CN114350531B - 一种促进番茄转色的复配微生物菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种促进番茄转色的复配微生物菌剂及其制备方法和应用。所述复配微生物菌剂由红法夫酵母种子液和植物乳杆菌种子液以7~8:2~3的体积比混合后经扩培制备而成的。所述复配微生物菌剂中不仅包含活性菌，还具有微生物源番茄红素、酵母多糖、植物乳杆菌胞外多糖、发酵有机酸等多种活性代谢物，成分丰富，互相协调促进，效果独特；且使用方法简单，经稀释后直接对番茄进行灌根处理即可，可提高多种番茄的水溶性糖、果色全磷、全钾含量，转色与成熟期番茄红素含量，减少转色耗时，缩短上市周期，具有较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于植物种植领域，具体涉及一种促进番茄转色的复配微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
番茄作为一种亦蔬亦果的茄果类蔬菜，被大众广泛喜爱，其富含的番茄红素，是一种很有开发前景的功能性色素，其能够预防多种疾病、增强机体免疫力和抗衰老等。但人体不能合成番茄红素，只能从外界的番茄及番茄制品中摄取。
番茄红素是调控番茄转色的重要色素，是一种重要的类胡萝卜素，在番茄果实中相当稳定。而如何提高番茄中番茄红素的含量，一直以来都是需要研究的重要课题。根据研究，除番茄品种外，温、光、水、气、肥等多种因素均可影响番茄中番茄红素的含量。而特定种植条件下，肥的差异对番茄红素指标的影响显得尤为重要。与常规的化肥、简单的有机肥相比，微生物菌剂具有活性微生物、微生物活性代谢物等多种复杂成分，可从多个角度调控土壤、植物的营养代谢。但有关于提高番茄红素含量、提高番茄转色效率的复合菌剂凤毛麟角。
发明内容
为了克服现有技术中存在的问题，本发明提供了一种促进番茄转色的复配微生物菌剂及其制备方法和应用。所述复配微生物菌剂能够提高红宝石、元春红、普罗斯旺等不同品种番茄的水溶性糖、果色全磷、全钾含量，转色与成熟期番茄红素含量，减少转色耗时，缩短上市周期。
为了实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：
本发明提供了一种促进番茄转色的复配微生物菌剂，所述复配微生物菌剂由混合菌液经扩培制备而成；所述混合菌液包括红法夫酵母种子液和植物乳杆菌种子液。
进一步的，所述红法夫酵母种子液和植物乳杆菌种子液的体积比为7～8:2～3。
进一步的，所述红法夫酵母种子液采用保藏编号为CGMCC No.22504的红法夫酵母GOY1培养获得；所述植物乳杆菌种子液采用保藏编号为CGMCC No.22078的植物乳杆菌GBW-LP001培养获得。
进一步的，所述复配微生物菌剂的总生物量为185×108CFU/ml～215×108CFU/ml，其中包括菌量为75×108CFU/ml～90×108CFU/ml的红法夫酵母、菌量为110×108CFU/ml～125×108CFU/ml的植物乳杆菌、85.6mg/L～87.5mg/L番茄红素、350g/L～360g/L的酵母多糖、28.6g/L～28.8g/L的乳酸菌胞外多糖和2.6g/L～3.2g/L的有机酸。
本发明还提供了所述的促进番茄转色的复配微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将红法夫酵母和植物乳杆菌分别制备斜面种子，并将种子菌苔接种至种子罐内，制成红法夫酵母种子液和植物乳杆菌种子液；
(2)将所述红法夫酵母种子液和植物乳杆菌种子液混合均匀，制备混合菌液；
(3)将所述混合菌液按照6％～8％的接种量接种到一级扩培罐内，进行一级扩培，得到一级扩培液；
