CN115058355B - 一株耐热且高产蛋白酶的蜡状芽孢杆菌sh-831及其应用 - Google Patents

一株耐热且高产蛋白酶的蜡状芽孢杆菌sh-831及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115058355B
CN115058355B CN202210609343.2A CN202210609343A CN115058355B CN 115058355 B CN115058355 B CN 115058355B CN 202210609343 A CN202210609343 A CN 202210609343A CN 115058355 B CN115058355 B CN 115058355B
Authority
CN
China
Prior art keywords
peanut bran
bacillus cereus
culture medium
extract
strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210609343.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115058355A (zh
Inventor
沈宏
卢波斯
沈丁熠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Agricultural University
Original Assignee
South China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Agricultural University filed Critical South China Agricultural University
Priority to CN202210609343.2A priority Critical patent/CN115058355B/zh
Publication of CN115058355A publication Critical patent/CN115058355A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115058355B publication Critical patent/CN115058355B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F17/00—Preparation of fertilisers characterised by biological or biochemical treatment steps, e.g. composting or fermentation
    • C05F17/20—Preparation of fertilisers characterised by biological or biochemical treatment steps, e.g. composting or fermentation using specific microorganisms or substances, e.g. enzymes, for activating or stimulating the treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/10—Citrulline; Arginine; Ornithine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/20—Aspartic acid; Asparagine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/222—Phenylalanine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/225—Tyrosine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/085—Bacillus cereus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一株耐热且高产蛋白酶的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)SH‑831及其应用。该菌株已经于2022年4月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号：GDMCC NO.62347。本发明提供产蛋白酶的(Bacillus cereus)SH‑831菌株，该菌株能分泌高活性蛋白酶NpSH831，其最大酶活性为871.2U/mL。该菌株在55℃下能正常生长，可发酵花生麸、脱脂大豆粉和鱼粉，制备蛋白水解物，具有广泛的应用前景。

Description

一株耐热且高产蛋白酶的蜡状芽孢杆菌SH-831及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株耐热且高产蛋白酶的蜡状芽孢杆菌SH-831及其应用。
背景技术
化肥的大量施用的确给农作物带来了丰富的产量，但化肥的持续投入而导致的土壤问题也逐渐显现，当尿素施用在土壤表层后，酰胺态氮迅速被转化为铵态氮，随后经过硝化作用转化成硝态氮，通过雨水等下层运动渗入深层土壤导致土壤pH降低，使得土壤中的一些重金属溶解度增大，给作物和人类带了危害，部分硝态氮还会随水流入江河、湖泊造成水体富营养化。长期的化肥施用还会改变土壤微生物结构，降低有益微生物数量。土壤的好坏很大程度取决于土壤中有机质的含量，有机肥的使用使得土壤的物理化学性质均得到了改善，有机肥不仅能改善土壤保水能力、土壤通气空隙、土壤团粒结构还能改善土壤微生物总量从而提高养分转化利用效率，提升作物产量。
花生麸是花生榨油后的副产物，含有丰富的营养成分，其中蛋白质的含量就高达30％-50％，同时还包含17种主要氨基酸、黄酮类物质及磷钾元素，是一种优质的有机肥原料。我国每年可产生约600万吨的花生麸，然而，由于高温压榨使得花生中的蛋白质结构变性，且花生麸自身氨基酸组分不均衡以及存在非淀粉多糖和植酸等抗营养因子等问题，较大的限制了花生麸的应用。在农业领域，国内对花生麸的处理多集中于通过酶解工艺生产蛋白水解物和从蛋白前体中释放生物活性肽，进而提高蛋白质的利用率。
