CN114231458A - 一种提高瓜果类糖酸比的复合微生物菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种提高瓜果类糖酸比的复合微生物菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种提高瓜果类糖酸比的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。所述复合微生物菌剂是由植物内芽孢杆菌发酵液、红法夫酵母发酵液、植物乳杆菌发酵液和悬浮载剂X以5~6:66~67:18~19:908~911的体积比混合而成的。所述复合微生物菌剂将三种活性菌综合作用，促进了土壤溶解性有机碳含量增加、pH改变，进而改善了果实的水溶性糖含量、有机酸含量，调控了果实糖酸比与果实风味口感，也在一定程度上提高了产量。所述复合微生物菌剂与有机底肥共用，可发挥微生物活化土壤的效果的同时，发挥细菌与真菌类胞外多糖、多种发酵有机酸的效应，改善土壤C代谢，最终实现提高果实糖酸比，改善口感的目的。

Description

一种提高瓜果类糖酸比的复合微生物菌剂及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于植物种植领域，具体涉及一种提高瓜果类糖酸比的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
果实的风味取决于果实固形物含量和果实糖酸比，固形物越大，糖酸比越高，果实品质越高。糖酸比是果实水溶性糖和有机酸指标的比值，主要与果实的口感有关。一般而言，糖酸比值较高则果实味道较甜，糖酸比值较低则果实较酸。较甜的瓜果一直深受老百姓的青睐，因此提高瓜果类果实糖酸比，是一直以来比较重要的研究课题。
温度、光照、水分含量、栽培管理、营养调控与代谢调控等均可调节瓜果类果实是糖酸比。在确定的种植对象和种植条件下，营养调控已经成为重要的果实糖酸比调控手段。但目前多采用生物有机肥、或者常规的枯草芽孢杆菌等菌剂制备的微生物肥料来进行营养调控，但在加工过程中，会损失大量多糖类、有机酸类代谢物，最终影响了果实糖酸比的有效调控效果，使得瓜果在甜度提高上不显著，且化肥的使用会造成土地的损伤。
发明内容
为了克服现有技术中存在的问题，本发明提供了一种提高瓜果类糖酸比的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。所述复合微生物菌剂可通过系统的活性反应与代谢物累积效应，改善土壤理化形状，并促进瓜果类果实中糖与酸的累积，从而改善其糖酸比、果实口感等。
为了实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：
本发明提供了一种提高瓜果类糖酸比的复合微生物菌剂，所述复合微生物菌剂中包括植物内芽孢杆菌发酵液、红法夫酵母发酵液、植物乳杆菌发酵液和悬浮载剂X。
进一步的，所述植物内芽孢杆菌种子液、红法夫酵母种子液、植物乳杆菌种子液和悬浮载剂X的体积比为5～6:66～67:18～19:908～911。
进一步的，所述复合微生物菌剂中植物内芽孢杆菌发酵液的菌量为2～2.5×108CFU/ml；红法夫酵母发酵液的菌量为6～7×108CFU/ml；植物乳杆菌发酵液的菌量为2～3×108CFU/ml。
进一步的，所述植物内芽孢杆菌发酵液采用保藏编号为CGMCC No.20919的植物内芽孢杆菌GBW-F008经培养扩培得到；所述红法夫酵母发酵液采用保藏编号为CGMCCNo.22504的红法夫酵母GOY1经培养扩培得到；所述植物乳杆菌发酵液采用保藏编号为CGMCC No.22078的植物乳杆菌GBW-LP001经培养扩培得到。
进一步的，所述悬浮载剂X中海藻多糖浓度为15％，其中含有眉藻提取物、丝藻提取物、小颤藻提取物、四尾珊藻提取物和小球藻提取物中的至少3种。
本发明还提供了所述的复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)植物内芽孢杆菌进行发酵扩培，当胞外多糖含量不再增加时，停止发酵，得到植物内芽孢杆菌发酵液；
(2)红法夫酵母进行发酵扩培，当酵母多糖含量不再增加，停止发酵，得到红法夫酵母发酵液；