(4)将所述一级扩培液按照15～20％的接种量转移到二级扩培罐内，分别于0h～58h和59h～72h进行分步骤扩培，得到所述复配微生物菌剂。
进一步的，所述红法夫酵母种子液的菌量为7.5×108CFU/ml～8.0×108CFU/ml；所述植物乳杆菌种子液的菌量为16×108CFU/ml～18×108CFU/ml；所述一级扩培液中包含菌量为25×108CFU/ml～28×108CFU/ml的红法夫酵母和菌量为33×108CFU/ml～36×108CFU/ml的植物乳杆菌。
进一步的，所述步骤(4)中分步骤扩培的具体条件为：在0h～58h，通气量为2.1～2.3vvm，罐内转速225～230rpm/min，扩培温度30℃～31℃，pH采用pH电极进行在线监测，通过自动料泵流加20％葡萄糖保持总糖浓度为15％～16％，同时流加5mol/L NaOH溶液进行pH调节，使pH维持在7.7±0.2；在59h～72h，罐内通气量为1.7～1.9vvm，罐内转速95～105rpm/min，扩培温度33℃～35℃。
本发明还提供了所述的复配微生物菌剂在用于促进番茄转色和/或提高番茄红素产量中的应用。
进一步的，在促进番茄转色和/或提高番茄红素产量时，用水将所述复配微生物菌剂稀释3000～4000倍后，以5kg/亩～6kg/亩的应用剂量对番茄植株进行灌根处理，一直到番茄成熟为止。
本发明还提供了所述的复配微生物菌剂在用于培育早上市番茄品种中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：
1、本发明所述复配微生物菌剂是由红法夫酵母GOY1与植物乳杆菌GBW-LP001种子液各自制备后，混合接种进行一级扩培，再转接至二级扩培罐内、经不同条件的分步骤扩培获得的，产品中兼具了两种活性菌，还具有微生物源番茄红素、酵母多糖、植物乳杆菌胞外多糖、发酵有机酸等多种活性代谢物，成分丰富，互相协调促进，效果独特。
2、所述复配微生物菌剂可提高红宝石、元春红、普罗斯旺等不同品种番茄的水溶性糖、果色全磷、全钾含量，转色与成熟期番茄红素含量，减少转色耗时，缩短上市周期，具有较高的应用价值。
3、所述复配微生物菌剂中的活性菌与代谢物提升了土壤的速效C、P、K等元素供应能力，还提升了番茄的对C、P、K等元素的代谢转化能力，且直接产生的番茄红素物质也对番茄果实内番茄红素的合成起到至关重要的促进作用。番茄红素作为成熟番茄中最重要的转色相关色素，对于番茄的转色过程，又非常关键，因此所述复配微生物菌剂具有较强的番茄转色促进能力。
4、本发明所述的复配微生物菌剂制备方法简单、合理，使用方便，其使用效果优异，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是红法夫酵母GOY1在YPD培养基上的菌落、镜检菌体图。
图2是植物乳杆菌GBW-LP001在MRS培养基上的菌落、镜检菌体图。
图3是植物乳杆菌GBW-LP001与红法夫酵母GOY1共存时对多种指标稳定性的影响结果。
具体实施方式
结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
实施例1
一、红法夫酵母GOY1的分离筛选与鉴定
1、红法夫酵母GOY1的分离筛选与纯化
取青岛胶州海参养殖水，梯度稀释后涂布于YPD培养基上，多次分离纯化后得到单菌落，命名为GOY1，保存。
菌株GOY1的菌落形态如图1a所示，菌落大而湿润，隆起，橙色至红色，表面光滑无褶皱；其菌体如图1b均为不规则椭圆形，互相独立分散。
2、红法夫酵母GOY1的分子鉴定
提取菌株GOY1的DNA作为模板，使用18S rRNA通用引物进行扩增，扩增片段进行序列测定，将得到的菌株GOY1的18S rDNA测序结果与GenBank中的序列进行比对分析，结果显示菌株GOY1与Phaffia rhodozyma同源性最高，因此确定该菌株GOY1为红法夫酵母。
