CN113308381B

CN113308381B - 一种平菇菌株znk-ms-08、培养方法、平菇培养基及培养基添加剂

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Publication number: CN113308381B
Application number: CN202110507356.4A
Authority: CN
Inventors: 明松; 晏礼明; 李赛飞
Original assignee: Jiangsu Zhongagronomic Food Engineering Co ltd; Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Jiangsu Zhongagronomic Food Engineering Co ltd; Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2021-05-10
Filing date: 2021-05-10
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2041-05-10
Also published as: CN113308381A

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种平菇菌株ZNK‑MS‑08、培养方法、平菇培养基及培养基添加剂。本发明提供的平菇菌株ZNK‑MS‑08保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.19375。该菌株在以添加有无机硒和高有机硒菌体蛋白多肽的培养基进行培养后，可以生产高有机硒富集平菇产品，该产品总硒含量超过200mg/kg干重，而且有机硒占总硒含量超过99％以上。

Description

一种平菇菌株ZNK-MS-08、培养方法、平菇培养基及培养基添加剂

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种平菇菌株ZNK-MS-08、培养方法、平菇培养基及培养基添加剂。

背景技术

硒是氧族元素，在人体中发挥重要作用的硒是以硒代半胱氨酸的形式出现在谷胱甘肽过氧化物酶中的，该氨基酸在人体中对应有单独的密码子，因此硒元素是人体的必需微量元素，在人体中是以还原态起到抗氧化保护作用的。由于目前最容易获得的较纯的硒原料是氧化态的亚硒酸盐，因此采用无机亚硒酸钠作为培养基添加原料生产富硒蕈菌产品有众多方案。由于亚硒酸的氧化态特性，需要通过植物，动物或微生物将其变为还原态的硒才会成为人体需要的硒。但是当硒浓度较高时，将消耗大量其它的抗氧化物质，且容易被还原成不溶解的元素硒。因为无论氧化态的亚硒酸钠和不溶的元素硒对细胞都有一定的毒性，所以生产富硒蕈菌的菌株需要有强大的抗氧化能力且能迅速还原+4价的亚硒酸盐到-2价的硒离子才能形成对高浓度的亚硒酸钠的耐受。

对于生产富硒蕈菌产品，提高还原态硒含量是至关重要的。相较于无机的亚硒酸钠，在富硒的过程中将亚硒酸钠替换成为有机硒，不仅可以降低无机硒的毒性，提高硒转化率，而且有机硒种类更为多样，有利于增加有机硒的吸收和利用。

中国专利201610999318，201510055968公开了含有富硒酵母为主要硒源的培养基。纯利用酵母硒作为单一硒源，虽然有机硒比例达到很高水平，但相比一般无机亚硒酸钠作为硒源的培养基，硒的吸收效率并不高，因此成本过于昂贵。

中国专利201811445791，201811445793，201810274966，201710051828和201511033822公开了不同的培养基栽培富硒平菇。但栽培平菇时所用的硒源均为无机亚硒酸钠，且没有明确测量有机硒的含量。中国专利201510105458公开的采用无机亚硒酸钠为唯一硒源的高浓度硒培养基，其蘑菇中总硒含量可达到300～600μg/kg，但没有说明其中的有机硒含量比例。

因此，需要提供一种新的平菇菌株、平菇培养基、培养基添加剂及培养方法来高效实现富含有机硒的菌菇的培养。

发明内容

本发明的目的是提供一种可生产高比例有机硒的平菇菌株ZNK-MS-08、平菇培养基、培养基添加剂及培养方法。

本发明提供一种平菇菌株ZNK-MS-08，该菌株于2020年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为糙皮侧耳Pleurotus ostreatus，保藏编号为CGMCC NO.19375。

CGMCC No.19375是从一株耐受高浓度亚硒酸钠培养基的平菇菌株中经过108代高亚硒酸钠培养基驯化定向诱变得到的。该菌株能够富集硒并能将无机亚硒酸钠还原成为“0”价元素硒或还原性更高的有机硒。且经培养后，可获得总硒含量高且有机硒占总硒含量高的平菇。

实际生产栽培过程中CGMCC No.19375可以将大量的无机硒还原成红色的零价元素硒和有机硒，但元素硒仍属于无机硒。零价无机元素硒由于不溶于任何分散系统，进入体内不能被人体吸收利用，故本发明进一步研究了提升该菌株CGMCC No.19375转化无机亚硒酸盐为有机硒效果的方法。最终所栽培出的富硒平菇中，总硒含量高，有机硒占总硒含量超过99％以上，大大提高了富硒平菇的品质。进而提出了平菇菌株(Pleurotus ostreatus)ZNK-MS-08在培养总硒含量高且有机硒占总硒含量高的平菇中的应用。