(3)植物乳杆菌进行发酵扩培，当乳酸菌菌量不再增加，停止发酵，得到植物乳杆菌发酵液；
(4)将所述植物内芽孢杆菌发酵液、所述红法夫酵母发酵液、所述植物乳杆菌发酵液和悬浮载剂X混合均匀，得到所述复合微生物菌剂。
进一步的，所述步骤(1)得到的植物内芽孢杆菌发酵液的菌量为360×108CFU/ml～450×108CFU/ml，其中细菌性胞外多糖的含量为56.8g/L～57.3g/L；所述步骤(2)得到的红法夫酵母发酵液的菌量为90×108CFU/ml～105×108CFU/ml，其中酵母多糖的含量为378g/L～385g/L；所述步骤(3)中得到的植物乳杆菌发酵液的菌量为110×108CFU/ml～165×108CFU/ml，其中粘液多糖的含量为29.3g/L～29.5g/L，有机酸的含量为2.8g/L～3.34g/L。
本发明还提供了所述的复合微生物菌剂在用于提高瓜果类糖酸比或改善瓜果类口感中的应用。
进一步的，将所述复合微生物菌剂用水稀释200～250倍后，以0.3～0.4kg/株植株的用量，对瓜果类植株进行灌根处理，直至瓜果类成熟为止。
进一步的，所述瓜果类包括苹果、荔枝、甜橘柚。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：
1、本发明所述的提高瓜果类糖酸比的复合微生物菌剂是由植物内芽孢杆菌GBW-F008、红法夫酵母GOY1和植物乳杆菌GBW-LP001经复配而成，具有三合效大于单菌的复合功效。植物内芽孢杆菌GBW-F008具有较强的产酶、抑菌、解磷钾等功能，其发酵液中富含细菌性胞外多糖；红法夫酵母GOY1的发酵液，经特色诱导优化工艺发酵而成，发酵液中富含酵母多糖和活性酵母菌，可提高种子基地土壤溶剂性有机碳的含量，进而促进植物的碳素循环和可溶性糖的累积；植物乳杆菌GBW-LP001同时具有细菌性粘液多糖和发酵有机酸，包括柠檬酸、苹果酸、草酸、乳酸、酒石酸、富马酸等。三菌合用，互为补充，兼具活性细菌、功能真菌、有效代谢物等多重作用，多方面、全方位改善土壤理化形状，提升果实水溶性糖与有机酸含量，最终实现糖酸比的合理调控、果实口感的改善、产量提升与经济效益提高，具有较大的应用价值。
2、本发明中的复合微生物菌剂均由三种菌的原始发酵液与悬浮载体复配而成；悬浮载剂X的海藻多糖浓度为15％，含有眉藻、丝藻、小颤藻、四尾珊藻、小球藻提取物中的3-4种，其具有海藻活性营养存在，可促进植物生长和免疫能力提升。
3、本发明所述复合微生物菌剂，兼具抑菌产酶型植物芽孢杆菌、产较多酵母多糖的红发夫酵母菌、产细菌粘液多糖与大量发酵有机酸的植物乳杆菌，这些活性菌综合作用，促进了土壤溶解性有机碳含量增加、pH改变，进而改善了果实的水溶性糖含量、有机酸含量，调控了果实糖酸比与果实风味口感，也在一定程度上提高了产量。本发明所述复合微生物菌剂与有机底肥共用，可发挥微生物活化土壤的效果的同时，发挥细菌与真菌类胞外多糖、多种发酵有机酸的效应，改善土壤C代谢，最终实现提高果实糖酸比，改善口感的目的。
4、本发明所述的复合微生物菌剂制备方法简单、合理，使用方便，其使用效果优异，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是植物内芽孢杆菌GBW-F008在NA培养基上菌落、镜检菌体芽孢图。
图2是红法夫酵母GOY1在YPD培养基上的菌落、镜检菌体图。
图3是植物乳杆菌GBW-LP001在MRS培养基上的菌落、镜检菌体图。
具体实施方式
结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
实施例1
一、植物内芽孢杆菌GBW-F008的分离筛选与鉴定
1、植物内芽孢杆菌GBW-F008的分离与筛选
从河北廊坊、山东济南、泰安、莱阳、淄博、聊城、寿光的多地多年生蔬菜大棚内取作物根部土壤，筛选了72株芽孢菌，产IAA能力定性比较后显示菌株GBW-F008产IAA能力在72株菌中最强，该菌株来源于泰安市高新区房村镇朱家庄村11年番茄棚，分离自番茄根部。
所述菌株GBW-F008在NA培养基上的菌落、镜检菌体与芽孢如图1所示，GBW-F008在NA培养基上的菌落如图1a，为白色，不透明，圆形，边缘整齐，表面湿润光泽，直径1-5mm；GBW-F008在24h的10×100倍油镜镜检结果如图1b，镜检菌体呈G+，菌体为圆柱状，直径2-3μm，芽孢近端生呈长椭圆形，周生鞭毛。
