CN113122477B - 一种复合微生物制剂、制备方法及应用 - Google Patents

一种复合微生物制剂、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种复合微生物制剂，包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001菌液、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌液和助剂，所制成的微生物复合制剂中哈茨木霉菌和枯草芽孢杆菌菌落总数比为(1‑3):(100‑300)；该复合微生物制剂可有效提高柑橘叶片中叶绿素的含量；有效防控柑橘炭疽病发生；提高柑橘中可溶性固形物的含量，提高柑橘的Vc含量；并且对柑橘有良好的促生、促产效果。

Description

一种复合微生物制剂、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种复合微生物制剂、制备方法及应用。
背景技术
柑橘为世界第一大水果，世界第三大农贸产品，近年来各地区对柑橘的市场需求量逐年增加，相应的种植面积也在逐年增加。但是，由于种植面积增加，柑橘叶片黄化现象和炭疽病等病害日渐凸显。沙糖桔作为柑橘的优良品种，种植面积较大，制约柑橘类产业发展的问题在沙糖桔上体现较为明显。国内对柑橘病害的防治主要以化学防治为主，众所周知，化学农药的长期大量使用往往会导致环境污染、农药残留及病原菌的抗药性等诸多问题难以解决。虽然也逐渐出现防治柑橘病害的微生物制剂，但是其防病和促生、促长效果大多有限，因此，柑橘产业现急需一种对柑橘病害有良好防效的微生物制剂。
发明内容
为了解决上述农业生产存在的技术问题及现有技术的不足，本发明提供了一种对柑橘病害有良好防效的复合微生物制剂。
为达此目的，本发明采用以下技术方案。
在第一方面，本发明提供一种复合微生物制剂，包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JNKC001菌液、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌液和助剂；
其中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2017年11月20日，保藏编号为CGMCCNO.14929；
哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2017年11月20日，保藏编号为CGMCCNO.14638；
所制成的微生物复合制剂中哈茨木霉菌和枯草芽孢杆菌菌落总数比为(1-3):(100-300)。
优选地，哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌液与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JNKC001菌液的浓度比为(1-1.5)*108cfu/ml:(2-3)*109cfu/ml，且体积比为(1-2):(5-10)。
优选地，所述助剂包括腐殖质酸、吸附剂、润湿剂、稳定剂和保护剂，各组分的质量百分比如下：
Figure BDA0003038498750000021
优选地，所述吸附剂为草碳、玉米芯和麦麸中一种或多种；所述润湿剂为萘磺酸盐甲醛缩合物；所述稳定剂为羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇丙烯酸钠、聚甲基丙烯酸钠中一种或多种；保护剂为L-抗坏血酸。
在第二方面，提供一种复合微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料准备，使用单菌种纯发酵的方法分别制取枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JNKC001菌液和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌液；
(2)将制得的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001菌液和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌液进行复配，制得复合制剂的原液；所制成的复合制剂的原液中哈茨木霉菌和枯草芽孢杆菌菌落总数比为(1-3):(100-300)；
(3)将制得的原液加入助剂制得复合微生物制剂。
其中，步骤(2)中，哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌液与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001菌液的浓度比为(1-1.5)*108cfu/ml:(2-3)*109cfu/ml，且体积比为(1-2):(5-10)。
其中，步骤(3)中，在制得原液中加入一定质量分数的腐殖质酸、吸附剂、润湿剂、稳定剂和保护剂，制得复合微生物制剂。
在第四方面，提供一种复合微生物制剂在防治柑橘土传病害方面的应用。