3、红法夫酵母GOY1的菌种保藏
将筛选到的菌株GOY1进行菌种保藏，所述红法夫酵母GOY1的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2021年05月11日；红法夫酵母Phaffia rhodozyma的保藏编号为CGMCC No.22504。
4、红法夫酵母GOY1的菌株特性
红法夫酵母GOY1在25℃～35℃温度范围内能够生长繁殖，但其最适合生长温度在30℃，在pH 5～9的改良YPD培养基内均能正常生长，最适生长pH范围为6.5～8，该菌最高可耐受5％NaCl。该菌可利用葡萄糖、麦芽糊精、木糖、海藻糖、七叶苷等多种碳水化合物产酸，还可经过发酵分泌较多的酵母胞外多糖或产生丰富的色素类代谢物，如虾青素、番茄红素等。
二、植物乳杆菌GBW-LP001的分离筛选与鉴定
1、植物乳杆菌GBW-LP001的筛选与纯化
健康白羽肉鸡不同肠段取样，样品于MRS液体培养基和MRS固体培养基上经多次分离纯化得到一株产酸性好的乳酸杆菌，将该单菌落命名为GBW-LP001。
如图2a所示，菌株GBW-LP001在MRS平板上的菌落为非常规则的圆形，乳白色，直径2-3mm，表面光滑，边缘整齐，中间凸起，不透明；图2b显示，该菌菌体显微镜下呈短杆状，两头钝圆，单个、成对或链状，无鞭毛，无芽孢。
2、植物乳杆菌GBW-LP001的鉴定
以所述的菌株GBW-LP001的DNA为模板，使用16S rRNA通用引物27F和1492R进行扩增，扩增片段送往上海生工进行序列测定，所得核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，将得到序列经BLAST比对，结果发现，GBW-LP001与GenBank中的Lactobacillus palntarum序列的同源性为99.93％，因此初步确定该菌株为植物乳杆菌。
3、植物乳杆菌GBW-LP001的菌种保藏
将筛选到的菌株GBW-LP001进行菌种保藏，所述植物乳杆菌GBW-LP001的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2021年03月26日；植物乳杆菌Lactobacillus palntarum的保藏编号为CGMCC No.22078。
4、植物乳杆菌GBW-LP001的菌种特性
该菌为革兰氏阳性菌，菌体呈乳白色，与碳酸钙形成的透明圈约7-9mm，有较强的产酸能力和耐酸能力。该菌兼性厌氧，主要发酵单糖与双糖，葡萄糖产酸不产气，主要产物是乳酸盐；接触酶阴性，氧化酶阴性；不还原硝酸盐，主要生长温度范围为35℃-40℃，但50℃也能生长，在1％-5％NaCl、pH 4.5-8.5也能生长。
实施例2
一种促进番茄转色的复配微生物菌剂的制备方法如下：
1、混合种子制备：
将红法夫酵母GOY1、植物乳杆菌GBW-LP001分别制备克氏瓶斜面种子，并用无菌0.85％生理盐水将种子菌苔接种至种子罐内，制成种子培养液，具体的配方和工艺条件为：
红法夫酵母GOY1的种子培养液配方为：麦芽浸膏35～40g，葡萄糖5～8g，蛋白胨3～5g，酵母膏2～2.5g，磷酸氢二胺1.5～2g，初始pH 7.6～7.8，蒸馏水1L；红法夫酵母GOY1种子罐罐内通气量为1.8～2.1vvm，罐内转速180～190rpm/min，培养温度29℃～31℃，培养时间16-18h，种子液中红法夫酵母GOY1的菌量达到7.5～8.0×108CFU/ml，菌体均匀，活力旺盛。
植物乳杆菌GBW-LP001的种子培养液配方为：乳糖15～18g、脱脂乳2.5～3g、NaCl6～8g、磷酸氢二钾5～6g、盐酸硫胺素1.5～2g，初始pH 7.8～8.0，蒸馏水1L；植物乳杆菌GBW-LP001种子罐罐内通气量为1.0～1.2vvm，罐内转速85～95rpm/min，培养温度38℃～39℃，培养时间5～7h，种子液中含植物乳杆菌GBW-LP001的菌量达到16～18×108CFU/ml，菌体均匀，活力旺盛。