2、植物内芽孢杆菌GBW-F008的分子鉴定
以所述菌株GBW-F008的DNA为模板，使用16S rDNA通用引物进行扩增后并测定其序列，将得到的菌株GBW-F008的16S rDNA测序结果与GenBank中的序列进行Blast比对分析，结果显示菌株GBW-F008与Bacillus endophyticus的同源性最高，因此确定菌株GBW-F008为植物内芽孢杆菌。
3、植物内芽孢杆菌GBW-F008的菌种保藏
将筛选到的菌株GBW-F008进行菌种保藏，所述植物内芽孢杆菌GBW-F008的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年10月20日；植物内芽孢杆菌Bacillus endophyticus的保藏编号为：CGMCC No.20919。
4、植物内芽孢杆菌GBW-F008的菌株特性
植物内芽孢杆菌GBW-F008在20℃～42℃温度范围内能够生长繁殖，但其最适合生长温度在37℃，在pH 4.5～9.6的改良NB培养基内均能正常生长，最适生长pH范围为6.5～7.5，该菌最高可耐受10％NaCl，可产生脲酶，接触酶与氧化酶反应均为阳性，可利用柠檬酸盐；GBW-F008还可利用木糖、菊粉、葡萄糖、D-核糖、环糊精、古老糖、D-海藻糖等多种碳水化合物产酸，还可产α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、亮氨酸芳胺酶等。所述植物内芽孢杆菌GBW-F008可产淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、脂肪酶和蛋白酶等多种酶类，木聚糖酶水解比值达3.97，且具有良好的解磷解钾等能力，解有机磷比值高达2.31；该菌可发酵多种碳水化合物底物产生较多胞外多糖，最高产量可达126.8g/L。
二、红法夫酵母GOY1的分离筛选与鉴定
1、红法夫酵母GOY1的分离筛选与纯化
取青岛胶州海参养殖水，梯度稀释后涂布于YPD培养基上，多次分离纯化后得到单菌落，命名为GOY1，保存。
菌株GOY1的菌落形态如图2a所示，菌落大而湿润，隆起，橙色至红色，表面光滑无褶皱；其菌体如图2b均为不规则椭圆形，互相独立分散。
2、红法夫酵母GOY1的分子鉴定
提取菌株GOY1的DNA作为模板，使用18S rRNA通用引物进行扩增，扩增片段进行序列测定，将得到的菌株GOY1的18S rDNA测序结果与GenBank中的序列进行比对分析，结果显示菌株GOY1与Phaffia rhodozyma同源性最高，因此确定该菌株GOY1为红法夫酵母。
3、红法夫酵母GOY1的菌种保藏
将筛选到的菌株GOY1进行菌种保藏，所述红法夫酵母GOY1的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2021年05月11日；红法夫酵母Phaffia rhodozyma的保藏编号为CGMCC No.22504。
4、红法夫酵母GOY1的菌株特性
红法夫酵母GOY1在25℃～35℃温度范围内能够生长繁殖，但其最适合生长温度在30℃，在pH 5～9的改良YPD培养基内均能正常生长，最适生长pH范围为6.5～8，该菌最高可耐受5％NaCl。该菌可利用葡萄糖、麦芽糊精、木糖、海藻糖、七叶苷等多种碳水化合物产酸，还可经过发酵分泌较多的酵母胞外多糖或产生丰富的色素类代谢物，如虾青素、番茄红素等。
三、植物乳杆菌GBW-LP001的分离筛选与鉴定
1、植物乳杆菌GBW-LP001的筛选与纯化
健康白羽肉鸡不同肠段取样，样品于MRS液体培养基和MRS固体培养基上经多次分离纯化得到一株产酸性好的乳酸杆菌，将该单菌落命名为GBW-LP001。
如图3a所示，菌株GBW-LP001在MRS平板上的菌落为非常规则的圆形，乳白色，直径2-3mm，表面光滑，边缘整齐，中间凸起，不透明；图3b显示，该菌菌体显微镜下呈短杆状，两头钝圆，单个、成对或链状，无鞭毛，无芽孢。
2、植物乳杆菌GBW-LP001的鉴定