在第五方面，提供一种复合微生物制剂在柑橘促生、促长方面的应用。
本发明的有益效果如下：
该复合微生物制剂可有效提高柑橘叶片中叶绿素的含量，对柑橘黄化现象具有显著的改良作用；有效防控柑橘炭疽病发生，促进植株健康生长；提高柑橘中可溶性固形物的含量，食用时口感更加甜美，提高柑橘的Vc含量，营养价值更高，商品性提高；并且对柑橘有良好的促生、促产效果，可使柑橘减少落花、落果的现象，提高产量，增加果农收益。
保藏信息
本发明分离鉴定的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001，己于2017年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.14929。
本发明分离鉴定的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株，己于2017年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.14638。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
实施例1制备菌剂的各菌株的筛选及培养
(1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001的筛选
取新鲜的感染炭疽病的沙糖桔叶片10g研磨成糊状，加入到已灭菌的装有90ml无菌水的锥形瓶中，180r/min，充分振荡30min，取上清液。将土壤中筛选到的各菌株液体与炭疽病汁液等体积混合15min，以炭疽病汁液为阳性对照，采用局部枯斑法接种，选择长势一致的中部叶片，采用常规摩擦接种法，左边为处理，右边为对照，每个处理5片叶子，重复3次，做好标记，观察记录叶部发病情况。将发病率最少的菌株选为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JNKC001。
(2)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001的培养
1)取活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001，接种于种子培养基，在温度为28～33℃、转速为180～240r/min的条件下，培养10～12h，制得液体种子；
2)取步骤1)制得的液体种子，按体积百分比2％的比例接种于发酵培养基，在温度为28～33℃、转速为180～240r/min的条件下，培养28～40h，制得发酵菌液。
在步骤1)前还包括将所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001进行活化的步骤：
取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001，斜面转接至培养基上进行活化；
其中，活化温度为28～33℃、培养时间为12～16h。
活化培养基组分如下：
蛋白胨7g、NaCl 5g、牛肉膏3g、琼脂20g、H2O 1000mL，pH 7。
步骤1)中和步骤2)中发酵培养基中各组分的含量以质量百分比表示如下：
葡萄糖0.3％～2％，玉米粉1％～5％，豆粕粉1％～5％，磷酸氢二钠0.1‰～0.5‰，磷酸二氢钠0.5‰～5‰；pH6.5～7.5。
本发明通过正交实验，优化枯草芽孢杆菌的活化条件，最终确定活化温度为30℃，活化时间为14h的活化效果最好。在菌液接种量2％、发酵温度30℃的条件下，转数210r/min，种子液培养时间11h，发酵菌液培养时间34h，活菌数最多，有效活菌数达到3×109cfu/ml，芽孢率达到99％。
(3)哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC的筛选在PDA平板上活化土壤中筛选到的木霉菌，用5mm的打孔器在木霉菌平板上打成5mm的菌饼。用平板对峙法分别检测土壤中筛选到的木霉菌对沃柑溃疡病菌的拮抗效果，在PDA平板中心接种直径为5mm的木霉菌菌饼，沃柑溃疡病接种于距木霉菌菌饼3cm处，28℃恒温箱中培养5～6天，待各接种木霉菌的菌株长满整个培养皿时，测量各培养皿中木霉菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种细菌后的抑制生长半径)，用抑制率表示(抑制率(％)＝(对照生长量－处理生长量)/对照生长量×100％)，选出拮抗效果最明显的且沃柑溃疡病菌长势最弱的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株。
(4)哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC的培养
1)将活化的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株接种到PDA液体培养基上，转速为100～140r/min的条件下，培养温度为25-30℃，培养时间为50-72h，制得种子液；
2)将步骤1)制得的种子液接种至液体发酵培养基中，在25-30℃的条件下发酵培养，制得发酵液；
