CN108102962A - 一种厦门芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了提供一种解钾菌，其为厦门芽孢杆菌XJC‑HK‑7，保藏编号为CCTCC NO：M 2017619。本发明从土壤中筛选出具有降解不溶性的硅铝酸盐无机矿物质的厦门芽孢杆菌XJC‑HK‑7，该解钾菌能够有效分解钾长石等不溶性的硅铝酸盐无机矿物质，促进难溶性的钾、磷、硅、镁等养分元素转化成可溶性养分，增加土壤中速效养分的含量，促进作物生长发育，提高产量。对充分发挥土壤生态肥力、保持农业生态环境的平衡等均具有极其重要意义和应用价值。

Description

一种厦门芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种厦门芽孢杆菌及其应用。

背景技术

钾是作物营养的三要素之一，普遍存在于作物体中，其功能与植物新陈代谢有关，它以酶的活化剂的形式广泛地影响着作物的生长和代谢，能激活酶，目前发现约有60多种酶的活化与钾有关，在光能利用、糖代谢、蛋白质合成、细胞渗透调节及增强植物抗性等生理过程中有十分重要的作用。

我国约有60％的耕地缺钾，耕地速效钾含量正以每年(2-3)×10^-6的速度下降，造成土壤中氮、磷、钾3种元素比例失调，影响了农业的发展。利用化学钾肥补钾是我国农业中普遍使用并且见效较快的土壤速效钾补充方法，但造成了土壤结构破坏、有机质含量下降，且污染严重、成本高、供不应求。然而土壤中95％的钾为矿物钾形态，存在于钾长石和云母中，可供作物吸收利用只有的速效性钾不超过全钾2％。不过在一定条件下，矿物态钾、缓效性钾与速效性钾之间存在动态平衡。

解钾菌是从土壤中分离出的一种能分化铝硅酸盐和磷灰石类矿物的细菌，能作为微生物肥料，能够分解钾长石、磷灰石等不溶性的硅铝酸盐无机矿物质，促进难溶性的钾、磷、硅、镁等养分元素转化成可溶性养分，增加土壤中速效养分的含量，促进作物生长发育，提高产量。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种厦门芽孢杆菌，具有良好的解钾效果。

本发明的第一个方面是提供一种解钾菌，其为厦门芽孢杆菌XJC-HK-7，保藏编号为CCTCC NO：M 2017619。

本发明的第二个方面是提供如本发明第一个方面所述的解钾菌在土壤解钾中的应用。

本发明的第三个方面是提供如本发明第一个方面所述的解钾菌在促进植物生长、减少化肥用量中的应用。

本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的解钾菌的发酵液或发酵液的过滤液。

优选地，所述解钾菌的发酵条件为：所述解钾菌的发酵条件为：以α-乳糖、D-纤维二糖、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-山梨醇、D-海藻糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、L-苯丙氨酸、棉子糖、木聚糖、肌醇、松三糖、鼠李糖、水杨苷、可溶性淀粉和蔗糖中的一种或多种为碳源，以L-精氨酸、L-苯基丙氨酸、甘氨酸、L-乙硫氨酸、缬氨酸、硝酸铵、组氨酸和乙酸铵中的一种或多种为氮源，PH值为3-9，摇床转速为0-250r/min，培养时间12-120h，钾长石粉量为0.5-10g。

进一步优选地，以蔗糖为碳源，以硫酸铵为碳氮源，培养温度为34-37℃，PH值为6-8，摇床转速为200-250r/min，培养时间36-48h，钾长石粉量为5-10g。

本发明的第五个方面是提供如本发明第四个方面所述的解钾菌的发酵液或发酵液的过滤液在土壤解钾中的应用。

本发明的第六个方面是提供如本发明第四个方面所述的解钾菌的发酵液或发酵液的过滤液在促进植物生长、减少化肥用量中的应用。

本发明的第七个方面是提供一种菌肥，其含有本发明第一个方面所述的解钾菌。

本发明的有益效果：

本发明从土壤中筛选出具有降解不溶性的硅铝酸盐无机矿物质的厦门芽孢杆菌XJC-HK-7，该解钾菌能够有效分解钾长石等不溶性的硅铝酸盐无机矿物质，促进难溶性的钾、磷、硅、镁等养分元素转化成可溶性养分，增加土壤中速效养分的含量，促进作物生长发育，提高产量。对充分发挥土壤生态肥力、保持农业生态环境的平衡等均具有极其重要意义和应用价值。