以所述的菌株GBW-LP001的DNA为模板，使用16S rRNA通用引物27F和1492R进行扩增，扩增片段送往上海生工进行序列测定，所得核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，将得到序列经BLAST比对，结果发现，GBW-LP001与GenBank中的Lactobacillus palntarum序列的同源性为99.93％，因此初步确定该菌株为植物乳杆菌。
3、植物乳杆菌GBW-LP001的菌种保藏
将筛选到的菌株GBW-LP001进行菌种保藏，所述植物乳杆菌GBW-LP001的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2021年03月26日；植物乳杆菌Lactobacillus palntarum的保藏编号为CGMCC No.22078。
4、植物乳杆菌GBW-LP001的菌种特性
该菌为革兰氏阳性菌，菌体呈乳白色，与碳酸钙形成的透明圈约7-9mm，有较强的产酸能力和耐酸能力。该菌兼性厌氧，主要发酵单糖与双糖，葡萄糖产酸不产气，主要产物是乳酸盐；接触酶阴性，氧化酶阴性；不还原硝酸盐，主要生长温度范围为35℃-40℃，但50℃也能生长，在1％-5％NaCl、pH 4.5-8.5也能生长。
实施例2
一种提高瓜果类糖酸比的复合微生物菌剂由三种益生菌与悬浮载剂X复配而成。其中，三种益生菌为植物内芽孢杆菌GBW-F008、红法夫酵母GOY1和植物乳杆菌GBW-LP001的活性菌体孢子，三者的菌量分别为2～2.5×108CFU/ml、6～7×108CFU/ml和2～3×108CFU/ml；悬浮载剂X的海藻多糖浓度为15％，含有眉藻、丝藻、小颤藻、四尾珊藻、小球藻中的3种或4种的提取物。
所述复合微生物菌剂的制备方法如下：
(1)植物内芽孢杆菌GBW-F008菌液的制备：植物内芽孢杆菌GBW-F008的活化菌株接种至一级种子罐中，保持罐内温度维持在36℃～38℃，罐内通气量1.8～2.0vvm，罐内转速175～180rpm/min，培养14h～18h至对数生长期后，按6％～8％接种比例，转接二级发酵罐。二级发酵罐内维持发酵温度介于35℃～37℃，罐内通气量1.9～2.1vvm，罐内转速205～210rpm/min，培养47h～49h，当胞外多糖含量不再增加，且镜检确定芽孢率>98％且孢子成熟度达95％以上，即可停罐。在此条件下发酵菌量为360×108CFU/ml～450×108CFU/ml，细菌性胞外多糖的产量可高达56.8g/L～57.3g/L。
一级种子罐配方为：黄豆粉5～6g/L，玉米淀粉1～1.2g/L，K2HPO4 1～1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5～0.8g/L，糖蜜0.5～0.6g/L，初始pH 7.4-7.6。二级发酵罐培养液配方为：麦芽糖浓度420～450g/L、红糖65～70g/L、酵母浸膏2.5～3g/L、酸水解酪蛋白2～2.5g/L、甘露醇1.5～2g/L、尿素1～1.5g/L、NaCl 1～1.5g/L、氯化钙0.5～1g/L、硫酸亚铁0.2～0.3g/L，初始pH 7.5～7.6。
(2)红法夫酵母GOY1菌液的制备：红法夫酵母GOY1的活化菌株接种至一级种子罐中，保持罐内温度维持在28℃～30℃，罐内通气量1.7～1.8vvm，罐内转速165～175rpm/min，培养16h～18h至对数生长期后，按8％～10％接种比例，转接二级发酵罐。二级发酵罐内维持发酵温度介于29℃～31℃，罐内通气量1.9～2.1vvm，罐内转速220～260rpm/min，培养55h～58h，当酵母多糖含量不再增加，即可停罐。在此条件下发酵菌量为90×108CFU/ml～105×108CFU/ml、酵母多糖的产量可达378g/L～385g/L。
一级种子罐配方为：蔗糖23～25g/L、棉粕粉10～12g/L，酵母粉5～6g/L，氯化钠5～6g/L，NH4Cl 2.5～3.5g/L，MnSO4·H2O 0.03～0.05g/L，初始pH 7.4～7.6。二级发酵罐培养液配方为：麦芽糊精340～350g/L、马铃薯汁液215～220g/L、破壁蜂花粉2.5～3g/L、NaCl2.5～3g/L、醋酸铵2.5～3g/L、甘氨酸0.8～1g/L、天门冬酰胺0.5～0.6g/L、维生素B1 0.2～0.3g/L，初始pH 8.1～8.2。