将活化好的红法夫酵母GOY1与植物乳杆菌GBW-LP001种子液按照7～8:2～3的体积比混合均匀，制备成混合种子液。
2、一级扩培
将混合种子液按照6～8％的接种量接种到一级扩培罐内，进行一级扩培，得到一级扩培液，其中红法夫酵母GOY1的菌量达到25～28×108CFU/ml、植物乳杆菌GBW-LP001的菌量达到33～36×108CFU/ml。
一级扩培液配方为：葡萄糖蜜50g/L、酵母提取物40g/L、谷氨酸钠25g/L、乙烯利12g/L、米糠油4.5g/L、氯化镁2.5g/L、鱼粉1.5g/L、烟碱3.5ml/L，初始pH 7.6～7.8，蒸馏水1L；
一级扩培条件为：罐内通气量为1.6～1.8vvm，罐内转速185～190rpm/min；扩培时间23～25h，扩培温度31℃～32℃，此时主要促进红法夫酵母GOY1与植物乳杆菌GBW-LP001菌体增殖。
3、二级分步骤扩培
将一级扩培液按照15～20％的接种量转移到二级扩培罐内，在0～58h和59～72h，进行不同条件的分步骤扩培，最终得到总生物量为185～215×108CFU/ml的复配微生物菌剂，其中红法夫酵母GOY1菌量为75～90×108CFU/ml、植物乳杆菌GBW-LP001菌量为110～125×108CFU/ml，番茄红素产量为85.6～87.5mg/L，酵母多糖产量达350～360g/L，乳酸菌胞外多糖含量达28.6g/L～28.8g/L，有机酸产量达2.6～3.2g/L。
二级扩培液配方为：甘蔗糖蜜45～50g，蛋白胨18～20g，玉米芯皮粉10～15g，硫酸铵5～5.5g，血浆蛋白粉2～2.5g，酵母膏1.5～2g，磷酸二氢钾1.5～2g，硝酸钠1.5～2g，氯化铵0.5～0.8g，硫酸亚铁0.3～0.5g，10×104U/g中性蛋白酶3～3.5g，5×104U/g糖化酶2～2.5g，初始pH 7.6～7.8，蒸馏水1L；
二级扩培罐内分步骤扩培条件为：在前0～58h，通气量为2.1～2.3vvm，罐内转速225～230rpm/min，扩培温度30℃～31℃，pH采用pH电极进行在线监测，通过自动料泵流加20％葡萄糖保持总糖浓度为15％～16％，同时流加5mol/LNaOH溶液进行pH调节，使pH维持在7.7±0.2，该过程主要是促进红法夫酵母GOY1代谢底物产番茄红素和酵母多糖；在后59～72h，罐内通气量为1.7～1.9vvm，罐内转速95～105rpm/min，扩培温度33℃～35℃，此时主要促进植物乳杆菌GBW-LP001的增殖与有机酸的产生。
实施例3
试验考察了植物乳杆菌GBW-LP001与红法夫酵母GOY1共存时，与红法夫酵母GOY1单独存在下，对菌量、番茄红素、酵母多糖、有机酸等几种指标稳定性的影响。
红法夫酵母GOY1的单独培养：将红法夫酵母GOY1制备茄形瓶种子，接种至种子罐内，制成种子培养液，具体配方和工艺条件同实施例2，种子液中红法夫酵母GOY1的菌量达到7.5～8.0×108CFU/ml，菌体均匀，活力旺盛。将活化好的红法夫酵母GOY1种子液接种到一级扩培罐内，进行一级扩培，配方和工艺条件同实施例2。将一级扩培液按照15～20％的接种量转移到二级扩培罐内，进行二级扩培，配方和工艺条件同实施例2。最终红法夫酵母GOY1扩培液中菌量为70～90×108CFU/ml，番茄红素产量为88～90mg/L，酵母多糖产量达365～370g/L，有机酸产量达0.1～0.2g/L。
对照组为红法夫酵母GOY1扩培液，试验组为实施例2制备得到的复配微生物菌剂。两组均放置于30℃培养箱内，每隔3月测定菌量、番茄红素、酵母多糖和有机酸等指标，计算相比于初始的留存率。