附图说明

图1为基于16S rDNA基因序列构建菌株XJC-HK-7的系统发育树：标尺为0.002，表示相似性百分比；分支点数字为自聚值；括号中为菌株序列号。

图2为不同培养时间下解钾菌XJC-HK-7的解钾量。

图3为不同PH条件下解钾菌XJC-HK-7的解钾量。

图4为不同钾长石粉量条件下解钾菌XJC-HK-7的解钾量。

图5为不同摇床转速条件下解钾菌XJC-HK-7的解钾量。

图6为不同碳源条件下解钾菌XJC-HK-7的解钾量。

图7为不同氮源条件下解钾菌XJC-HK-7的解钾量。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。

本发明提供了一种解钾菌，其为厦门芽孢杆菌XJC-HK-7(BacillusxiamenensisXJC-HK-7)，保藏编号为CCTCC NO：M 2017619，保藏日期为2017年10月23日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉的武汉大学。本发明的厦门芽孢杆菌XJC-HK-7从采集自海南省临高县的香蕉根际土壤中分离、筛选得到。

1材料和方法

1.1样品采集

土壤样品采自海南省临高县的香蕉根际土壤。采用五点交叉取样法，共采集土样3份，分别放入无菌封口袋中混匀、封口、编号，装入冰盒内保存后，除去根系、石块等杂物，4℃保存备用。

1.2仪器设备(名称：型号，制造商)

超净工作台：SW-CF-1F，苏州苏洁净化设备有限公司；

生化培养箱：SPX-150，北京恒瑞天创机电设备有限公司；

冷冻离心机：ST16R，德国Thermo公司；

PCR仪：9701，赛飞(中国)有限公司；

水平电泳槽：HR/022，北京恒瑞天创机电设备有限公司；

凝胶成像仪：BG-gds Auto，北京百晶生物技术有限公司；

恒温水浴锅：HHS-11-2，杭州汇尔仪器；

紫外可见分光光度计：UV1000，上海天美科学仪器有限公司。

1.3主要试剂

分析纯试剂：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)、氯化钠(NaCl)、无水硫酸钙(CaSO₄·2H₂O)、碳酸钙(CaCO₃)、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)、氯化铁(FeCl)、蔗糖等。

生化试剂：酵母粉、胰蛋白胨、琼脂等。

1.4培养基

分离培养基:葡萄糖10.0g，碳酸钙5g，磷酸二氢钾0.2g，硫酸镁0.2g，无水硫酸钙0.2g，氯化钠0.2g，琼脂15g，去离子水1000mL，pH 7.2；

筛选培养基:蔗糖5g，磷酸氢二钠2g，硫酸镁0.5g，碳酸钙0.1g，氯化铁0.005g，土壤矿物1g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.5；

LB营养培养基：酵母粉5g,胰蛋白胨10g,氯化钠l0g,琼脂20g,去离子水1000mL，pH7.2～7.5。

1.5根际土壤解钾菌的分离、筛选

1.5.1初筛：

将新鲜土样(10g)放入无菌水(100mL)中，利用磁力搅拌器充分混合均匀后，在无菌操作条件下，采用稀释涂布平板法分别配制10^-4、10^-5、10^-6三个浓度梯度的土壤悬液备用，各吸取100μL悬液涂布于分离培养基上(每个梯度设3个重复)，37℃下培养1～3d，观察细菌菌落生长和形态特征，运用平板划线法纯化直至获得纯培养。

1.5.2复筛：

将初筛获得的纯化菌株转接到以钾长石为唯一钾源的筛选培养基上，37℃下培养2d，采用四苯硼钠滴定法测定钾，菌落周围呈现亮蓝色，初步确定含有解钾细菌，将其纯化得到6种菌株，分别编号XJC-HK-7、MY-2……MY6，并保存至LB斜面培养基上扩大培养。

