体培养基质量的1.2%，在25℃下培养10天，得到穗花狐尾藻内生菌液；
所述缓冲液包含如下质量比的原料：水12、麦芽糖3、甘露醇2。
（3）内生菌溶解低品位磷矿粉：
a、将穗花狐尾藻干燥，研磨，过80目筛，得到穗花狐尾藻粉;
b、按质量比取葡萄糖12、(NH4)2SO40.8、NaCl0.5、KCl0.3、MgSO4·7H2O0.4、FeSO4·7H2O0.04、MnSO4·7H2O0.04、水980混合，调pH=7.1，130℃灭菌2h得到培养基;
c、将低品位磷矿粉、穗花狐尾藻粉、培养基按质量比20∶5∶1000混合，在160r·min－1、25℃下培养18天，得到可溶性磷。
实施例2
一种利用穗花狐尾藻内生菌溶解低品位磷矿粉的方法，包括如下步骤：
（1）内生菌的分离筛选：
a、穗花狐尾藻内生菌分离：
在野外采集植株完整、生长健壮的的穗花狐尾藻，用自来水冲洗干净，然后再用无菌水冲洗8次，用无菌滤纸将其吸干，依次用70%乙醇溶液浸泡3min、1%的次氯酸钠溶液浸泡2min、0.1%氯化汞溶液中浸泡1min，最后用无菌水再反复冲洗8次并吸干，将植株剪切成1cm的小段，纵向切开，将切面贴合在牛肉膏蛋白胨固体培养基表面上，将制备完的平板置于25℃恒温培养箱中培养2周得到菌体；
b、穗花狐尾藻内生菌筛选：
在无菌条件下，选择步骤a中长势良好、外观完整的菌落，用灭菌的接种环挑出，在牛肉膏蛋白胨固体培养基制作的平板中横向划3条直线，纵向划4条直线，盖上玻璃盖，在25℃下培养，直至平板中菌落形成，挑选长势良好、完整的菌落，重复划线操作，再次培养形成菌落，得到纯化内生菌;
（2）穗花狐尾藻内生菌的扩繁：
在无菌条件下，将经纯化的内生菌用灭菌的刀片刮下，与其质量3倍的缓冲液混合，得到原始菌液；将原始菌液接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，接种量为牛肉膏蛋白胨液体培养基质量的1%，在25℃下培养8天，得到穗花狐尾藻内生菌液；
所述缓冲液包含如下质量比的原料：水10、麦芽糖2、甘露醇1。
（3）内生菌溶解低品位磷矿粉：
a、将穗花狐尾藻干燥，研磨，过80目筛，得到穗花狐尾藻粉;
b、按质量比取葡萄糖10、(NH4)2SO40.6、NaCl0.4、KCl0.2、MgSO4·7H2O0.3、FeSO4·7H2O0.03、MnSO4·7H2O0.05、水960混合，调pH=7.1，120℃灭菌2.5h得到培养基;
c、将低品位磷矿粉、穗花狐尾藻粉、培养基按质量比18∶3∶950混合，在160r·min－1、25℃下培养18天，得到可溶性磷。
实施例3
一种利用穗花狐尾藻内生菌溶解低品位磷矿粉的方法，包括如下步骤：
（1）内生菌的分离筛选：
a、穗花狐尾藻内生菌分离：
在野外采集植株完整、生长健壮的的穗花狐尾藻，用自来水冲洗干净，然后再用无菌水冲洗9次，用无菌滤纸将其吸干，依次用70%乙醇溶液浸泡3min、0.8%的次氯酸钠溶液浸泡2min、0.1%氯化汞溶液中浸泡1min，最后用无菌水再反复冲洗9次并吸干，将植株剪切成0.8cm的小段，纵向切开，将切面贴合在牛肉膏蛋白胨固体培养基表面上，将制备完的平板置于25℃恒温培养箱中培养13天得到菌体；
b、穗花狐尾藻内生菌筛选：
在无菌条件下，用灭菌的接种环挑选步骤a中培养出的菌体，在牛肉膏蛋白胨固体培养基制作的平板中横向划4条直线，纵向划3条直线，盖上玻璃盖，在25℃下培养，直至平板中菌落形成，挑选长势良好、完整的菌落，重复划线操作，再次培养形成菌落，得到纯化内生菌;
（2）穗花狐尾藻内生菌的扩繁：
在无菌条件下，将经纯化的内生菌用灭菌的刀片刮下，与其质量4倍的缓冲液混合，得到原始菌液；将原始菌液接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，接种量为牛肉膏蛋白胨液体培养基质量的1.2%，在25℃下培养8天，得到穗花狐尾藻内生菌液；
所述缓冲液包含如下质量比的原料：水11、麦芽糖3、甘露醇1。
（3）内生菌溶解低品位磷矿粉：
a、将穗花狐尾藻干燥，研磨，过80目筛，得到穗花狐尾藻粉;
b、按质量比取葡萄糖11、(NH4)2SO40.5、NaCl0.3、KCl0.2、MgSO4·7H2O0.3、FeSO4·7H2O0.03、MnSO4·7H2O0.05、水960混合，调pH=7.1，130℃灭菌2h得到培养基;