(3)植物乳杆菌GBW-LP001菌液的制备：植物乳杆菌GBW-LP001的活化菌株接种至一级种子罐中，保持罐内温度维持在38℃～39℃，罐内通气量1.2～1.3vvm，罐内转速95～105rpm/min，培养5h～6h至对数生长期后，按9％-10％接种比例，转接二级发酵罐。二级发酵罐内维持发酵温度介于37℃～38℃，罐内通气量1.4～1.5vvm，罐内转速110～115rpm/min，培养16h～18h，当乳酸菌菌量不再增加，即可停罐。在此条件下发酵植物乳杆菌菌量达110×108CFU/ml～165×108CFU/ml，粘液多糖产量可高达29.3g/L～29.5g/L，有机酸含量可高达2.8～3.34g/L，有机酸中包含柠檬酸2.0～2.2g/L、苹果酸0.4～0.5g/L、草酸0.2～0.3g/L、乳酸0.1～0.2g/L、酒石酸0.06～0.08g/L、富马酸0.04～0.06g/L。
一级种子罐配方为：葡萄糖25～30g/L、甘露醇10～12g/L，酵母浸膏5～6g/L，氯化钠5～6g/L、磷酸二氢钾2.5～3.5g/L、MnSO4·H2O 0.03～0.05g/L，初始pH 7.4～7.6。二级发酵罐培养液配方为：乳糖150～155g/L、果寡糖60～70g/L、NaCl 6～7g/L、蜂蜜4～5g/L、黄豆粉3～4g/L、脱脂乳2.5～3g/L、盐酸硫胺素1.5～2g/L、吐温2～2.5g/L、聚氧丙烯甘油0.3～0.5ml/L，初始pH 7.5～7.6。
菌量测定参照：GB 20287-2006农用微生物菌剂与NYT 2321-2013微生物肥料产品检验规程进行；番茄红素指标测定，参照NY/T 1651-2008蔬菜及制品中番茄红素的测定高效液相色谱法测定；酵母多糖参考NY/T 1676-2008食用菌中粗多糖含量的测定与DB15/T2033-2020乳酸菌胞外多糖的分离纯化与鉴定技术规程；有机酸遵循国标GB 5009.157-2016食品安全国家标准食品有机酸的测定中的方法、采用HPLC法测定。
(4)将上述的植物内芽孢杆菌GBW-F008发酵液：红法夫酵母GOY1发酵液：植物乳杆菌GBW-LP001发酵液：悬浮载剂X按照5～6:66～67:18～19:908～911的体积比混合，得到复合微生物菌剂。
实施例3
试验于2019年7月-12月，在衢州常山雨兰县某甜橘柚生产基地进行。
将供试甜橘柚均分为4组，每组的复合微生物菌剂类别与菌量不同，具体分组见表1，保持总菌量为10×108CFU/ml。按照试验分组，四个组的复合微生物菌剂均加水稀释200倍后，以0.3kg/株的应用剂量，灌根，每组50棵植株。
表1：复合微生物菌剂的不同配比方案
Figure BDA0003431067770000081
试验为期5个月，重点考察复合微生物菌剂总菌量一致、但益生菌组成与菌量不同时，对土壤特性、甜橘柚糖酸比品质、果色口感等指标的影响。分别采集土壤样品，测定土壤溶解性有机碳含量和土壤pH。土壤溶解性有机碳含量测定方法：才有总有机碳分析仪，分别测定性总碳含量和溶解性无机碳含量，二者之差即为溶解性有机碳含量。土壤pH测定：pH：取10g土壤样品，加50ml蒸馏水，混合后静置15min，用PHS-3C型pH计测定。分别采摘成熟期甜橘柚果实，每组取25个重复样品测定，按照NY T 1536-2007微生物肥料田间试验技术规程及肥效评价指南，分别测定甜橘柚糖酸比品质、口感等指标，具体包括：水溶性糖、有机酸、糖酸比等。水溶性糖测定方法：新鲜的甜橘柚去皮榨汁，10000r/min离心15min，取上清液1mL，加入4mL 1.5％的草酸溶液，经0.22μm水系滤膜过滤后，采用便携式折光糖度计测定。有机酸遵循国标GB 5009.157-2016食品安全国家标准-食品有机酸的测定中的方法、采用HPLC法测定。水溶性糖和有机酸的比例，即为糖酸比。果实口感分甜、酸甜、酸甜适度、甜酸和酸5种，采用口尝鉴评，固定5人组成风味鉴评专家组进行测定。数据结果经EXCEL处理后，用SPSS 17.0进行差异性分析。
表2：不同配比方案下甜橘柚产地土壤特性与果实品质口感等指标对比