1.5.3解钾能力测定：

将测定取出的培养液样品倒入蒸发皿中，用恒温水浴锅干燥蒸馏至10mL，加入4mLH₂O₂继续蒸发除去菌体及残渣至无粘稠物，4℃，4000r/min，离心10min，收集上清液至容量瓶(50mL)中定容。同时设置空白对照(未接种)，每个处理重复3次，利用火焰原子吸收光度计测定钾含量(mg/mL)。

1.6解钾菌的鉴定

1.6.1菌株形态学和生理生化鉴定：

将保藏处理的菌种活化后37℃下培养1～3d，观察其菌落形态特征，然后挑取菌株分别进行细菌革兰氏、荚膜、芽孢染色镜检观察，并参考《常见细菌鉴定手册》、《伯杰氏细菌鉴定手册》对菌株进行生理生化测定。

1.6.2菌株16S rDNA分子生物学鉴定：

将活化后的菌种接入LB液体培养基，选用16S rDNA通用引物：

27F(5′-AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3′)，

1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)

建立PCR扩增体系进行扩增(见表1)。

表1菌株PCR扩增反应条件

扩增处理后的DNA样品，经1％琼脂糖凝胶电泳预检测后，送往北京六合华大基因股份有限公司纯化测序，获得DNA序列后输入GenBank，用Blast程序与数据库中的所有序列进行比对，使用邻接法(Neighbor Joining meth-od)选取最相似的模式菌株作为参比对象，运用MEGA5.05软件构建系统发育树。

1.7解钾细菌发酵条件优化

解钾菌自身的遗传特性、种类成分决定了它对难溶性钾矿石有高效的解钾作用，为尽可能地使菌株XJC-HK-7的解钾率达到最大化，本研究通过优化菌株的培养时间、PH值、钾长石粉量、摇床转速、碳源种类、氮源种类等6个因素，设定每个因素适合的水平数，并通过单因素方差设计，分析在不同培养条件下解钾菌XJC-HK-7的解钾率变化，得出XJC-HK-7的最佳发酵条件。

1.7.1培养时间对解钾量的影响

在LB培养基上将已筛选出的解钾菌株培养24h，然后接种到无菌水中，置于摇床上充分震荡，制成悬液备用；另配制解钾培养基(无钾)，取100mL分装于已加有1g钾长石粉的三角瓶(250mL)内，121℃，25min灭菌后，接入1％接种量的备用悬液，37℃，150r/min，分别在培养12h、24h、36h、48h、60h、72h、120h后取样。

1.7.2PH值对解钾量的影响

配制解钾菌备用悬液和无钾解钾培养基(步骤同上)，调节培养液PH值分别为3、4、5、6、7、8、9，培养2d后取样。

1.7.3钾长石粉量对解钾量的影响

配制解钾菌备用悬液和无钾解钾培养基(步骤同上)，分别加入0.5g、1g、1.5g、2.5g、5g、10g的钾长石粉，培养2d后取样。

1.7.4摇床转速对解钾量的影响

配制解钾菌备用悬液和无钾解钾培养基(步骤同上)，分别置于0、50、100、150、200、250r/min转速的摇床上振荡，培养2d后取样。

1.7.5不同碳源种类对解钾量的影响

配制解钾菌备用悬液和无钾解钾培养基(步骤同上)，分别以葡萄糖Glucose、蔗糖Sucrose、乳糖Lactose、果糖Fructose、淀粉Starch、麦芽糖maltose为碳源，培养2d后取样。

1.7.6不同氮源种类对解钾量的影响

配制解钾菌备用悬液和无钾解钾培养基(步骤同上)，分别以氯化铵Ammoniumchloride、硝酸铵Ammonium nitrate、硫酸铵Ammonium sulfate、硝酸钠Sodium nitrate、酵母粉yeast extract、蛋白胨peptone为氮源，培养2d后取样。