目前，关于花生麸的发酵主要是通过堆肥发酵和添加复合菌剂的液体发酵，不论何种方式的发酵都会不同程度的导致整个体系的温度升高从而影响部分有益微生物的活性，因此产品的质量稳定性不能得到保证，甚至在发酵过程中还存在菌株之间的相互拮抗等作用。
因此，开发一种可适用于农业低值有机物料高效发酵的新菌种具有重要的研究意义和经济价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷或不足，提供一种耐热且高产蛋白酶的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)SH-831。本发明提供的高产蛋白酶的(Bacillus cereus)SH-831具有较好的产酶特性，在培养过程中可分泌高活性的胞外蛋白酶NpSH831，优化产酶培养基后酶活为871.2U/mL，在26-55℃范围内均可正常生长；利用该菌株可以用于发酵花生麸、脱脂大豆粉及鱼粉的制得相应蛋白水解物，发酵周期短，应用范围广。
本发明的另一目的在于提供上述蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)SH-831在制备蛋白酶中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种制备蛋白酶的方法。
本发明的另一目的在于提供上述蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)SH-831在制备花生麸提取液、大豆提取液或鱼蛋白提取液中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种制备花生麸提取液的方法。
本发明的另一目的在于提供一种制备大豆提取液的方法。
本发明的另一目的在于提供一种制备鱼蛋白提取液的方法。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一株耐热且高产蛋白酶的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)SH-831，所述菌株于2022年4月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为GDMCCNO:62347。
本发明的发明人从华南农业大学树木园土壤中筛选得到一种高产蛋白酶的菌株(Bacillus cereus)SH-831，该菌株在唯一氮源为脱脂奶粉的培养基上能分泌胞外蛋白酶形成较大透明圈，适宜生长温度在28℃～55℃，适宜生长pH5～7，通过对该菌株的16S rDNA进行测序，再将序列在NCBI上进行BLAST比对，结果表明该菌株与Bacillus cereus相似性达到99％，因此确定该菌株为蜡状芽孢杆菌，并将其命名为Bacillus cereus SH-831。
该菌株于2022年4月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为GDMCCNO.62347。
优选地，所述菌株的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。具体如下：
ACTGTCAGCTTAGGCGGCTGGCTCCAAAAAGGTTACCCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATGAGATTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCTCCCGAAGGAGAAGCCCTATCTCTAGGGTTTTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAACTTCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTCAACTAGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGCCGAAGCCGCCTTTCAATTTCGAACCATGCGGTTCAAAATGTTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACTTCATAAGAGCAAGCTCTTAATCCATTCGCTCGACTGCATTATAGCACCCCGCC。
本发明提供的蜡状芽孢杆菌SH-831菌落特征和生化特征如下：
蜡状芽孢杆菌SH-831菌苔呈扁圆形，色泽灰白，质地软，菌落大，不规则，易挑起，无明显粘液分泌。
上述蜡状芽孢杆菌SH-831在制备蛋白酶中的应用也在本发明的保护范围内。
一种制备蛋白酶的方法，包括如下步骤：将上述蜡状芽孢杆菌SH-831接种于培养基中培养，离心，取上清液，即得含蛋白酶的粗酶液；
所述培养基由如下质量浓度的组分组成：脱脂奶粉5～10g/L，氯化钠1～4g/L，磷酸氢二钾0.1～1g/L。
蜡状芽孢杆菌SH-831在唯一氮源为脱脂奶粉的培养基上能分泌胞外蛋白酶形成较大透明圈，该胞外蛋白酶具有较高的活性。
酶活测定采用SB/T 10317-1999福林法，优化培养基后SH-831菌株的产酶活性为871.2U/mL。
优选地，所述培养基的pH为5～7。
优选地，所述蜡状芽孢杆菌SH-831的接种量为0.1％～1％(以培养基的总质量计)。
优选地，所述培养的温度为28～55℃。
优选地，所述培养的时间为8～15h。
优选地，所述培养为摇床培养，转速为150～200r/min。
优选地，所述离心的过程为：在4～15℃(优选为4℃)下离心8～15min(优选为10min)，取上清液。
上述蜡状芽孢杆菌SH-831在制备花生麸提取液中的应用也在本发明的保护范围内。
一种制备花生麸提取液的方法，包括如下步骤：
S11：将上述蜡状芽孢杆菌SH-831接种于培养基中培养，得到SH-831菌液，备用；
所述培养基由如下质量浓度的组分组成：脱脂奶粉5～10g/L，氯化钠1～4g/L，磷酸氢二钾0.1～1g/L；所述培养基的pH为5～7；
S12：将花生麸粉剂分散于水中得花生麸悬浊液；
S13：调节花生麸悬浊液的pH为9.0～11.0，然后加入碱性蛋白酶，反应；
S14：调节S13所得花生麸悬浊液的pH为6.5～7.5，加入S11所制得的SH-831菌液、氯化钠和磷酸氢二钾，发酵，离心，即得所述花生麸提取液。
利用碱性蛋白酶对花生麸进行酶解可使花生麸中部分大分子蛋白质降解成多肽和氨基酸；然后再利用SH-831的菌液对花生麸进一步的发酵可使花生麸中所有大分子蛋白降解成小分子活性寡肽、氨基酸，同时对花生麸中多糖及脂类物质进行降解；最终得到的花生麸提取液具有较高的蛋白产率，抗氧化活性好，且具有减肥增效，促进葡萄着色的优点；整个制备工艺过程可控，发酵周期短。