菌量测定参照：GB 20287-2006农用微生物菌剂与NYT 2321-2013微生物肥料产品检验规程进行；番茄红素指标测定，参照NY/T 1651-2008蔬菜及制品中番茄红素的测定高效液相色谱法测定；酵母多糖测定，参考NY/T 1676-2008食用菌中粗多糖含量的测定与DB15/T 2033-2020乳酸菌胞外多糖的分离纯化与鉴定技术规程；有机酸测定，遵循国标GB5009.157-2016食品安全国家标准-食品有机酸的测定中的方法、采用HPLC法测定。
结果如图3所示，菌量、番茄红素、酵母多糖和有机酸等指标留存率均随着存放时间延长而降低，尤其是菌量降幅较大；但与对照组相比，试验组的降幅明显较小这是由于在制备微生物菌剂时，植物乳杆菌GBW-LP001的发酵液中，富含乳酸菌活性菌体与有机酸代谢物，而这些物质延缓了菌量的死亡、提高番茄红素、酵母多糖、有机酸等指标的稳定性，能够提高在实际应用中的微生物菌剂的稳定性与效应性。因此，本发明的复配微生物菌剂对番茄红素、酵母多糖和有机酸等指标具有很好的稳定性。
实施例4
试验于2020年5月到6月，在青岛平度市海峡两岸合作区平度根源茄果类蔬菜大棚内进行。按照上述试验方法，仅培养红法夫酵母GOY1获得红法夫酵母GOY1发酵液，菌量为80×108CFU/ml，作为对照组。将总菌量为200×108CFU/ml的实施例2制备的复配微生物菌剂作为试验组，其中红法夫酵母GOY1菌量为80×108CFU/ml、植物乳杆菌GBW-LP001菌量为120×108CFU/ml。
对照组加水稀释1600倍，应用菌量浓度为0.05×108CFU/ml；试验组加水稀释4000倍，总应用菌量浓度也为0.05×108CFU/ml，其中红法夫酵母GOY1菌量为0.02×108CFU/ml，植物乳杆菌GBW-LP001菌量为0.03×108CFU/ml。试验组与对照组保持总菌量一致，均按照2kg/亩的应用剂量与灌溉水一起，进行罐根。每个试验组规模为3垅，每垅定植30～40棵番茄。
考察土壤中溶解性有机碳含量、速效磷、速效钾等指标的差异。土壤溶解性有机碳含量测定方法：才有总有机碳分析仪，分别测定性总碳含量和溶解性无机碳含量，二者之差即为溶解性有机碳含量。土壤速效磷含量采用钼锑抗显色-紫外分光光度法测定；速效钾采用火焰光度计法测定。每组取30个土壤样品重复，分别测定溶解性有机碳、速效磷与速效钾指标。数据结果经EXCEL处理后，用SPSS 17.0进行差异性分析(配对样本T检验)。
表1：等菌量下单菌与复配菌剂对土壤理化特性指标的影响对比
结果如表1所示，复配了植物乳杆菌GBW-LP001的试验组，极其显著提高了土壤溶解性有机碳、速效磷与速效钾含量(P<0.01)，这主要是因为乳酸菌胞外多糖促进了土壤溶解性有机碳含量指标的提升，而乳酸菌发酵液中含有丰富的有机酸，可促进土壤中磷与钾元素的释放，从而提升土壤速效磷与速效钾指标的含量。这些可被植物快速吸收利用的C、P、K等元素，对于番茄红素的合成，具有至关；而番茄红素作为成熟番茄中最重要的转色相关色素，对于番茄的转色过程尤为重要。
实施例5
试验于2020年6月到12月，在青岛平度市海峡两岸合作区平度根源茄果类蔬菜大棚内进行。将供试红宝石番茄分为5组，每组采用实施例2制备的复配微生物菌剂的不同稀释倍数的菌剂进行试验，具体分组见表2。各组均按照2kg/亩的应用剂量与灌溉水一起，进行罐根，每个试验组规模为3垅，每垅定植30～40棵番茄。