1.8数据处理

采用WPS和SAS9.1统计软件DUI对实验数据进行分析及多重比较。

2结果与分析

2.1根际土壤解钾菌的筛选

对香蕉根际土壤样品进行涂布处理，初步筛选得到248株菌，通过分离、初筛等步骤挑取16株生长效率高、具高效解钾能力的菌株，再经过优化发酵条件、采用过氧化氢灰化法^]等进一步地优化鉴定菌株，并使用火焰原子吸收分光光度计测定这16株解钾细菌的可溶性解钾含量，得出其解钾能力均较强。其中接种XJC-HK-7菌株的培养液所产生的速效钾含量最高，解钾效果较其他菌株更加明显，因此确定以XJC-HK-7菌株为实验研究对象，进行生理生化特性鉴定和发酵条件优化，分析其解钾特性的变化为后续研究奠定基础。

2.2解钾菌XJC-HK-7的生理生化鉴定

经过生理生化鉴定表明(详见表2)：菌株能使明胶液化，接触酶、硝酸盐还原、甲基红等试验呈现阳性；不能水解淀粉、纤维素，丙二酸、乙酰甲基甲醇、硫化氢等试验呈现阴性。

在碳源利用方面：菌株XJC-HK-7可以利用α-乳糖、D-纤维二糖、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-山梨醇、D-海藻糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、L-苯丙氨酸、棉子糖、木聚糖、肌醇、松三糖、鼠李糖、水杨苷、可溶性淀粉和蔗糖，但不能利用核糖。

在氮源利用方面：菌株XJC-HK-7可以利用L-精氨酸、L-苯基丙氨酸、甘氨酸、L-乙硫氨酸、缬氨酸、硝酸铵、组氨酸和乙酸铵作为唯一氮源，却不能利用L-丝氨酸、蛋氨酸、L-羟基脯氨酸、L-半胱氨酸、氯化铵、硫酸铵、草酸铵和四水合钼氨酸。

菌株XJC-HK-7生长的最适合该菌株生长的温度为37℃，pH值为6.0；只能生长在NaCl含量小于11％的培养基上。

表2菌株XJC-HK-7的部分生理生化特征

“+”：结果为阳性；“－”：结果为阴性。

2.3菌株16S rDNA分子生物学鉴定

对XJC-HK-7菌株进行16S rDNA分子生物学鉴定，获得1530bp的基因片段，将测序所得信息载入GenBank数据库，运用EzTaxon和GenBank比对基因序列的相似性，并选取20株同源性较高的标准菌株序列，与待测菌株XJC-HK-7的基因序列构建系统发育树(图1所示)。基于16S rDNA序列相似性比较分析和系统发育树可以看出，XJC-HK-7与厦门芽孢杆菌Bacillus xiamenensis HYC-10(AMSH01000114)亲缘关系最近，同源性最高，且相似率均达98.9％。根据系统发育树相似性和同源性分析，菌株XJC-HK-7和Bacillus xiamenensis聚于同一个分支上，且进化关系和距离最近，结合形态特征、培养特征和生理生化特征，鉴定此菌株为厦门芽孢杆菌(Bacillus xiamenensis)，命名为厦门芽孢杆菌XJC-HK-7(Bacillus xiamenensis XJC-HK-7)。

2.4解钾菌XJC-HK-7发酵条件的研究

2.4.1不同培养时间对解钾菌解钾量的影响

如图2所示，在72h内，菌株XJC-HK-7对钾长石的解钾能力变化显著。当培养时间从12h增加到48h时，解钾量总体呈上升趋势，并在48h时达到峰值，解钾量为26.30mg/L；在48h之后，60h、72h、120h的解钾率略有下降并保持较平稳状态，分别为14.56mg/L、14.29mg/L、13.63mg/L。结果表明，菌株XJC-HK-7在培养了48h后的解钾能力最强，在48h以后因受代谢产物的影响，其解钾能力略有降低但基本处于平稳状态。这对今后开发具有稳定解钾能力的菌肥生产具有十分重要的意义。

2.4.2不同PH值条件对解钾菌解钾量的影响

据图3可知，调节培养PH值可使菌株XJC-HK-7的解钾能力发生显著变化.设定PH值从3-9，菌株解钾能力总体为先升后降，在PH为6时达到峰值，解钾量为27.64mg/L,当PH＝9时解钾量降至最低值3.23ml/L。结果表明，改变PH值对菌株XJC-HK-7的解钾量变化有显著影响，菌株XJC-HK-7最适合酸性环境下生长，这为改良土壤肥力提供有利依据。