Figure BDA0003431067770000091
表2的结果显示，甜橘柚果实品质与口感结果与土壤特性指标有一定的相关性，整体而言，甜橘柚水溶性糖含量与土壤溶解性有机碳含量呈正相关，甜橘柚有机酸含量与土壤pH指标呈负相关。在本实验中，甜橘柚品质、口感与土壤特性指标均与不同复合微生物菌剂的菌株类别与菌量有关。D组具有较高的水溶性糖含量和较高有机酸含量，最终表现为糖酸比较高，果实口感较甜，而土壤pH指标居中，土壤溶解性有机碳含量较高，与其他组达显著差异(P<0.05)。由此初步判断，较高的红法夫酵母GOY1菌量使得菌剂中具有较高的酵母多糖含量，从而有利于土壤溶解性有机碳含量的增加，而植物乳杆菌GBW-LP001因其有机酸含量较高，会影响土壤pH进而影响果实有机酸含量，对甜橘柚的果实糖酸比反而起到负向作用。因此，选择D组配方作为提高瓜果类糖酸比的复合微生物菌剂的菌类别剂量合适配方方案。
实施例4
试验于2020年8月-12月，在衢州常山雨兰县某甜橘柚生产基地进行。
将供试甜橘柚均分为6组，每组复合微生物菌剂的用量不同，逐渐增加，具体分组见表3。按照设计，不同用量的复合微生物菌剂均加水200倍稀释后，每株以试验组梯度应用剂量，灌根，每组50棵植株。
试验为期4个月，重点考察复合微生物菌剂不同用量下，对土壤特性、甜橘柚糖酸比品质、产量等指标的影响。分别采集土壤样品，测定土壤特性，包括土壤溶解性有机碳含量、土壤pH。土壤溶解性有机碳含量测定方法：才有总有机碳分析仪，分别测定性总碳含量和溶解性无机碳含量，二者之差即为溶解性有机碳含量。土壤pH测定：pH：取10g土壤样品，加50ml蒸馏水，混合后静置15min，用PHS-3C型pH计测定。分别采摘成熟期甜橘柚果实，每组取30个重复样品测定，按照NY T 1536-2007微生物肥料田间试验技术规程及肥效评价指南，测定不同时期甜橘柚糖酸比、产量等。水溶性糖测定方法：新鲜的甜橘柚去皮榨汁，10000r/min离心15min，取上清液1mL，加入4mL 1.5％的草酸溶液，经0.22μm水系滤膜过滤后，采用便携式折光糖度计测定。有机酸遵循国标GB 5009.157-2016食品安全国家标准食品有机酸的测定中的方法、采用HPLC法测定。水溶性糖和有机酸的比例，即为糖酸比，分别测定膨大期与成熟期的糖酸比，看其动态变化。分别测定不同用量下甜橘柚的产量，折合为亩产表示。数据结果经EXCEL处理后，用SPSS 17.0进行差异性分析。
表3：不同应用剂量下甜橘柚产地土壤特性与果实品质、产品等指标对比
Figure BDA0003431067770000101
表3结果显示，甜橘柚果实品质、产量、土壤特性等指标与本发明的复合微生物菌剂的用量有一定的关系，在0.1-0.3kg/株用量时，随着用量的增加，土壤溶解性有机碳含量、土壤pH、膨大期与成熟期糖酸比、果实亩产等指标均逐渐增加，且个指标间变化达显著差异(P<0.05)。但从0.3-0.5kg/株用量梯度之间，各指标变化幅度较小，组间无显著差异(P>0.05)，因从选择0.3-0.4kg/株的用量作为本发明复合微生物菌剂的合适用量，在此用量下，可促进土壤溶剂型有机碳含量增加，改善土壤pH，显著提高糖酸比与果实亩产，尤其是0.3kg/株应用条件下，具有较高的应用性价比。
实施例5
试验于2020年4月-7月，在烟台莱州某烟富1号种植基地进行。
本实施例中复合微生物菌剂中包含菌量为2×108CFU/ml的植物内芽孢杆菌种子液、6×108CFU/ml的红法夫酵母GOY1种子液和2×108CFU/ml的植物乳杆菌GBW-LP001种子液以及悬浮载剂X，悬浮载剂X的海藻多糖浓度为15％，且含有眉藻、丝藻、小颤藻的提取物。
复合微生物菌剂加水200倍稀释后，以0.3kg/株的应用剂量，对苹果植株灌根，作为试验组。对照组仅用水罐根，不加本发明所述复合菌剂。每组50棵苹果植株重复。