S11中所述蜡状芽孢杆菌SH-831的培养及SH-831菌液的获得的条件与前述制备蛋白酶的方法一致。
优选地，S12中所述花生麸悬浊液的质量分数为10～15％。
优选地，S12中所述花生麸粉剂通过如下过程制备得到：取花生麸原料，在50～70℃条件下恒温烘干6～8h，然后用磨样机粉碎，过筛(例如100目筛)，即得所述花生麸粉剂。
优选地，S13中所述碱性蛋白酶的添加量为0.01～0.05％(以培养基的总质量计)。进一步优选为0.05％(w/w)。
优选地，S13中所述反应的过程为120～180r/min，35～50℃条件下反应6～10h。
优选地，S13中所述碱性蛋白酶的酶活为100000～300000U/g。
优选地，S14中所述含蛋白酶的粗酶液与花生麸悬浊液的质量比为0.005～0.01:1。进一步优选为0.005:1(w/w)。
优选地，S14中所述氯化钠的添加量为1～3g/L(以S14中发酵前体系的总量计)。
优选地，S14中所述磷酸氢二钾的添加量为0.1～1g/L(以S14中发酵前体系的总量计)。
优选地，S14中所述发酵的过程为：120～180r/min，26～35℃条件下发酵3～5d。
上述蜡状芽孢杆菌SH-831在制备鱼蛋白提取液中的应用也在本发明的保护范围内。
鱼粉是用多种鱼类为原料，经去油、脱水、粉碎加工后的高蛋白饲料原料，富含B族维生素、微生物A、D、E等脂溶性维生素及矿物质，是制备鱼蛋白的首选材料。
一种制备鱼蛋白提取液的方法，包括如下步骤：
S21：将上述蜡状芽孢杆菌SH-831接种于培养基中培养，得到SH-831菌液，备用；
所述培养基由如下质量浓度的组分组成：脱脂奶粉5～10g/L，氯化钠1～4g/L，磷酸氢二钾0.1～1g/L；所述培养基的pH为5～7；
S22：将鱼粉剂分散于水中得鱼粉悬浊液；
S23：向鱼粉悬浊液中加入S21制得的SH-831菌液、氯化钠和磷酸氢二钾，发酵，离心，即得所述鱼蛋白提取液。
利用SH-831菌液对鱼粉进行发酵可使鱼粉中的蛋白质、脂类物质降解成小分子活性物质；最终得到的鱼蛋白提取液具有较高的蛋白产率，整个制备工艺过程可控，发酵周期短。
S21中所述蜡状芽孢杆菌SH-831的培养基、SH-831液的获得的条件与前述培养SH-831菌液的方法一致。
优选地，S22中所述鱼粉悬浊液的质量分数为10～15％；
优选地，所述鱼粉剂通过如下过程制备得到：鱼粉原料，在50～70℃条件下恒温烘干6～8h，然后用磨样机粉碎，过筛(例如100目筛)，即得所述鱼粉剂。
优选地，S23中所述SH-831菌液与鱼蛋白悬浊液的质量比为0.005～0.01:1。
优选地，S23中所述氯化钠的添加量为1～3g/L(以S23中发酵前体系的总量计)。
优选地，S23中所述磷酸氢二钾的添加量为0.1～1g/L(以S23中发酵前体系的总量计)。
优选地，S23中所述发酵的过程为：120～180r/min，25-35℃条件下发酵3～5d。
脱脂大豆粉是大豆经过提取油脂后加工而成的粉状产品，脱脂大豆粉中含有较高的赖氨酸和糖类，蛋白质含量超过50％，是一种优良的蛋白原料。
上述蜡状芽孢杆菌SH-831在制备大豆提取液中的应用也在本发明的保护范围内。
一种制备大豆提取液的方法，包括如下步骤：
S31：将上述蜡状芽孢杆菌SH-831接种于培养基中培养，得到SH-831菌液，备用；
所述培养基由如下质量浓度的组分组成：脱脂奶粉5～10g/L，氯化钠1～4g/L，磷酸氢二钾0.1～1g/L；所述培养基的pH为5～7；
S32：将脱脂大豆粉剂分散于水中得大豆悬浊液；
S33：向大豆悬浊液中加入S31制得的SH-831菌液、氯化钠和磷酸氢二钾，发酵，离心，即得所述鱼蛋白提取液。
利用含SH-831菌液对脱脂大豆粉进行发酵可使大豆中的大分子量蛋白质降解成小分子寡肽和氨基酸，脂类及多糖物质得到一定程度的分解；最终得到的大豆提取液具有较高的蛋白产率，整个制备工艺过程可控，发酵周期短。
S31中所述蜡状芽孢杆菌SH-831的培养及SH-831菌液的获得的条件与前述获得SH-831菌液的方法一致。
优选地，S32中所述大豆悬浊液的质量分数为10～15％；
优选地，所述脱脂大豆粉剂通过如下过程制备得到：大豆原料，在50～70℃条件下恒温烘干6～8h，然后用磨样机粉碎，过筛(例如100目筛)，即得所述大豆粉剂。
优选地，S33中所述含SH-831菌液与大豆悬浊液的质量比为0.005～0.01:1。
优选地，S33中所述氯化钠的添加量为1～3g/L(以S33中发酵前体系的总量计)。
优选地，S33中所述磷酸氢二钾的添加量为0.1～1g/L(以S33中发酵前体系的总量计)。
优选地，S33中所述发酵的过程为120～180r/min，25～35℃条件下发酵3～5d。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明筛选出的蜡状芽孢杆菌SH-831具有较好的产酶特性，在培养过程中可分泌高活性的胞外蛋白酶，酶活性为871.2U/mL；SH-831菌株在温度为55℃条件下仍可以正常生长，相对酶活性为37.2％。该菌株可以用于发酵花生麸、脱脂大豆粉及鱼粉，从而制得相应的蛋白水解物，发酵周期短，应用范围广。
附图说明
图1-A是SH-831菌株在唯一氮源为脱脂奶粉上菌落图，图1-B是SH-831菌株的扫描电镜图，图1-C是SH-831菌株与其他同属菌株的同源进化树图。
图2-A是SH-831菌株的生长曲线图，图2-B是SH-831菌株的产酶曲线图，图2-C是SH-831菌株在不同温度下生长曲线图。
图3是不同条件对SH-831菌株产酶的影响。
图4是SH-831所产中性蛋白酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图。
图5是不同工艺制备花生麸提取液的及产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中蛋白质分布图。
图6是花生麸提取液减肥施用对苗期小白菜生长影响图。
图7-A是对长势均一的葡萄进行标记，图7-B是对葡萄进行不同花生麸提取液的喷施处理，图7-C是不同处理对葡萄着色的影响，图7-D是不同处理对葡萄生理指标的影响。
图8是利用SH-831菌株制备鱼蛋白提取液及产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中蛋白质分布图。