试验为期6个月，重点考察复配微生物菌剂不同稀释菌量对番茄红素、番茄果实其他指标和番茄转色耗时的影响。分别于番茄转色期、成熟期采集样品，测定相关转色耗时、番茄红素和番茄果实全磷、全钾含量。转色耗时，是记录从转色期到成熟期的时长。番茄红素指标测定，参照NY/T 1651-2008蔬菜及制品中番茄红素的测定高效液相色谱法测定。番茄果实水溶性糖测定方法：新鲜的甜橘柚去皮榨汁，10000r/min离心15min，取上清液1mL，加入4mL 1.5％的草酸溶液，经0.22μm水系滤膜过滤后，采用便携式折光糖度计测定。番茄果实全磷含量采用硫酸-过氧化氢消煮，钒钼黄比色法测定；果实全钾含量采用钼蓝比色-分光光度法测定。每组取30个重复样品测定，结果经EXCEL处理后，用SPSS17.0进行差异性分析。
表2：不同稀释倍数下，复配微生物菌剂对番茄红素、果实其他指标和番茄转色耗时的影响
结果如表2所示，稀释倍数在3000倍到10000倍之间，随着稀释倍数的减小，菌量浓度逐渐提升，番茄转色耗时逐渐缩短，转色期与成熟期的番茄红素含量，均逐渐增加，番茄果实的水溶性糖、全磷和全钾含量，也是随着稀释倍数减小、菌量增加而逐渐增加，各组间均达显著差异(P<0.05)。3000～4000倍与1000～2000倍稀释两个对比组，各个指标均无显著差异(P>0.05)。因此，在后续的本发明所述复配微生物菌剂应用时，建议进行3000～4000倍稀释，即稀释后浓度达0.046～0.072×108CFU/ml即可获得较高的应用性价比。
实施例6
试验于2020年7月到12月，在青岛平度市海峡两岸合作区平度根源茄果类蔬菜大棚内进行。将供试红宝石番茄分为6组，每组复配微生物菌剂均加水经过4000倍稀释，菌量范围为0.046～0.054×108CFU/ml，考察从0～8kg/亩不同应用剂量下的灌根的转色效果，具体分组见表3，每个试验组规模为3垅，每垅定植35～45棵番茄。
试验为期5个月，重点考察复配微生物菌剂不同应用剂量对番茄红素、番茄果实其他指标和番茄转色耗时的影响。分别于番茄转色期、成熟期采集样品，测定相关转色耗时、番茄红素和番茄果实全磷、全钾含量。转色耗时，是记录从转色期到成熟期的时长。番茄红素指标测定，参照NY/T 1651-2008蔬菜及制品中番茄红素的测定高效液相色谱法测定。番茄果实水溶性糖测定方法：新鲜的甜橘柚去皮榨汁，10000r/min离心15min，取上清液1mL，加入4mL 1.5％的草酸溶液，经0.22μm水系滤膜过滤后，采用便携式折光糖度计测定。番茄果实全磷含量采用硫酸-过氧化氢消煮，钒钼黄比色法测定；果实全钾含量采用钼蓝比色-分光光度法测定。每组取35个重复样品测定，结果经EXCEL处理后，用SPSS17.0进行差异性分析。
表3：不同应用剂量下，复配微生物菌剂对番茄红素、果实其他指标和番茄转色耗时的影响
结果如表3显示，在0-6kg/亩剂量范围内，随着应用剂量增加，番茄转色耗时逐渐缩短，转色期与成熟期的番茄红素含量均逐渐增加，番茄果实的水溶性糖、全磷和全钾含量，也是随着用量增加而逐渐增加，各组间均达显著差异(P<0.05)。在7-10kg/亩剂量范围内，随着应用剂量增加，番茄转色耗时、转色期与成熟期的番茄红素含量、番茄果实的水溶性糖、全磷和全钾含量等指标，均无显著差异(P>0.05)，说明5～6kg/亩是比较合适的应用剂量，超过该应用剂量，指标提升幅度有限，反而带来浪费。因此，在后续的本发明所述复配微生物菌剂应用时，采用3000～4000倍稀释、5～6k/亩应用剂量，这种应用方案下，即可获得较高的应用性价比。
实施例7
试验于2020年9月至2021年2月，在寿光市上口镇后牟邵村某番茄大棚内进行，该棚主要种植元春红番茄。将供试番茄分为2组，对照组仅用水灌根，试验组采用本发明所述复配微生物菌剂，加水4000倍稀释后，按照6kg/亩剂量，灌根，每组试验规模为8垅，每垅定植40～45棵番茄。