按照设计，试验为期4个月，重点是复合微生物菌剂对苹果的水溶性糖、有机酸、糖酸比、亩产量等指标的影响。分别采摘成熟期果实，每组取30个重复样品测定，按照NY T1536-2007微生物肥料田间试验技术规程及肥效评价指南，测定水溶性糖、有机酸、糖酸比、亩产量等指标。水溶性糖测定方法：新鲜的甜橘柚去皮榨汁，10000r/min离心15min，取上清液1mL，加入4mL 1.5％的草酸溶液，经0.22μm水系滤膜过滤后，采用HPLC法测定，苹果主要测定果糖、蔗糖、葡萄糖含量。有机酸遵循国标GB 5009.157-2016食品安全国家标准-食品有机酸的测定中的方法、采用HPLC法测定，苹果主要测定苹果酸、草酸、柠檬酸含量。水溶性糖与有机酸的比值，即为糖酸比。分别测定对照与试验组的苹果产量，折合为亩产表示。数据结果经EXCEL处理后，用SPSS 17.0的配对T检验进行差异性分析。
表4：复合微生物菌剂对苹果糖酸比与经济效益等指标的影响
Figure BDA0003431067770000111
Figure BDA0003431067770000121
表4结果显示，苹果的水溶性糖、有机酸、糖酸比和亩产量等指标均与复合微生物菌剂有一定关系。相比于对照组，试验组的果糖、蔗糖、葡萄糖等含量均显著提高，以果糖为主，总的水溶性糖指标也显著提高(P<0.05)；试验组的苹果酸、草酸、柠檬酸等指标也显著提高，以苹果酸为主，总的有机酸指标也显著提高(P<0.05)。总体结果，试验组的糖酸比相比于对照组，且提高了14.6％，亩产量相比于对照组也提高了18％。
实施例6
试验于2020年3月-7月，在广州番禺妃子笑荔枝种植基地进行。
本实施例中复合微生物菌剂中包含菌量为2.5×108CFU/ml的植物内芽孢杆菌种子液、7×108CFU/ml的红法夫酵母GOY1种子液和3×108CFU/ml的植物乳杆菌GBW-LP001种子液以及悬浮载剂X，悬浮载剂X的海藻多糖浓度为15％，且含有眉藻、小颤藻、四尾珊藻、小球藻的提取物。
复合微生物菌剂加水200倍稀释后，以0.3kg/株的应用剂量，对荔枝植株灌根，作为试验组。对照组仅用水罐根，不加本发明所述复合菌剂。每组50棵荔枝植株重复。
按照设计，试验为期5个月，重点复合微生物菌剂对荔枝的水溶性糖、有机酸、糖酸比、亩产量等指标的影响。分别采摘成熟期果实，每组取30个重复样品测定，按照NY T1536-2007微生物肥料田间试验技术规程及肥效评价指南，测定水溶性糖、有机酸、糖酸比、亩产量等指标。水溶性糖测定方法：新鲜的甜橘柚去皮榨汁，10000r/min离心15min，取上清液1mL，加入4mL 1.5％的草酸溶液，经0.22μm水系滤膜过滤后，采用HPLC法测定，荔枝主要测定果糖、葡萄糖、蔗糖含量。有机酸遵循国标GB 5009.157-2016食品安全国家标准食品有机酸的测定中的方法、采用HPLC法测定，苹果主要测定苹果酸、乳酸、酒石酸含量。水溶性糖与有机酸的比值，即为糖酸比。分别测定对照与试验组的荔枝产量，折合为亩产表示。数据结果经EXCEL处理后，用SPSS 17.0的配对T检验进行差异性分析。
表5：复合微生物菌剂对荔枝糖酸比与经济效益等指标的影响
Figure BDA0003431067770000122
Figure BDA0003431067770000131
表5结果显示，荔枝的水溶性糖、有机酸、糖酸比和亩产量等指标均与本发明所述复合微生物菌剂有一定关系。相比于对照组，试验组的果糖、葡萄糖、蔗糖等含量均显著提高，以果糖和葡萄糖为主，总的水溶性糖指标也显著提高17.3％(P<0.05)；试验组的苹果酸、乳酸、酒石酸等等指标也显著提高，以苹果酸为主，总的有机酸指标也显著提高7.5％(P<0.05)。总体结果，试验组的糖酸比相比于对照组提高了9.2％，亩产量相比于对照组提高了10.7％。
综上所述，本发明的复合微生物菌剂由三种益生菌与悬浮载剂X复配而成。三种益生菌包含植物内芽孢杆菌GBW-F008、红法夫酵母GOY1和植物乳杆菌GBW-LP001三种益生菌活性菌体孢子，三者的菌量分别为2～2.5×108CFU/ml、6～7×108CFU/ml和2～3×108CFU/ml；悬浮载剂X的海藻多糖浓度为15％，含有眉藻、丝藻、小颤藻、四尾珊藻、小球藻中3-4种提取物。