c、将低品位磷矿粉、穗花狐尾藻粉、培养基按质量比15∶5∶960混合，在160r·min－1、25℃下培养18天，得到可溶性磷。
试验例
本试验例所用低品位磷矿由贵州省福泉磷矿有限公司提供，用DlMAX-3A 型X 射线粉晶衍射仪分析矿物相组成矿物样品，检测得到P2O5含量为11.67%，按照实施例1-3进行磷矿溶磷试验；以专利号为CN201610064930.2的授权专利为对照组，按照所述方法进行磷矿的生物溶解试验，试验结束后，在4组菌液分别取50ml菌液，过滤后采用钼锑抗比色法测上清液有效磷含量；用pH计检测菌液pH值。
溶磷率（％）＝菌液有效磷含量／加入无机磷源的总磷量×100%
试验结果
实施例1 实施例2 实施例3 对照组
磷矿粉P2O5含量 11.67% 11.67% 11.67% 11.67%
溶磷率 48.56% 45.39% 47.61% 39.81%
pH值 3.1 3.8 3.5 4.1
可以看出，本发明方法中使用的菌落产酸量高于对照组，并且在低品位磷矿的溶解效果上，本发明效果完全达到专利号为CN201610064930.2的对照组的效果，具有良好的实用价值。

Claims (7)

1.一种利用穗花狐尾藻内生菌溶解低品位磷矿粉的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）内生菌的分离筛选：
a、穗花狐尾藻内生菌分离：
在野外采集植株完整、生长健壮的的穗花狐尾藻，用自来水冲洗干净，然后再用无菌水冲洗8-10次，用无菌滤纸将其吸干，依次用70%乙醇溶液浸泡3-5min、0.8%-1.2%的次氯酸钠溶液浸泡2-3min、0.1%氯化汞溶液中浸泡1-2min，最后用无菌水再反复冲洗8-10次并吸干，将植株剪切成0.8-1.5cm的小段，纵向切开，将切面贴合在牛肉膏蛋白胨固体培养基表面上，将制备完的平板置于25℃恒温培养箱中培养1-2周得到菌体；
b、穗花狐尾藻内生菌筛选：
在无菌条件下，选择步骤a中长势良好、外观完整的菌落，用灭菌的接种环挑出，在牛肉膏蛋白胨固体培养基制作的平板中横向划3-4条直线，纵向划3-4条直线，盖上玻璃盖，在25℃下培养，直至平板中菌落形成，挑选长势良好、完整的菌落，重复划线操作，再次培养形成菌落，得到纯化内生菌;
穗花狐尾藻内生菌的扩繁：
在无菌条件下，将经纯化的内生菌用灭菌的刀片刮下，与缓冲液混合，得到原始菌液；将原始菌液接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，培养7-10天，得到穗花狐尾藻内生菌液；
内生菌溶解低品位磷矿粉：
将穗花狐尾藻干燥，研磨，过80目筛，得到穗花狐尾藻粉;
按质量比取葡萄糖10-12、(NH4)2SO40.3-0.8、NaCl0.2-0.5、KCl0.1-0.3、MgSO4·7H2O0.2-0.4、FeSO4·7H2O0.02-0.04、MnSO4·7H2O0.04-0.06、水950-980混合，调pH=7.1，100-130℃灭菌得到培养基;
c、将低品位磷矿粉、穗花狐尾藻粉、培养基混合，在120-160r·min－1、25℃下培养15-18天，得到可溶性磷。
2.根据权利要求1所述的利用穗花狐尾藻内生菌溶解低品位磷矿粉的方法，其特征在于：所述低品位磷矿粉的粒径为100-150目。
3.根据权利要求1所述的利用穗花狐尾藻内生菌溶解低品位磷矿粉的方法，其特征在于：所述步骤（2）中缓冲液包含如下质量比的原料：水10-12、麦芽糖2-3、甘露醇1-2。
4.根据权利要求1所述的利用穗花狐尾藻内生菌溶解低品位磷矿粉的方法，其特征在于：所述步骤（2）中纯化内生菌与缓冲液的质量比为1∶（3-5）。
5.根据权利要求1所述的利用穗花狐尾藻内生菌溶解低品位磷矿粉的方法，其特征在于：所述步骤（2）中原始菌液接种量为牛肉膏蛋白胨液体培养基质量的1%-1.2%。
6.根据权利要求1所述的利用穗花狐尾藻内生菌溶解低品位磷矿粉的方法，其特征在于：所述步骤（2）中原始菌液培养温度为25℃。
7.根据权利要求1所述的利用穗花狐尾藻内生菌溶解低品位磷矿粉的方法，其特征在于：所述步骤（3）中低品位磷矿粉、穗花狐尾藻粉、培养基的质量比为(15-20)∶(3-5)∶（950-1000）。
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