试验为期6个月，重点考察本发明所述复配微生物菌剂对元春红番茄的番茄红素含量、转色耗时与上市周期等指标的影响。分别于番茄转色期、成熟期采集样品，测定相关转色耗时、番茄红素含量。转色耗时，是记录从转色期到成熟期的时长。番茄红素指标测定，参照NY/T 1651-2008蔬菜及制品中番茄红素的测定高效液相色谱法测定。番茄上市周期，是指番茄从转色、成熟、晚熟到上市的整个周期。每组取50个重复样品测定，结果经EXCEL处理后，用SPSS 17.0进行差异性分析。
表4：复配微生物菌剂对元春红番茄红素含量、转色耗时与上市周期的影响
结果如表4显示，与对照组相比，使用本发明的复配微生物菌剂促进了番茄的转色过程，极其显著提高了元春红番茄从转色期到成熟期的番茄红素含量，缩短了番茄转色耗时和上市周期(P<0.01)。早上市的番茄可带来价格、市场占有率等多方面优势，对蔬菜采收过程具有较高的经济效益。
实施例8
试验于2020年10月-2021年2月，在云南元谋县番茄种植基地进行，该棚主要种植普罗斯旺番茄。将供试番茄分为2组，对照组仅用水灌根，试验组采用本发明所述复合微生物菌剂，加水4000倍稀释后，按照6kg/亩剂量，灌根，每组试验规模为8垅，每垅定植40～45棵番茄。
试验为期5个月，重点考察本发明所述复配微生物菌剂对普罗斯旺番茄的番茄红素含量、转色耗时与上市周期等指标的影响。分别于番茄转色期、成熟期采集样品，测定相关转色耗时、番茄红素含量。转色耗时，是记录从转色期到成熟期的时长。番茄红素指标测定，参照NY/T 1651-2008蔬菜及制品中番茄红素的测定高效液相色谱法测定。番茄上市周期，是指番茄从转色、成熟、晚熟到上市的整个周期。每组取50个重复样品测定，结果经EXCEL处理后，用SPSS 17.0进行差异性分析。
表5：复配微生物菌剂对普罗斯旺番茄红素含量、转色耗时与上市周期的影响
结果如表5显示，与对照组相比，使用本发明的复配微生物菌剂促进了番茄的转色过程，极其显著提高了普罗斯旺番茄从转色期到成熟期的番茄红素含量，缩短了番茄转色耗时和上市周期(P<0.01)，早上市的番茄可带来价格、市场占有率等多方面优势，对蔬菜采收过程具有较高的经济效益。
综上所述，本发明所述复配微生物菌剂是由红法夫酵母GOY1与植物乳杆菌GBW-LP001种子液各自制备后，混合接种进行一级扩培，在转接二级罐内、经不同条件的分步骤扩培获得的，最终其总生物量为185～215×108CFU/ml的复配微生物菌剂，其中红法夫酵母GOY1菌量为75～90×108CFU/ml、植物乳杆菌GBW-LP001菌量为110～125×108CFU/ml，番茄红素产量为85.6～87.5mg/L，酵母多糖产量达350～360g/L，乳酸菌胞外多糖含量达28.6g/L～28.8g/L，有机酸产量达2.6～3.2g/L。与单独扩培制备红法夫酵母GOY1发酵相比，复配了植物乳杆菌发酵液，获得了更多的有机酸与植物乳杆菌胞外多糖，提高了保存过程中菌量、番茄红素、酵母多糖、有机酸等指标的留存率，还可提高土壤中溶解性有机碳、速效磷与速效钾的含量。经过系列试验比较，确定了该复配微生物菌剂经过3000～4000倍稀释、按照5～6kg/亩应用剂量使用，产生的性价比较高。该复配微生物菌剂可提高红宝石、元春红、普罗斯旺等不同品种番茄的水溶性糖、果色全磷、全钾含量，转色与成熟期番茄红素含量，减少转色耗时，缩短上市周期，具有较高的应用价值。由于复配微生物菌剂的活性菌与代谢物提升了土壤的速效C、P、K等元素供应能力，进而提升了番茄的对C、P、K等元素的代谢转化能力，且直接的番茄红素物质也对番茄果实内番茄红素的合成起到了至关重要的促进作用。番茄红素作为成熟番茄中最重要的转色相关色素，对于番茄的转色过程，又非常关键，因此所述复配微生物菌剂，具有提高番茄红素含量、促进番茄转色等功效，也会番茄果实中番茄红素累积、功能价值发挥提供了基础。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种促进番茄转色的复配微生物菌剂，其特征在于，所述复配微生物菌剂由混合菌液经扩培制备而成；所述混合菌液为红法夫酵母（Phaffia rhodozyma）种子液和植物乳杆菌（Lactobacillus palntarum）种子液；所述红法夫酵母种子液采用保藏编号为CGMCCNo.22504的红法夫酵母GOY1培养获得；所述植物乳杆菌种子液采用保藏编号为CGMCCNo.22078的植物乳杆菌GBW-LP001培养获得。