在步骤1)前还包括将所述哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株进行活化的步骤：
将哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株接种于PDA培养基平板上，于25-30℃，条件下培养3-6天，制得活化菌株。
所述步骤1)和2)中的液体发酵培养基的各组分如下：
马铃薯12-15g，葡萄糖3-5g，磷酸氢二钾0.8-1.5g，氯化钠1.0-3.0g，水定容至1L，PH4.5。
本发明通过正交实验，优化枯草芽孢杆菌的活化条件，最终确定活化温度为28℃，活化时间为5d的活化效果最好。在发酵温度28℃的条件下，转数120r/min，种子液培养时间64h，固体发酵时间85h，孢子存活量最多，孢子存活量达到1.5×108cfu/ml。
实施例2复合微生物制剂的制备
1)将浓度为3*109cfu/ml的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001与1.5*108cfu/ml的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC按照10：2比例(体积比)混合，进行复配，制得复合制剂的原液；
2)在制得原液中加入腐殖质酸 6-10％、吸附剂70-80％、润湿剂10-15％、稳定剂3-5％和保护剂1-2％，得到复合微生物制剂。
复合制剂中助剂的可能组成也可以用表格的形式表示(每100g复合制剂)，具体如表1：
Figure BDA0003038498750000061
实验例复合微生物制剂应用于沙糖桔
本试验共设2个处理，共设3个小区，每个重复随机选取50株沙糖桔，各小区随机排列，总计300株沙糖桔。
处理1(对照组)：常规水肥管理，不施用复合微生物制剂；
处理2(实验组)：使用复合微生物制剂进行灌根，用量为5L/667m2/次，共施用3次，时间间隔为30d左右，其他管理模式和处理1相同。
1、沙糖桔叶片中叶绿素含量
每个小区随机选取5株沙糖桔，每株分成上、中、下三个部位，每个部位随机摘取5片树叶，使用手持式叶绿素计(KONICA MINOLTA SPAD—502PIus)对每片树叶的3个不同位置进行测定，然后将测定结果求平均值，作为该片树叶的SPAD值，最后将全部摘取树叶的SPAD值求平均值，作为该棵沙糖桔树叶片中叶绿素含量。
表2复合微生物制剂对沙糖桔叶片中叶绿素含量的影响
Figure BDA0003038498750000071
[注]不同小写字母表示差异达显著水平(P＜0.05)。
处理1在小区内沙糖桔叶片中叶绿素含量存在差异，小区3和小区1、小区3和小区2对比差异达显著水平，小区3中叶片黄化问题较重；处理2在小区内沙糖桔叶片中叶绿素含量差异不显著。处理1沙糖桔平均叶片中叶绿素的含量是63.01SPAD，处理2沙糖桔平均叶片中叶绿素的含量是72.15SPAD，处理2比处理1沙糖桔叶片中叶绿素的含量增加14.51％，且两处理通过显著性分析，差异达显著性水平。
2、沙糖桔炭疽病发病率及防效
每个小区随机选取5株沙糖桔，每株沙糖桔分成上、中、下三个部位，每个部位随机观察10片树叶，记录具有炭疽病病斑的树叶叶片数，统计叶片发病率，并按沙糖桔炭疽病病斑所占叶面积进行分级，统计分析枯草芽孢杆菌对沙糖桔炭疽病的防治效果。
沙糖桔炭疽病分级标准：
0级：无病；
1级：叶片有少量病斑，病斑面积占叶面积约1/16；
2级：叶片有较多病斑，病斑面积占叶面积约1/8；
3级：病斑面积占叶面积约1/4；
4级：病斑面积占叶面积约1/2；
5级：病斑面积占叶面积约3/4。
发病率(％)＝病叶数/调查总叶数×100
防治效果(％)＝(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数×100
病情指数(％)＝∑(病级叶数×该病级值)/(调查总叶数×最高级值)×100
表3复合微生物制剂对沙糖桔炭疽病发病率的影响及防效
Figure BDA0003038498750000081
[注]不同小写字母表示差异达显著水平(P＜0.05)。
处理1和处理2在沙糖桔炭疽病发病率上各处理组内差异都不显著，两处理在平均发病率上存在明显差异，处理2较处理1发病率下降15.33％。通过沙糖桔炭疽病病情分级标准，计算得使用复合微生物制剂处理过的沙糖桔对炭疽病防控效果达67.27％。
3、沙糖桔果汁中可溶性固形物的含量
沙糖桔成熟后，在每个小区随机选取5个果实，榨汁，使用糖度分析仪(ATAGO PAL-1)测沙糖桔果汁中的可溶性固形物含量，使用2，6—二氯酚靛酚钠氧化还原滴定法测沙糖桔果汁中Vc含量。
表4复合微生物制剂对沙糖桔品质的影响
Figure BDA0003038498750000091
[注]不同小写字母表示差异达显著水平(P＜0.05)。
处理1和处理2在沙糖桔果汁中可溶性固形物的含量各处理组内差异不显著，两处理间差异达显著水平，且使用复合微生物制剂处理过的沙糖桔，在果汁中的可溶性固形物含量较对照提高13.00个百分点；处理1和处理2在沙糖桔果汁中Vc含量各处理组内差异不显著，两处理间差异达显著水平，且使用复合微生物制剂处理过的沙糖桔Vc含量较对照提高5.98个百分点。4、沙糖桔单株产量