图9是利用SH-831菌株制备大豆提取液及产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中蛋白质分布图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
本发明各实施例所使用的试剂及仪器信息如下；
实施例1产蛋白酶菌株的筛选、鉴定
(1)富集：取采自华南农业大学树木园土壤样品5g和无菌水95g，混匀后置于30℃恒温摇床中30min，取出后静置2h，取上清液1mL接种于100mL/250mL含富集培养基的三角瓶中30℃、180r/min培养2d。
(2)酶活测定：取富集后的发酵液5mL，在12000r/min，4℃条件下离心5min，加入1.0mL酶液，加用0.1mol/L，pH8.0硼酸盐缓冲液2.0mL，在40℃水浴保温10min，精确加入5.0mL 5％三氯乙酸，摇匀，在40℃水浴保温30min后，再加10mg/mL酪蛋白溶液5.0mL，混匀。分别加入5.0mL 5％三氯乙酸和8.0mL0.1mol/L(pH8.0)硼酸缓冲液，混合。3500r/min离心10min，分别取上清液。酶活定义为：每毫升酶液每分钟产生1μg酪氨酸所需要的酶量定义为1个酶活单位U/mL。
(3)分离纯化：将具有酶活的富集液按照10-4～10-7梯度稀释后均匀的涂布到固体培养基平板上，28℃恒温培养2d，观察平板上的菌落生长状况，挑取具有明显透明圈的菌苔重复纯化3次。结果如图1-A所示。
(4)菌种保存：将纯化后的菌株接于种子培养基中生长8h，取40％甘油按1:1的比例将菌液保存于-80℃冰箱。
(5)菌株形态测定：由图1-A可知，SH-831菌苔呈扁圆形，色泽灰白，质地软，菌落大，不规则，边缘光滑，易挑起，无明显粘液分泌，采用扫面电镜观察菌株形态结果如图1-B所示，SH-831单个菌直径在2-3um，呈短棒状。
(6)菌株生理生化特性鉴定：参照《常见细菌系统鉴定手册》的方法进行，测试菌株的过氧化氢酶、V-P试验、接触酶、硝酸盐还原试验、柠檬酸试验、麦芽糖、葡萄糖、甲基红试验、甘露醇，脲酶试验，结果如表1所示。结果显示SH-831与蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)菌株的生理生化特性基本一致。
表1 SH-831菌株的生理生化特性
测试指标 结果
甲基红试验 -
硝酸盐还原试验 +
柠檬酸盐试验 +
淀粉水解试验 +
葡萄糖试验 +
蔗糖试验 +
过氧化氢酶试验 +
麦芽糖试验 +
V-P试验 +
甘露醇 -
接触酶试验 +
脲酶 -
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。
(7)菌株的鉴定：刮取微量菌苔加入到150μL无菌水中，混匀后煮沸10min，12000r/min条件下离心10min，取上清液进行PCR扩增。采用细菌16S rDNA通用引物(正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增，扩增程序为：94℃5min；98℃10s，55℃30s，72℃1kb/1min，35个循环；72℃10min；4℃保存。获得的PCR产物利用1％的琼脂糖凝胶电泳验证后，交由广州天一辉远基因科技有限公司进行测序。将测序结果提交到NCBI数据库，利用Blast程序搜索同源序列，选出同源性高的菌株16SrDNA序列为参比对象，通过MEGA7.0软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树。经鉴定该菌株属于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，并命名为蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)SH-831。该菌与其近源菌株16S rDNA序列构建的系统发育进化树如图1-C所示。
实施例2菌株生长曲线的测定及产酶曲线测定
将已经纯化的蜡状芽孢杆菌SH-831在生长培养基上划线生长，挑取单菌落上的少量菌苔接种于100mL/250mL含生长培养基的三角瓶中，用紫外分光光度计在600nm处测定菌株的生长曲线，结果如图2-A所示，由图2-A可知，SH-831菌株在初始的几个小时几乎没有生长，生长到第4h时，菌株逐渐进入对数生长期，随后菌体数量达到平衡，超过14h时，培养基的OD值开始下降，可能与培养基中养分逐渐耗尽，菌体自溶有关。由图2-B可知，SH-831菌株在0～4h时产蛋白酶活性较低，在生长至10h时产酶活性达到最高，随后保持稳定的最高活性4h不下降，在14h后蛋白酶活性逐渐开始降低，这可能和培养基中营养逐渐消耗，菌株产酶受到抑制。由图2-C可知，不同温度对SH-831菌株的生长均有一定影响，在26-36℃之间菌株的OD600(菌体浓度)较高，随着温度的下降或升高，菌株的生长速率逐渐放缓，当温度达到60℃时，菌株几乎不会生长，但在24-55℃，SH-831菌株具有较好的耐热性，可以较好的适应自然发酵过程中的温度变化。
实施例3 SH-831菌株的产酶优选培养基组分及蛋白酶的纯化
测定不同温度(26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、55、60℃)、初始pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)、盐分离子及浓度对SH-831菌株的产酶的影响，使该菌株具有较好产酶环境。结果如图3所示，SH-831菌株在温度30℃～32℃时、初始pH7.0～7.5时产酶活性最高，说明SH-831菌株所产的蛋白酶为中性蛋白酶，不同的浓度的盐分离子对菌株产酶活性影响较大，氯化钠在浓度4g/L～6g/L时产酶活性最高，磷酸氢二钾浓度在0.9g/L～1.2g/L时菌株产酶活性较高，因此，选择在温度30℃、初始pH7.0、氯化钠4g/L、磷酸氢二钾1g/L为该菌株较优培养基条件。
采用硫酸铵分级沉淀法纯化目标蛋白，磁力搅拌下，向粗酶液中缓慢添加硫酸铵晶体，待其完全溶解，使硫酸铵饱和浓度分别在0-30％、30％-50％、50％-70％、70％-90％时，8000r/min，4℃条件下离心10min，收集沉淀，将收集到的沉淀置于pH7.0、20mmol/L的磷酸缓冲溶液中完全溶解，4℃下使用14kDa透析袋透析36h并测定酶活，选择酶活最高的硫酸饱和浓度范围对酶蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDA-PAGE)试验，结果如图4所示，与Marker比对后发现目标蛋白分子量越为90kDa。
实施例4花生麸提取液的制备