本发明还提供一种平菇菌株(Pleurotus ostreatus)ZNK-MS-08的培养方法，其采用平菇菌株培养基进行培养，所述平菇菌株培养基，包括亚硒酸盐和高有机硒菌体蛋白多肽(HOSP)，所述亚硒酸盐和所述高有机硒菌体蛋白多肽的质量比为1：(1000-5000)，优选为1：(3500-4000)，更优选为1∶3750。

本发明中，亚硒酸盐可为亚硒酸钠。

本发明中，所述高有机硒菌体蛋白多肽由混合酵母菌种发酵制得的菌体蛋白，经水解后制备得到，所述混合酵母菌种包括：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和产朊假丝酵母(Candida utilis)中的一种或多种。

本发明中可使用能实现菌体蛋白生产的任何菌株的酿酒酵母(S.cerevisiae)、马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)和产朊假丝酵母(C.utilis)(各酵母菌种为国家允许的可用于食品或饲料添加剂的微生物菌种)中的一种或多种。首先混合酵母菌种发酵将高价态亚硒酸盐还原成含有机硒的菌体蛋白，该菌体蛋白再经过水解成为多肽后灭菌，即得到HOSP(蛋白多肽)。

本发明中，所述混合酵母菌种发酵时的培养基中包含浓度为0.5～50mg/L的亚硒酸盐，优选为5mg/L，有利于充分利用原料中的硒元素。

本发明中，所述水解采用酸解法或酶法进行，所述酶法中采用由杆菌发酵产生的碱性蛋白酶。

本发明中，所述杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

优选地，采用天然地衣芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌发酵产生的碱性蛋白酶进行水解。该三种种属的芽孢杆菌均是国家肥料目录中允许使用的微生物品种。

本发明发现，当仅采用无机硒作为培养基硒源时，平菇对于有机硒占总硒的含量不够理想，但当配合加入经灭菌的高有机硒菌体蛋白多肽(HOSP)后，则提升了平菇有机硒占比。

本发明在研究时还发现，当采用富硒酵母作为有机硒源时，有超过30％的酵母硒残留于培养基中不能被利用，硒的吸收率不理想。而经过本发明选用的芽孢杆菌将酵母蛋白经过水解处理后，则酵母有机硒转化率提高，剩余酵母硒明显减少。

本发明中，所述培养基按重量份包括：玉米芯60～90份、大麦麸皮2～12份、玉米胚芽粉2～8份、碳酸钙1～3份、亚硒酸盐0.001～0.01份、甜菜碱2～8份，高有机硒菌体蛋白多肽5～15份。

采用本发明的培养基配方，可利于平菇生长并使得平菇富硒综合效果更佳。

优选，按重量份包括：玉米芯60～65份、大麦麸皮10～12份、玉米胚芽粉3～4份、碳酸钙1～1.5份、亚硒酸盐0.003～0.005份、甜菜碱7～8份，高有机硒菌体蛋白多肽12～15份；

更优选，按重量份包括：玉米芯60份、大麦麸皮12份、玉米胚芽粉3.7份、碳酸钙1份、亚硒酸盐0.004份、甜菜碱8份，高有机硒菌体蛋白多肽15份。

本发明还提供一种平菇菌株培养基，其如上所述。

本发明另提供一种平菇菌株培养基添加剂，其包括高有机硒菌体蛋白多肽，所述高有机硒菌体蛋白多肽如上所述。

本发明的有益效果在于：

本发明公开了一株高效生物转化无机亚硒酸盐(亚硒酸钠)为有机硒的平菇菌株CGMCC No.19375。其耐受高浓度亚硒酸盐，在富硒过程中将无机硒转化成有机硒的能力强，可以降低无机硒的毒性，提高硒转化率，而且有机硒种类更为多样，有利于增加有机硒的吸收和利用。

该菌株通过正常的活化，制种后，接入到本发明的平菇菌株培养基中(其含有本发明的高有机硒菌体蛋白多肽)极大程度上增加了平菇CGMCC No.19375子实体终产品中硒的总量和有机硒含量，最终有机硒含量占总硒含量的99％以上，可用以生产高有机硒含量的平菇子实体，大大提高了富硒平菇的品质。且方法简单、有机硒转化率高，成本低廉。