2.根据权利要求1所述的促进番茄转色的复配微生物菌剂，其特征在于，所述红法夫酵母种子液和植物乳杆菌种子液的体积比为7~8:2~3。
3.根据权利要求1所述的促进番茄转色的复配微生物菌剂，其特征在于，所述复配微生物菌剂的总生物量为185×108 CFU/ml~215×108 CFU/ml，其中包括菌量为75×108 CFU/ml~90×108 CFU/ml的红法夫酵母、菌量为110×108 CFU/ml ~125×108 CFU/ml的植物乳杆菌、85.6 mg/L ~87.5 mg/L番茄红素、350 g/L ~360 g/L的酵母多糖、28.6 g/L~28.8 g/L的乳酸菌胞外多糖和2.6g/L~3.2 g/L的有机酸。
4.权利要求1-3任一项所述的促进番茄转色的复配微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1）：将红法夫酵母和植物乳杆菌分别制备斜面种子，并将种子菌苔接种至种子罐内，制成红法夫酵母种子液和植物乳杆菌种子液；
步骤（2）：将所述红法夫酵母种子液和植物乳杆菌种子液混合均匀，制备混合菌液；
步骤（3）：将所述混合菌液按照6%~8%的接种量接种到一级扩培罐内，进行一级扩培，得到一级扩培液；
步骤（4）：将所述一级扩培液按照15~20%的接种量转移到二级扩培罐内，分别于0h~58h和59h~72h进行分步骤扩培，得到所述复配微生物菌剂。
5.根据权利要求4所述的促进番茄转色的复配微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述红法夫酵母种子液的菌量为7.5×108 CFU/ml~8.0×108 CFU/ml；所述植物乳杆菌种子液的菌量为16×108 CFU/ml~18×108 CFU/ml；所述一级扩培液中包含菌量为25×108 CFU/ml~28×108 CFU/ml的红法夫酵母和菌量为33×108 CFU/ml~36×108 CFU/ml的植物乳杆菌。
6.根据权利要求4所述的促进番茄转色的复配微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中分步骤扩培的具体条件为：在0h~58h，通气量为2.1 vvm~2.3 vvm，罐内转速225 rpm/min~230 rpm/min，扩培温度30℃~31℃，pH采用pH电极进行在线监测，通过自动料泵流加20%葡萄糖保持总糖浓度为15%~16%，同时流加5mol/L NaOH溶液进行pH调节，使pH维持在7.7±0.2；在59h~72h，罐内通气量为1.7 vvm~1.9 vvm，罐内转速95 rpm/min~105rpm/min，扩培温度33℃~35℃。
7.权利要求1-3任一项所述的复配微生物菌剂在用于促进番茄转色和/或提高番茄的番茄红素产量中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在促进番茄转色和/或提高番茄的番茄红素产量时，用水将所述复配微生物菌剂稀释3000~4000倍后，以5kg/亩~6kg/亩的应用剂量对番茄植株进行灌根处理，一直到番茄成熟为止。
9.权利要求1-3任一项所述的复配微生物菌剂在用于培育早上市番茄品种中的应用。
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