试验组1(酶+菌解处理的花生麸提取液的制备)：
(1)取花生麸原料，在50℃条件下恒温烘干8h，然后用磨样机粉碎，过100目筛，得到花生麸粉剂。
(2)称取花生麸粉剂500g，加水4.5L后搅拌使其均匀分散得到花生麸悬浊液。
(3)用2mol/L的氢氧化钠调节步骤(2)中的花生麸悬浊液pH 10.0。
(4)向步骤(3)中的花生麸悬浊液中添加2.5g的碱性蛋白酶，120r/min，50℃条件下反应8h。
(5)用2mol/L的盐酸调节步骤(4)中的花生麸悬浊液pH为7.0，添加10mL蜡状芽孢杆菌SH-831菌液，添加氯化钠2g/L，磷酸氢二钾1g/L，120r/min搅拌条件下，30℃发酵4d。
(6)将发酵完成的花生麸溶液在12000r/min，4℃条件下离心得到上清液即为花生麸提取液。
试验组2：酶+菌解处理的花生麸提取液的制备
(1)取花生麸原料，在50℃条件下恒温烘干8h，然后用磨样机粉碎，过100目筛，得到花生麸粉剂。
(2)称取花生麸粉剂500g，加水4.5L后搅拌使其均匀分散得到花生麸悬浊液。
(3)用2mol/L的氢氧化钠调节步骤(2)中的花生麸悬浊液pH 10.0。
(4)向步骤(3)中的花生麸悬浊液中添加2.5g的碱性蛋白酶，120r/min，50℃条件下反应8h。
(5)用2mol/L的盐酸调节步骤(4)中的花生麸悬浊液pH为7.0，添加1mL蜡状芽孢杆菌SH-831菌液，添加氯化钠2g/L，磷酸氢二钾1g/L，120r/min搅拌条件下，30℃发酵4d。
(6)将发酵完成的花生麸溶液在12000r/min，4℃条件下离心得到上清液即为花生麸提取液。
除此之外，本实施例还进行了多组不同条件下的花生麸提取液制备的对照试验，具体过程如下：
对照组1：对照处理的花生麸提取液的制备(记为对照)
(1)取花生麸原料，在50℃条件下恒温烘干8h，然后用磨样机粉碎，过100目筛，得到花生麸粉剂。
(2)称取花生麸粉剂500g，加水4.5L后搅拌使其均匀分散得到花生麸悬浊液，浸泡4d得到花生麸溶液。
(3)花生麸溶液在12000r/min，4℃条件下离心得到上清液即为花生麸提取液。
对照组2：碱提处理的花生麸提取液的制备(记为碱提)
(1)取花生麸原料，在50℃条件下恒温烘干8h，然后用磨样机粉碎，过100目筛，得到花生麸粉剂。
(2)称取花生麸粉剂500g，加水4.5L后搅拌使其均匀分散得到花生麸悬浊液。
(3)用2mol/L的氢氧化钠调节步骤(2)中的花生麸悬浊液pH 10.0，浸泡4d得到花生麸溶液。
(4)花生麸溶液在12000r/min，4℃条件下离心得到上清液即为花生麸提取液。
对照组3：菌解处理的花生麸提取液的制备(记为菌解)
(1)取花生麸原料，在50℃条件下恒温烘干8h，然后用磨样机粉碎，过100目筛，得到花生麸粉剂。
(2)称取花生麸粉剂500g，加水4.5L后搅拌使其均匀分散得到花生麸悬浊液。
(3)向步骤(2)中的花生麸悬浊液中添加10mL蜡状芽孢杆菌SH-831菌液，添加氯化钠2g/L，磷酸氢二钾1g/L，120r/min搅拌条件下，30℃发酵4d。
(4)将发酵完成的花生麸溶液在12000r/min，4℃条件下离心得到上清液即为花生麸提取液。
对照组4：酶解处理的花生麸提取液的制备(记为酶解)
(1)取花生麸原料，在50℃条件下恒温烘干8h，然后用磨样机粉碎，过100目筛，得到花生麸粉剂。
(2)称取花生麸粉剂500g，加水4.5L后搅拌使其均匀分散得到花生麸悬浊液。
(3)用2mol/L的氢氧化钠调节步骤(2)中的花生麸悬浊液pH 10.0。
(4)向步骤(3)中的花生麸悬浊液中添加2.5g的碱性蛋白酶，120r/min，50℃条件下反应8h，升温至95℃灭活酶蛋白后浸泡4d得到花生麸溶液。
(5)将花生麸溶液在12000r/min，4℃条件下离心得到上清液即为花生麸提取液。
一、花生麸降解率的测定
测定实施例4中试验组及对照组1～4花生麸降解率，取100mL花生麸发酵液，10000r/min，4℃条件下离心10min，倒出上清液后将麸渣50℃烘干，测定剩余质量计算降解率。对照处理仅等量水，结果如表2所示。
表2不同处理下花生麸渣的得率
Figure BDA0003672559970000131
从表2可知，清水浸泡花生麸悬浊液(对照组1)5天后可以使其中极少量的物质溶出，但碱液处理(对照组2)的花生麸悬浊液可以使部分花生蛋白迅速溶出，单一的菌解处理(对照组3)可以使花生麸产率达到34.6％，单一的酶解处理(对照例4)可以使花生麸产率达到29.5％。而将酶解与菌解结合的处理(试验组1和试验组2)可以使花生麸产率分别提高到47.8％和43.6％。
二、花生麸提取液中游离氨基酸、多肽、蛋白分布测定
花生麸提取液中多肽和游离氨基酸的测定，按照GB/T22492-2008的方法计算多肽含量，GB 5009.124-2016的方法测定游离氨基酸含量。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳试验验证不同处理对花生麸蛋白分布的影响，结果如图5所示，结果显示，对照组1中用清水浸泡花生麸粉剂仅有少量的蛋白溶解出来；而对照组2中用碱提的花生麸中蛋白含量明显多于对照组1的处理；对照组4的酶解处理中，花生麸提取液中有小分子蛋白产生，菌解处理可以使花生麸中的蛋白溶出率增加，但蛋白分子量较大，而试验组1的酶解+菌解处理中，不仅产生了小分子蛋白且含量较高。
氨基酸及多肽含量结果如表3所示，实施例4中试验组1处理得到的花生麸提取物的多肽含量明显高于对照组1处理，不同种类氨基酸也均有较大变化。
表3花生麸提取液中多肽和游离氨基酸含量的测定
Figure BDA0003672559970000141
三、花生麸提取液的抗氧化试验
选用试验组和各对照组得到的花生麸提取液，测定不同处理花生麸提取物的DPPH清除率、羟基自由基清除率、超氧阴离子清除率。表4结果显示，酶+菌解制备的花生麸提取液的抗氧化能力均得到了提升，这可能是因为菌在生长过程中降解花生麸中的大分子蛋白得到了一些具有抗氧化性能小分子寡肽，也可能是菌的自身代谢产物具有抗氧化能力。
表4不同处理花生麸提取液的抗氧化能力
Figure BDA0003672559970000151
注：不同字母间代表显著差异(p＜0.05)，下同
四、花生麸提取液对小白菜生长的影响
试验地点：盆栽试验位于华南农业大学网室
于大棚中，将已经生长至两叶一心的小白菜幼苗移栽到同样大小的装有等量、等土质的塑料盆内，相对湿度80％～90％，温度20℃～30℃，设置5组处理，分别为：对照处理、正常施肥处理(16-16-16复合肥，施用量1g/kg土)、90％常规肥+花生麸提取液处理、80％常规肥+花生麸提取液处理、70％常规肥+花生麸提取液处理。移栽后将试验组所制备的花生麸提取液稀释250倍喷施处理，每周喷施一次，喷施至叶片润湿即可，处理14天后测定小白菜的生理指标，结果如图6所示。其中花生麸提取液均通过试验组1得到。