2.4.3不同钾长石粉量对解钾菌解钾量的影响

据图4可知，在钾长石粉量为0.5g和1g时，解钾量变化甚小，分别为10.43mg/L和17.90mg/L；当增加到1.5g、2.5g和5g时，菌株解钾能力呈稳定增加趋势，解钾量分别为30.17mg/L、34.97mg/L和48.17mg/L；当加入10g的钾长石粉时，菌株的解钾能力最强，解钾量为57.91mg/L。结果表明，菌株XJC-HK-7的解钾能力随着钾长石粉量的增加而递增，不溶性钾矿石含量越高，解钾能力越高，这对充分利用土壤钾元素有着重要的意义。

2.4.4不同摇床转速对解钾菌解钾量的影响

据图5可知，从0到250r/min为观察周期，摇速每间隔50r/min提取一次培养液测定其解钾量，在0、50、100、150、200r/min时，解钾量稳定增加；当摇床转速为250r/min时，菌株解钾量为26.70mg/L达到峰值，比转速200r/min时略高，但基本保持恒定。结果表明，不同摇床转速对菌株XJC-HK-7的解钾能力产生显著影响，摇速增大时，解钾量也随之增加，并在250r/min转速时，解钾量最佳。

2.4.5不同碳源种类对解钾菌解钾量的影响

据图6可知，不同碳源种类对菌株解钾量影响的强弱顺序为蔗糖＞葡萄糖＞乳糖＞果糖＞淀粉＞麦芽糖。以蔗糖为碳源时，接种了菌株XJC-HK-7的培养液解钾量最大，达到32.62mg/L，其次是葡萄糖；以麦芽糖碳源时，解钾效果最差，解钾量降至1.56mg/L。结果表明：该解钾菌发酵培养时，以蔗糖、葡萄糖、乳糖为碳源，发酵效果最好，解钾量最大，其中蔗糖是发酵时的最佳碳源。

2.4.6不同氮源种类对解钾菌解钾量的影响

据图7可知，不同的氮源种类对解钾菌解钾量的影响强弱顺序为：硫酸铵＞氯化铵＞硝酸铵＞硝酸钠＞酵母粉＞蛋白胨，以硫酸铵为氮源时，解钾量达42.0mg/L，以蛋白胨为氮源时，解钾效果最差，解钾量为2.33mg/L。结果表明：解钾菌XJC-HK-7发酵培养时，对氮源的利用以有机氮为主，有机氮利用效率优于无机氮，且以硫酸铵为氮源，发酵效果最好。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (9)

1.一种解钾菌，其特征在于，其为厦门芽孢杆菌XJC-HK-7，保藏编号为CCTCC NO：M2017619。

2.权利要求1所述的解钾菌在土壤解钾中的应用。

3.权利要求1所述的解钾菌在促进植物生长、减少化肥用量中的应用。

4.权利要求1所述的解钾菌的发酵液或发酵液的过滤液。

5.根据权利要求4所述的发酵液或发酵液的过滤液，其特征在于，所述解钾菌的发酵条件为：以α-乳糖、D-纤维二糖、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-山梨醇、D-海藻糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、L-苯丙氨酸、棉子糖、木聚糖、肌醇、松三糖、鼠李糖、水杨苷、可溶性淀粉和蔗糖中的一种或多种为碳源，以L-精氨酸、L-苯基丙氨酸、甘氨酸、L-乙硫氨酸、缬氨酸、硝酸铵、组氨酸和乙酸铵中的一种或多种为氮源，PH值为3-9，摇床转速为0-250r/min，培养时间12-120h，钾长石粉量为0.5-10g。

6.根据权利要求5所述的发酵液或发酵液的过滤液，其特征在于，所述解钾菌的发酵条件为：以蔗糖为碳源，以硫酸铵为氮源，培养温度为34-37℃，PH值为6-8，摇床转速为200-250r/min，培养时间36-48h，钾长石粉量为5-10g。

7.权利要求4所述的解钾菌的发酵液或发酵液的过滤液在土壤解钾中的应用。

8.权利要求1所述的解钾菌的发酵液或发酵液的过滤液在促进植物生长、减少化肥用量中的应用。

9.一种菌肥，其特征在于，含有权利要求1所述的解钾菌。