植物内芽孢杆菌GBW-F008具有较强的产酶、抑菌、解磷钾等功能，其发酵液中富含细菌性胞外多糖；红法夫酵母GOY1发酵液经特色诱导优化工艺发酵而成，发酵液中富含酵母多糖和活性酵母菌，可提高种子基地土壤溶剂性有机碳的含量，进而促进植物的碳素循环和可溶性糖的累积；植物乳杆菌GBW-LP001同时具有细菌性粘液多糖和发酵有机酸，包括柠檬酸、苹果酸、草酸、乳酸、酒石酸、富马酸等。这些菌株的配合使用，可通过系统的活性反应与代谢物累积效应，改善土壤理化形状，并促进果实中糖与酸的累积，从而改善糖酸比、果实口感等，并最终提高果实产量。经过系列实施例试验验证，确定了提高瓜果类糖酸比的复合微生物菌剂的合适复配菌类别与菌量范围，并通过用量试验确定0.3kg/株是合适用量，在此应用条件下，具有较高的应用性价比。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种提高瓜果类糖酸比的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂中包括植物内芽孢杆菌发酵液、红法夫酵母发酵液、植物乳杆菌发酵液和悬浮载剂X。
2.根据权利要求1所述的提高瓜果类糖酸比的复合微生物菌剂，其特征在于，所述植物内芽孢杆菌种子液、红法夫酵母种子液、植物乳杆菌种子液和悬浮载剂X的体积比为5~6:66~67:18~19:908~911。
3.根据权利要求1所述的提高瓜果类糖酸比的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂中植物内芽孢杆菌发酵液的菌量为2×108 CFU/ml ~2.5×108 CFU/ml；红法夫酵母发酵液的菌量为6×108 CFU/ml ~7×108 CFU/ml；植物乳杆菌发酵液的菌量为2×108CFU/ml ~3×108 CFU/ml。
4.根据权利要求1所述的提高瓜果类糖酸比的复合微生物菌剂，其特征在于，所述植物内芽孢杆菌发酵液采用保藏编号为CGMCC No. 20919的植物内芽孢杆菌GBW-F008经培养扩培得到；所述红法夫酵母发酵液采用保藏编号为CGMCC No.22504的红法夫酵母GOY1经培养扩培得到；所述植物乳杆菌发酵液采用保藏编号为CGMCC No.22078的植物乳杆菌GBW-LP001经培养扩培得到。
5.根据权利要求1所述的提高瓜果类糖酸比的复合微生物菌剂，其特征在于，所述悬浮载剂X中海藻多糖浓度为15%，其中含有眉藻提取物、丝藻提取物、小颤藻提取物、四尾珊藻提取物和小球藻提取物中的至少3种。
6.权利要求1~5任一项所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）植物内芽孢杆菌进行发酵扩培，当胞外多糖含量不再增加时，停止发酵，得到植物内芽孢杆菌发酵液；
（2）红法夫酵母进行发酵扩培，当酵母多糖含量不再增加，停止发酵，得到红法夫酵母发酵液；
（3）植物乳杆菌进行发酵扩培，当乳酸菌菌量不再增加，停止发酵，得到植物乳杆菌发酵液；
（4）将所述植物内芽孢杆菌发酵液、所述红法夫酵母发酵液、所述植物乳杆菌发酵液和悬浮载剂X混合均匀，得到所述复合微生物菌剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）得到的植物内芽孢杆菌发酵液的菌量为360×108 CFU/ml~450×108 CFU/ml，其中细菌性胞外多糖的含量为56.8g/L~57.3g/L；所述步骤（2）得到的红法夫酵母发酵液的菌量为90×108 CFU/ml~105×108CFU/ml，其中酵母多糖的含量为378 g/L~385 g/L；所述步骤（3）中得到的植物乳杆菌发酵液的菌量为110×108 CFU/ml~165×108 CFU/ml，其中粘液多糖的含量为29.3 g/L~29.5 g/L，有机酸的含量为2.8 g/L~3.34 g/L。
8.权利要求1~5任一项所述的复合微生物菌剂在用于提高瓜果类糖酸比或改善瓜果类口感中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述复合微生物菌剂的使用方法为：将所述复合微生物菌剂用水稀释200~250倍后，以0.3kg/株~0.4kg/株植株的用量，对瓜果类植株进行灌根处理，直至瓜果类成熟为止。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述瓜果类包括苹果、荔枝、甜橘柚。
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