表5不同施肥处理对苗期小白菜生长的影响
处理 株高(cm) 茎粗(mm) SPAD 整株鲜重(g)
对照 9.2±0.32d 4.2±0.22d 23.4±0.56e 18.7±0.34d
正常施肥 13.2±0.14b 6.7±0.08a 27.6±0.24b 26.4±0.21b
90％常规施肥+提取液 13.5±0.15a 6.5±0.06b 30.4±0.16a 28.3±0.20a
80％常规施肥+提取液 13.2±0.21ab 6.4±0.12b 26.3±0.18c 25.7±0.60b
70％常规施肥+提取液 11.1±0.17c 5.7±0.08c 25.1±0.18d 22.4±0.32c
上述结果显示，花生麸提取液做叶面肥可以促进小白菜的生长，与正常施肥处理相比，减量90％施肥+花生麸提取液处理的整株鲜重、SPAD值分别提高了7.2％、10.1％，株高和茎粗差异不大，可能是因为生长时间尚短，减量80％施肥+花生麸提取液处理与正常施肥处理差异不大，而当减肥30％时，小白菜生长明显受到一定程度的抑制，说明花生麸提取液肥料可以增加小白菜的养分吸收利用率，促进生长。
五、花生麸提取液对葡萄着色的影响
试验地点：广东省广州市白云区丰益果园
试验作物：葡萄
品种：夏黑
试验时间：2021.4.10-2021.5.21
花生麸提取液均通过试验组1得到。
于试验地大棚中，随机挑选并标记长势均一且完成膨大的葡萄串，分别对不同处理葡萄串施用花生麸提取液，花生麸提取液稀释100喷施使用，每个处理设置5个重复对照试验，每周处理一次，对照则用清水处理，一共处理4次，于同年5月观察不同处理对葡萄果实着色的影响，葡萄树的水肥及病害管理措施均保持一致。由图7可知，施用花生麸提取液对葡萄、糖度和着色程度具有明显的促进作用，但对葡萄的果实重量影响不大，其中对照处理的葡萄平均着色面积仅29.6％，而施用花生麸提取液后葡萄的着色面积均有不同程度提升，增幅为46.9％-172.0％，其中先酶解再利用SH-831菌株发酵的花生麸提取液对葡萄着色效果最好。
实施例5鱼蛋白提取液的制备
试验组：
(1)取鱼粉原料，在50℃条件下恒温烘干6h，然后用磨样机粉碎，过100目筛，得到鱼粉剂。
(2)称取鱼粉剂750g，加水4.25L后搅拌使其均匀分散得到鱼粉悬浊液。
(3)添加50mL蜡状芽孢杆菌SH-831菌液，添加氯化钠3g/L，磷酸氢二钾1g/L，120r/min搅拌条件下，30℃条件下发酵3d。
(4)将发酵完成的鱼蛋白溶液在12000r/min，4℃条件下离心得到上清液即为鱼蛋白提取液。
对照组：
(1)取鱼粉原料，在50℃条件下恒温烘干6h，然后用磨样机粉碎，过100目筛，得到鱼粉剂。
(2)称取鱼粉剂750g，加水4.25L后搅拌使其均匀分散得到鱼粉悬浊液。
(3)30℃条件下浸泡3d，得到鱼蛋白溶液。
(4)将鱼蛋白溶液在12000r/min，4℃条件下离心得到上清液即为鱼蛋白提取液。
对鱼蛋白提取液中多肽、游离氨基酸含量、蛋白分布测定。鱼蛋白提取液中多肽和游离氨基酸的测定，按照GB/T22492-2008的方法计算多肽含量，GB5009.124-2016的方法测定游离氨基酸含量。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳试验验证不同处理对鱼蛋白提取液中蛋白分布的影响，结果如图8所示。由表6可知，实施例7的SH-831菌株发酵的鱼粉中小分子多肽的含量提高了78.7％。
表6鱼蛋白提取液中多肽和游离氨基酸含量的测定
Figure BDA0003672559970000171
实施例6大豆提取液的制备
试验组：
(1)取脱脂大豆粉原料，在50℃条件下恒温烘干6h，然后用磨样机粉碎，过100目筛，得到大豆粉剂。
(2)称取大豆粉750g，加水4.25L后搅拌使其均匀分散得到鱼粉悬浊液。
(3)添加50mL蜡状芽孢杆菌SH-831菌液，添加氯化钠3g/L，磷酸氢二钾1g/L，120r/min搅拌条件下，30℃条件下发酵3d。
(4)将发酵完成的大豆溶液在12000r/min，4℃条件下离心得到上清液即为大豆提取液。
对照组：
(1)取脱脂大豆粉原料，在50℃条件下恒温烘干6h，然后用磨样机粉碎，过100目筛，得到大豆粉剂。
(2)称取大豆粉剂750g，加水4.25L后搅拌使其均匀分散得到鱼粉悬浊液。
(3)浸泡3d得到大豆溶液。
(4)将大豆溶液在12000r/min，4℃条件下离心得到上清液即为大豆提取液。
对大豆提取液中多肽、游离氨基酸含量、蛋白分布测定。大豆提取液中多肽和游离氨基酸的测定，按照GB/T22492-2008的方法计算多肽含量，GB 5009.124-2016的方法测定游离氨基酸含量。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳试验验证不同处理对大豆提取液中蛋白分布的影响，结果如图9所示。由表7可知，实施例6试验组利用菌株发酵的大豆提取液中小分子多肽的含量提高了77.2％。
表7大豆提取液中多肽和游离氨基酸含量的测定
Figure BDA0003672559970000181
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一株耐热且高产蛋白酶的蜡状芽孢杆菌SH-831及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1447
<212> DNA
<213> 蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)
<400> 1
actgtcagct taggcggctg gctccaaaaa ggttacccca ccgacttcgg gtgttacaaa 60
ctctcgtggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct 120
gatccgcgat tactagcgat tccagcttca tgtaggcgag ttgcagccta caatccgaac 180
tgagaacggt tttatgagat tagctccacc tcgcggtctt gcagctcttt gtaccgtcca 240
ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct 300