沙糖桔成熟后，在每个小区随机选取5株，将每株沙糖桔上收获到的所有果实进行称重、记录。
表5复合微生物制剂对沙糖桔单株产量的影响
Figure BDA0003038498750000101
[注]不同小写字母表示差异达显著水平(P＜0.05)。
处理1和处理2在沙糖桔单株产量上各处理组内差异不显著，使用复合微生物制剂处理过的沙糖桔比对照区平均单株产量增加7.78个百分点，通过显著性分析，两处理在沙糖桔单株产量上差异达显著水平。
通过上述实验例可以看出：经过复合微生物制剂处理的沙糖桔叶片叶绿素含量显著提高，复合微生物制剂对沙糖桔炭疽病防治效果达67.27％，经过复合微生物制剂处理的沙糖桔的可溶性固形物含量以及Vc含量均显著提高，经过复合微生物制剂处理的沙糖桔单株产量显著提高。因此，该复合微生物制剂可有效提高沙糖桔叶片中叶绿素的含量，对沙糖桔黄化现象具有显著的改良作用；有效防控沙糖桔炭疽病发生，促进植株健康生长；提高沙糖桔中可溶性固形物的含量，食用时口感更加甜美，提高沙糖桔的Vc含量，营养价值更高，商品性提高；并且对沙糖桔有良好的促生、促产效果，可使沙糖桔减少落花、落果的现象，提高产量，增加果农收益。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种复合微生物制剂，其特征在于，由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JNKC001菌液、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）JNHC菌液和助剂组成；
其中，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JNKC001菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2017年11月20 日，保藏编号为CGMCCNO.14929；
哈茨木霉（Trichoderma harzianum）JNHC菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2017年11月20日，保藏编号为CGMCC NO.14638；
所制成的微生物复合制剂中哈茨木霉菌和枯草芽孢杆菌菌落总数比为（1-3）:（100-300）;
所述助剂包括腐殖质酸、吸附剂、润湿剂、稳定剂和保护剂，各组分的质量百分比如下：
腐殖质酸 6-10%
吸附剂 70-80%
润湿剂 10-15%
稳定剂 3-5%
保护剂 1-2%。
2.根据权利要求1所述的复合微生物制剂，其特征在于，哈茨木霉（Trichoderma harzianum）JNHC菌液与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JNKC001菌液的浓度比为（1-1.5）*108 cfu/ml:（2-3）*109cfu/ml，且体积比为（1-2）:（5-10）。
3.根据权利要求1所述的复合微生物制剂，其特征在于，所述吸附剂为草碳、玉米芯和麦麸中一种或多种；所述润湿剂为萘磺酸盐甲醛缩合物；所述稳定剂为羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇丙烯酸钠、聚甲基丙烯酸钠中一种或多种；保护剂为L-抗坏血酸。
4.一种如权利要求1~3中的任意一项所述的复合微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）原料准备，使用单菌种纯发酵的方法分别制取枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JNKC001菌液和哈茨木霉（Trichoderma harzianum）JNHC菌液；
（2）将制得的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JNKC001菌液和哈茨木霉（Trichoderma harzianum）JNHC菌液进行复配，制得复合制剂的原液；所制成的复合制剂的原液中哈茨木霉菌和枯草芽孢杆菌菌落总数比为（1-3）:（100-300）；
（3）将制得的原液加入助剂制得复合微生物制剂。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，哈茨木霉（Trichoderma harzianum）JNHC菌液与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JNKC001菌液的浓度比为（1-1.5）*108cfu/ml:（2-3）*109cfu/ml，且体积比为（1-2）:（5-10）。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，在制得原液中加入一定质量分数的腐殖质酸、吸附剂、润湿剂、稳定剂和保护剂，制得复合微生物制剂。
7.一种如权利要求1~3中的任意一项所述的复合微生物制剂在防治柑橘土传病害方面的应用。
8.一种如权利要求1~3中的任意一项所述的复合微生物制剂在柑橘促生、促长方面的应用。
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