本发明的平菇菌株培养基、培养基添加剂还可用于其他平菇的培养，也可一定程度上增加总硒和有机硒含量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例提供了一种平菇菌株CGMCC No.19375富集高比例有机硒的培养方法。

该菌株是一株耐高浓度无机亚硒酸钠的菌株。

具体包括以下步骤：

配置专用的酵母基础培养基如下：每升培养基加入KH₂PO₄ 16g,酵母浸粉(安琪FH802)4g，玉米浆干粉16g，蔗糖20g，硫酸铵14g。培养基灭菌后接种3％酿酒酵母、3％马克斯克鲁维酵母和4％产朊假丝酵母种子(各种子母液OD值为6～8)30℃进行混合发酵20小时后添加相当于终浓度5mg/L的亚硒酸钠，以每升培养液50ml/Hr的速度补60％葡萄糖，用氨水控pH到5.5～6.0，直到OD达到600以上，发酵结束；发酵结束后加入1g/L的枯草芽孢杆菌(山东蔚蓝绿源生物科技有限公司)，于37℃缓慢搅拌48小时，之后收集沉淀，121℃20分钟灭菌后，即得到HOSP蛋白多肽；HOSP中硒含量为97mg/kg干重。

准备平菇栽培培养基共3kg，其中含864g玉米芯，60g大麦麸皮，60g玉米胚芽粉，12g碳酸钙，8.4g浓度为10g/L的亚硒酸钠稀释剂(即，约84mg亚硒酸钠)，24g甜菜碱，180g上述HOSP蛋白多肽，余量为水。大约1.20公斤左右为干料，1.80公斤左右为水分，无机硒添加量相当于70mg/Kg干料。高温高压灭菌冷却后，接种100ml以10g/L土豆汁培养基发酵制备48h的平菇液体菌种，按照食用菌常规方法进行培养和出菇。成熟后采收子实体1.26kg，烘干后为105克，利用GB5009.93-2017(第一法)检测子实体中总硒的含量为250mg/kg干重，总硒利用率为25.9％。按照GB1903.22-2016检测子实体中有机硒占总硒含量为99.5％。

实施例2

具体包括以下步骤：配置专用的酵母基础培养基如下：每升培养基加入KH₂PO₄16g,酵母浸粉(安琪FH802)4g，玉米浆干粉16g，蔗糖20g，硫酸铵14g。培养基灭菌后接种10％酿酒酵母种子(OD值6～8)30℃进行混合发酵20小时后添加相当于终浓度5mg/L的亚硒酸钠，以每升培养液50ml/Hr的速度补60％葡萄糖，用氨水控pH到5.5～6.0，直到OD达到600以上，发酵结束；发酵结束后加入1g/L的地衣芽孢杆菌菌粉(山东蔚蓝绿源生物科技有限公司)，于37℃缓慢搅拌48小时，之后收集沉淀，121℃20分钟灭菌后，即得到HOSP蛋白多肽；HOSP中硒含量为108mg/kg干重。

准备平菇栽培培养基共3kg，其中含937.5g玉米芯，25g大麦麸皮，25g玉米胚芽粉，12.5g碳酸钙，12.5g浓度为10g/L的亚硒酸钠稀释剂(即，约125mg亚硒酸钠)，50g甜菜碱，187.5g上述HOSP蛋白多肽，余量为水。大约1.25公斤左右为干料，1.75公斤左右为水分，无机硒添加量相当于100mg/Kg干料。高温高压灭菌冷却后，接种100ml以10g/L土豆汁培养基发酵制备48h的平菇液体菌种，按照食用菌常规方法进行培养和出菇。成熟后采收子实体1.08kg，烘干后得98g干重，利用GB5009.93-2017(第一法)检测子实体中总硒的含量达220mg/kg干重，总硒利用率为14.8％。按照GB1903.22-2016检测子实体中有机硒占总硒含量为99.5％。

实施例3

本实施例提供了一种平菇菌株CGMCC No.19375的培养方法。

具体包括以下步骤：配置专用的酵母基础培养基如下：每升培养基加入KH₂PO₄16g,酵母浸粉(安琪FH802)4g，玉米浆干粉16g，蔗糖20g，硫酸铵14g。培养基灭菌后接种10％产朊酵母种子(OD值6～8)30℃进行混合发酵20小时后添加相当于终浓度5mg/L的亚硒酸钠，以每升培养液50ml/Hr的速度补60％葡萄糖，用氨水控pH到5.5～6.0，直到OD达到600以上，发酵结束；发酵结束后加入1g/L的解淀粉芽孢杆菌(山东蔚蓝绿源生物科技有限公司)，于37℃缓慢搅拌48小时，之后收集沉淀，121℃20分钟灭菌后，即得到HOSP蛋白多肽；HOSP中硒含量为106mg/kg干重。

准备平菇栽培培养基共3kg，其中含768g玉米芯，153.6g大麦麸皮，47.4g玉米胚芽粉，12.8g碳酸钙，5.12g浓度为10g/L的亚硒酸钠稀释剂(即，约51.2mg亚硒酸钠)，102.4g甜菜碱，192g上述HOSP蛋白多肽，余量为水。大约1.28公斤左右为干料，1.72公斤左右为水分，无机硒添加量相当于40mg/Kg干料。高温高压灭菌冷却后，接种100ml以10g/L土豆汁培养基发酵制备48h的平菇液体菌种，按照食用菌常规方法进行培养和出菇。成熟后采收子实体1.38kg，烘干后132g干重，利用GB5009.93-2017(第一法)检测子实体中总硒的含量达225mg/kg干重，总硒利用率为41.5％。按照GB1903.22-2016检测子实体中有机硒占总硒含量为99.6％。

进一步统计总结上述3个实施例的菌株培养结果见表1。

表1施用不同浓度无机亚硒酸钠和HOSP后的菇硒含量和硒转化率

表1中，无机硒转化量由如下表2中相应无机硒添加浓度下的总硒(无机硒)转化率计算而来。

实施例对比后，可以看出HOSP作为有机硒来源吸收率很高，可以将菇有机硒含量提高到99％以上。

对比例1

本对比例对菌株CGMCC No 5.721(标准菌株)和本发明的平菇菌株ZNK-MS-08(CGMCC No.19375)进行平行培养实验，以比较两者对亚硒酸钠的耐受。具体培养方法与实施例3相同，区别仅在于，在培养基中，不添加HOSP蛋白多肽，而仅以浓度为10g/L的亚硒酸钠稀释剂作为硒源，设5组实验组。每组培养基中硒的终浓度分别为40、50、60、70、100mg/Kg干料。统计6次平行培养结果数据，如下表2(检测方法同实施例3)。

表2标准菌株CGMCC No 5.721和ZNK-MS-08(CGMCC No.19375)的生物量，富硒总量和总硒转化率结果

从表2中可知，本发明的菌株ZNK-MS-08对于无机硒的耐受性更好。

相比于实施例3中以复合形式添加硒(总硒浓度约为55.9mg/Kg干料)，仅以无机硒添加相近浓度时，总硒转化率将降低。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.平菇(Pleurotus ostreatus)ZNK-MS-08，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.19375。

2.权利要求1所述的平菇(Pleurotus ostreatus)ZNK-MS-08在培养总硒含量高且有机硒占总硒含量高的平菇中的应用。

3.一种权利要求1所述的平菇(Pleurotus ostreatus)ZNK-MS-08的培养方法，其特征在于，采用平菇菌株培养基进行培养，所述平菇菌株培养基包括：亚硒酸盐和高有机硒菌体蛋白多肽，所述亚硒酸盐和所述高有机硒菌体蛋白多肽的质量比为1：(1000-5000)；

所述高有机硒菌体蛋白多肽由混合酵母菌种发酵制得的菌体蛋白经水解后制备得到，所述混合酵母菌种包括：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和产朊假丝酵母(Candida utilis)中的一种或多种；

所述混合酵母菌种发酵时的培养基中包含浓度为0.5～50mg/L的亚硒酸盐。

4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述水解采用酸解法或酶法进行，所述酶法中采用由杆菌发酵产生的碱性蛋白酶。

5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述杆菌为地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。

6.根据权利要求3-5任一项所述的培养方法，其特征在于，所述平菇菌株培养基按重量份包括：玉米芯60～90份、大麦麸皮2～12份、玉米胚芽粉2～8份、碳酸钙1～3份、亚硒酸盐0.001～0.01份、甜菜碱2～8份，高有机硒菌体蛋白多肽5～15份。

7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述平菇菌株培养基按重量份包括：玉米芯60～65份、大麦麸皮10～12份、玉米胚芽粉3～4份、碳酸钙1～1.5份、亚硒酸盐0.003～0.005份、甜菜碱7～8份，高有机硒菌体蛋白多肽12～15份。

8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述平菇菌株培养基按重量份包括：玉米芯60份、大麦麸皮12份、玉米胚芽粉3.7份、碳酸钙1份、亚硒酸盐0.004份、甜菜碱8份，高有机硒菌体蛋白多肽15份。