tcctccggtt tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa cttaatgatg gcaactaaga 360
tcaagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa 420
ccatgcacca cctgtcactc tgctcccgaa ggagaagccc tatctctagg gttttcagag 480
gatgtcaaga cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc 540
ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt ttcagccttg cggccgtact ccccaggcgg 600
agtgcttaat gcgttaactt cagcactaaa gggcggaaac cctctaacac ttagcactca 660
tcgtttacgg cgtggactac cagggtatct aatcctgttt gctccccacg ctttcgcgcc 720
tcagtgtcag ttacagacca gaaagtcgcc ttcgccactg gtgttcctcc atatctctac 780
gcatttcacc gctacacatg gaattccact ttcctcttct gcactcaagt ctcccagttt 840
ccaatgaccc tccacggttg agccgtgggc tttcacatca gacttaagaa accacctgcg 900
cgcgctttac gcccaataat tccggataac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct 960
ggcacgtagt tagccgtggc tttctggtta ggtaccgtca aggtgccagc ttattcaact 1020
agcacttgtt cttccctaac aacagagttt tacgacccga aagccttcat cactcacgcg 1080
gcgttgctcc gtcagacttt cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg 1140
agtctgggcc gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc 1200
gttgccttgg tgagccgtta cctcaccaac tagctaatgc gacgcgggtc catccataag 1260
tgacagccga agccgccttt caatttcgaa ccatgcggtt caaaatgtta tccggtatta 1320
gccccggttt cccggagtta tcccagtctt atgggcaggt tacccacgtg ttactcaccc 1380
gtccgccgct aacttcataa gagcaagctc ttaatccatt cgctcgactg cattatagca 1440
ccccgcc 1447

Claims (9)

1.一株耐热且高产蛋白酶的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)SH-831，其特征在于，所述菌株于2022年4月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO.62347。
2.权利要求1所述蜡状芽孢杆菌SH-831在制备蛋白酶中的应用。
3.一种制备蛋白酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述蜡状芽孢杆菌SH-831接种于培养基中培养，离心，取上清液，即得含蛋白酶的粗酶液，其最高活性为871.2U/mL；
所述培养基由如下质量浓度的组分组成：脱脂奶粉5～10g/L，氯化钠1～4g/L，磷酸氢二钾0.1～1g/L。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述培养基的pH为5～7；所述蜡状芽孢杆菌SH-831的接种量为0.1％～1％；所述培养的温度为28～55℃，时间为8～15h；所述培养为摇床培养，转速为150～200r/min。
5.权利要求1所述蜡状芽孢杆菌SH-831在制备花生麸提取液、鱼蛋白提取液或大豆提取液中的应用。
6.一种制备花生麸提取液的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S11：将权利要求1所述蜡状芽孢杆菌SH-831接种于培养基中培养，得到SH-831菌液，备用；
所述培养基由如下质量浓度的组分组成：脱脂奶粉5～10g/L，氯化钠1～4g/L，磷酸氢二钾0.1～1g/L；所述培养基的pH为5～7；
S12：将花生麸粉剂分散于水中得花生麸悬浊液；
S13：调节花生麸悬浊液的pH为9.0～11.0，然后加入碱性蛋白酶降解，得到酶解花生麸产物；
S14：将S13酶解花生麸产物的pH调整为6.5～7.5，加入S11所得SH-831菌液、氯化钠和磷酸氢二钾，发酵，离心，即得所述花生麸提取液，产率可达47.8％。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，S12中所述花生麸悬浊液的质量分数为10～15％；
S13中所述碱性蛋白酶的添加量为0.01～0.05％；所述降解的条件为120～180r/min，35-50℃条件下降解6～10h；
S14中所述SH-831菌液与花生麸悬浊液的质量比为0.005～0.01:1；所述氯化钠的添加量为1～4g/L；所述磷酸氢二钾的添加量为0.1～1g/L；所述发酵的温度为26～35℃，时间为3～5d。
8.一种制备鱼蛋白提取液的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S21：将权利要求1所述蜡状芽孢杆菌SH-831接种于培养基中培养，得到SH-831菌液，备用；
所述培养基由如下质量浓度的组分组成：脱脂奶粉5～10g/L，氯化钠1～4g/L，磷酸氢二钾0.1～1g/L；所述培养基的pH为5～7；
S22：将鱼粉剂分散于水中得鱼粉悬浊液；
S23：向鱼粉悬浊液中加入S21制得的SH-831菌液、氯化钠和磷酸氢二钾，发酵，离心，即得所述鱼蛋白提取液；
S23中所述SH-831菌液与鱼粉的质量比为0.005～0.01:1；所述氯化钠的添加量为1～4g/L；所述磷酸氢二钾的添加量为0.1～1g/L；所述发酵的温度为26～35℃，时间为3～5d。
9.一种制备大豆提取液的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S31：将权利要求1所述蜡状芽孢杆菌SH-831接种于培养基中培养，得到SH-831菌液，备用；
所述培养基由如下质量浓度的组分组成：脱脂奶粉5～10g/L，氯化钠1～4g/L，磷酸氢二钾0.1～1g/L；所述培养基的pH为5～7；
S32：将脱脂大豆粉剂分散于水中得大豆悬浊液；
S33：向大豆悬浊液中加入S31所制得的SH-831菌液、氯化钠和磷酸氢二钾，发酵，离心，即得所述大豆提取液；
S33中所述SH-831菌液与脱脂大豆粉的质量比为0.005～0.01:1；所述氯化钠的添加量为1～4g/L；所述磷酸氢二钾的添加量为0.1～1g/L；所述发酵的温度为26～35℃，时间为3～5d。
CN202210609343.2A 2022-05-31 2022-05-31 一株耐热且高产蛋白酶的蜡状芽孢杆菌sh-831及其应用 Active CN115058355B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210609343.2A CN115058355B (zh) 2022-05-31 2022-05-31 一株耐热且高产蛋白酶的蜡状芽孢杆菌sh-831及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210609343.2A CN115058355B (zh) 2022-05-31 2022-05-31 一株耐热且高产蛋白酶的蜡状芽孢杆菌sh-831及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115058355A CN115058355A (zh) 2022-09-16
CN115058355B true CN115058355B (zh) 2023-06-16

Family

ID=83198911

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210609343.2A Active CN115058355B (zh) 2022-05-31 2022-05-31 一株耐热且高产蛋白酶的蜡状芽孢杆菌sh-831及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115058355B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116410882B (zh) * 2021-12-30 2024-05-07 东北农业大学 一株产耐高温蛋白酶的菌株及其蛋白酶的制备方法
CN114874942A (zh) * 2022-05-18 2022-08-09 四川农业大学 一株产蛋白酶的蜡样芽胞杆菌及其在大曲中的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102517238B (zh) * 2011-12-30 2014-02-26 山东宝来利来生物工程股份有限公司 一株产酸蜡样芽孢杆菌及其应用
CN110656063B (zh) * 2019-10-21 2020-09-25 黄山学院 一种产耐高温蛋白酶菌株
CN112126536B (zh) * 2020-07-07 2021-08-20 山东省农业科学院生物技术研究中心 蜡样芽孢杆菌角蛋白酶的应用及应用方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN115058355A (zh) 2022-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN115058355B (zh) 一株耐热且高产蛋白酶的蜡状芽孢杆菌sh-831及其应用
CN111635284B (zh) 一种聚谷氨酸生物炭基有机肥的制备方法
CN111073839B (zh) 暹罗芽孢杆菌、菌剂及其应用
CN105255771B (zh) 一种产胶原蛋白酶的琥珀葡萄球菌及其应用
CN107058119A (zh) 一种提高蛹虫草液态发酵生产虫草素和耐热蛋白酶产量的方法
CN1289659C (zh) 高温中性蛋白酶菌株、高温中性蛋白酶及其生产工艺
CN112457134A (zh) 一种用于改善土质的树根发酵肥料及其制备方法
CN105349453B (zh) 一株嗜线虫沙雷氏菌及其应用
CN104560815B (zh) 一种具有降解偶氮化合物活性的地衣芽孢杆菌及其应用
CN107974423B (zh) 一种土壤生物活化剂及其制备方法
CN114480165B (zh) 一种高效解钾固氮菌及其应用
CN110305819A (zh) 一株羽毛高效降解菌株及其应用
CN114874953A (zh) 一株花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1及其应用
CN110747188B (zh) 一种生产角蛋白酶的方法
CN110747128B (zh) 一株高产角蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株及其应用
CN104862255A (zh) 一种降低设施栽培条件下蔬菜硝酸盐含量的方法
CN116515795B (zh) 塔宾曲霉在制备植酸酶和/或降解植酸中的应用
CN117384799B (zh) 一株鲁戈斯芽孢杆菌A78.1、菌剂、产β-葡萄糖苷酶的方法和应用
CN108617408A (zh) 一种保水性能好的长根菇培养料及其制备方法
CN112342164B (zh) 一种Rhodoblastus sphagnicola耦合微生物菌肥及其制备和应用
CN113308381B (zh) 一种平菇菌株znk-ms-08、培养方法、平菇培养基及培养基添加剂
CN117603889B (zh) 饲用产酸性蛋白酶的枯草芽孢杆菌及其应用
CN114806956B (zh) 贝莱斯芽孢杆菌db219及其应用
CN114561319B (zh) 一种解钾菌及解钾菌肥
CN115806903B (zh) 一株白羽扇豆内生细菌crb1及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant