CN112940994B - 一种枯草芽孢杆菌、培养方法及应用 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌、培养方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001、培养方法及其应用，属于微生物技术领域。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001，包括:保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2017年11月20日，保藏编号为CGMCC NO.14929。本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001对柑橘炭疽病有良好防效；对柑橘促生、促产效果良好；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001培养条件简单，培养周期短，易于工业化生产及保存，具有良好的开发应用前景。

Description

一种枯草芽孢杆菌、培养方法及应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001的培养方法及应用。
背景技术
柑橘在我国南方种植面积较大，是南方主要种植的水果之一。其中，沙糖桔作为柑橘优势品种之一，其易剥皮、果汁多、无核、口感好，并且具有清肠、健脾、润肺、化痰等诸多功效而深受消费者的喜爱。不但销售于全国各省市，而且出口世界各地，市场广阔。
炭疽病是柑橘最常见的病害，它具有危害广和危害时间长的特点，主要危害叶片、枝条、花、果实和果柄，常造成蜜橘和橙类等柑橘品种大量落叶、枝条枯死、大量落花、落果和果实腐烂。在条件适宜的地区，可常年危害柑橘。
近几年有些田园沙糖桔叶片感染炭疽病，造成叶片黄化问题较为严重，沙糖桔品质、产量下降，对于这一问题，大部分是通过农事操作进行防治。对于沙糖桔病害的防控也是局限于使用农药和田间管理，使用农药后残留问题及成本都比较高，有部分使用有益微生物进行防控，也是局限于沙糖桔采摘后对果实的优化贮藏，很少有使用有益微生物对沙糖桔果树进行处理。
发明内容
为了解决上述农业生产存在的技术问题及现有技术的不足，本发明提供了一种对柑橘炭疽病有良好防效的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001。
为达此目的，本发明采用以下技术方案。
在第一方面，本发明提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2017年11月20日，保藏编号为CGMCC NO.14929。
在第二方面，提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001的培养方法，包括如下步骤：
(1)取活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001，接种于种子培养基，在温度为28～33℃、转速为180～240r/min的条件下，培养10～12h，制得液体种子；
(2)取步骤(1)制得的液体种子，按体积百分比2％的比例接种于发酵培养基，在温度为28～33℃、转速为180～240r/min的条件下，培养28～40h，制得发酵菌液。
优选的，在步骤(1)前还包括将所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001进行活化的步骤：
取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001，斜面转接至培养基上进行活化；其中，活化温度为28～33℃、培养时间为12～16h。
优选的，活化培养基和步骤(1)中种子培养基组分如下：蛋白胨7g,NaCl5g,牛肉膏3g,琼脂20g,H2O 1000mL,pH 7。
优选的，步骤(2)中发酵培养基中各组分的含量以质量百分比表示如下：葡萄糖0.3％～2％，玉米粉1％～5％，豆粕粉1％～5％，磷酸氢二钠0.1‰～0.5‰，磷酸二氢钠0.5‰～5‰,pH6.5～7.5。
在第三方面，提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001制备的发酵菌液。
优选的，发酵菌液中有效活菌数≥2×109cfu/ml。
在第四方面，提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001制备的发酵菌液在防治柑橘炭疽病中的应用。
优选的，将有效活菌数≥2×109cfu/ml的原菌液稀释15～25倍对沙糖桔树的叶片进行喷施，施用量为20-80mL/株。
本发明的有益效果如下：
本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001对柑橘炭疽病有良好防效。
本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001对柑橘促生、促产效果显著。
本发明通过正交实验，优化枯草芽孢杆菌的发酵条件，最终确定在菌液接种量2％、发酵温度30℃的条件下，发酵时间34h，活菌数最多，有效活菌数≥2×109cfu/ml，芽孢率达到99％。
本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001培养条件简单，培养周期短，易于工业化生产及保存，具有良好的开发应用前景。
保藏信息
本发明分离鉴定的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001，己于2017年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.14929。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001显微镜下的示意图；
图2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001在培养基中的菌落特征示意图；
图3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001发酵菌液的田间实验图片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
实施例1株枯草芽孢杆菌的来源及筛选
(1)根际细菌的分离纯化
土样为应用“三点采样法”采集自广西壮族自治区柳州市柳江县洛满镇社冲乡无忧村的沙糖桔根际土，按照土壤微生物常规平板稀释法进行分离。称取根际土样品10g左右，放入装有100mL无菌水的玻璃容器中振荡30min，使其中的土壤颗粒分散均匀，静置5min后，取土壤悬液的上清液部分进行10倍梯度稀释，依次稀释至10-3、10-4、10-5，将稀释液各取0.1mL涂布至牛肉膏蛋白胨培养基平板(蛋白胨7g，NaCl 5g，牛肉膏3g，琼脂20g，H2O 1L，pH7)，所有平板置于恒温培养箱中30℃培养24h，待平板表面长出菌落后，对菌落进行多次划线分离，通过菌落形态观察结合镜检结果获得纯菌株，于4℃保存备用。
(2)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001的筛选
取新鲜的感染炭疽病的沙糖桔叶片10g研磨成糊状，加入到已灭菌的装有90ml无菌水的锥形瓶中，180r/min，充分振荡30min，取上清液。将土壤中筛选到的各菌株液体与炭疽病汁液等体积混合15min，以炭疽病汁液为阳性对照，采用局部枯斑法接种，选择长势一致的中部叶片，采用常规摩擦接种法，左边为处理，右边为对照，每个处理5片叶子，重复3次，做好标记，观察记录叶部发病情况。将发病率最少的菌株选为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JNKC001。
实施例2枯草芽孢杆菌的培养方法
(1)取活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001，接种于种子培养基，在温度为28～32℃、转速为180～240r/min的条件下，培养10～12h，制得液体种子；
(2)取步骤(1)制得的液体种子，按体积百分比2％的比例接种于发酵培养基，在温度为28～32℃、转速为180～240r/min的条件下，培养28～40h，制得发酵菌液。
在步骤(1)前还包括将所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001进行活化的步骤：
取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001，斜面转接至培养基上进行活化；
其中，活化温度为28～32℃、培养时间为12～16h。
活化培养基组分如下：
蛋白胨7g，NaCl 5g，牛肉膏3g，琼脂20g，H2O 1000mL，PH 7。
步骤(1)中和步骤(2)中发酵培养基中各组分的含量以质量百分比表示如下：
葡萄糖0.3％～2％，玉米粉1％～5％，豆粕粉1％～5％，磷酸氢二钠0.1‰～0.5‰，磷酸二氢钠0.5‰～5‰，pH 6.5～7.5。
表1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001的活化及培养条件
Figure BDA0003038495480000051
本发明通过正交实验，优化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001的活化条件，最终确定活化温度为30℃，活化时间为14h的活化效果最好。
本发明通过正交实验，优化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001的发酵条件，最终确定在菌液接种量2％、发酵温度30℃的条件下，转数210r/min，种子液培养时间11h，发酵菌液培养时间34h，活菌数最多，有效活菌数达到3.00×109cfu/ml，芽孢率达到99％。
实验例枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001制备的发酵菌液应用于沙糖桔
本试验共设2个处理，每个处理进行3次重复，每个重复随机选取15株沙糖桔，共设6个小区，各小区随机排列，总计90株沙糖桔。
处理1(对照组)：使用清水对沙糖桔叶片进行喷施50mL/棵/次，间隔20d喷施一次。
处理2(实验组)：使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001菌液稀释20倍对沙糖桔叶片进行喷施，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001菌液用量为50mL/棵/次，间隔20d喷施一次。
1、沙糖桔叶片中叶绿素含量
每个小区随机选取5株沙糖桔，每株分成上、中、下三个部位，每个部位随机摘取5片树叶，使用手持式叶绿素计(KONICA MINOLTA SPAD—502PIus)对每片树叶的3个不同位置进行测定，然后将测定结果求平均值，作为该片树叶的SPAD值，最后将全部摘取树叶的SPAD值求平均值，作为该棵沙糖桔树叶片中叶绿素含量。
表2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001对沙糖桔叶片中叶绿素含量的影响
Figure BDA0003038495480000071
[注]不同小写字母表示差异达显著水平(P＜0.05)，下同。
使用清水处理后的3个重复之间在叶绿素含量上差异不显著，使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001处理后的3个重复之间在叶绿素含量上差异也不显著；清水处理后叶片平均叶绿素含量为61.07SPAD，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001处理后叶片平均叶绿素含量为68.75SPAD，比清水处理叶绿素含量提高12.58个百分点；清水和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001处理后的叶片叶绿素含量对比通过显著性分析，差异达显著水平。
2、沙糖桔炭疽病发病率及防效
每个小区随机选取5株沙糖桔，每株沙糖桔分成上、中、下三个部位，每个部位随机观察30片树叶，记录具有炭疽病病斑的树叶叶片数，统计叶片发病率，并按沙糖桔炭疽病病斑所占叶面积进行分级，统计分析枯草芽孢杆菌对沙糖桔炭疽病的防治效果。
沙糖桔炭疽病分级标准：
0级：无病；
1级：叶片有少量病斑，病斑面积占叶面积约1/16；
2级：叶片有较多病斑，病斑面积占叶面积约1/8；
3级：病斑面积占叶面积约1/4；
4级：病斑面积占叶面积约1/2；
5级：病斑面积占叶面积约3/4。
发病率(％)＝病叶数/调查总叶数×100
防治效果(％)＝(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数×100
病情指数(％)＝∑(病级叶数×该病级值)/(调查总叶数×最高级值)×100
表3枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001对沙糖桔炭疽病发病率的影响及防效
Figure BDA0003038495480000081
使用清水处理后的3个重复之间在沙糖桔炭疽病发病率上差异不显著，使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001处理后的3个重复之间在沙糖桔炭疽病发病率上差异也不显著；清水处理后的沙糖桔炭疽病发病率为9.11％，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JNKC001处理后的沙糖桔炭疽病发病率为1.56％，比清水处理发病率降低7.55％；清水和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001处理后对沙糖桔炭疽病发病率对比进行显著性分析，差异达显著性水平；清水处理后的沙糖桔炭疽病病情指数为5.47％，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001处理后的沙糖桔炭疽病病情指数为1.07％，通过计算分析，该株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001对沙糖桔炭疽病防治效果达80.44％。
3、沙糖桔果汁中可溶性固形物的含量
沙糖桔成熟后，在每个小区随机选取5个果实，榨汁，使用糖度分析仪(ATAGO PAL-1)测沙糖桔果汁中的可溶性固形物含量。
表4枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001对沙糖桔果汁中可溶性固形物的影响
Figure BDA0003038495480000091
清水或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001处理后的沙糖桔，对果汁中可溶性固形物进行的测定，两处理之间差异达显著性水平；清水处理后的沙糖桔中可溶性固形物的含量为12.53％，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001处理后的沙糖桔中可溶性固形物的含量为14.03％，比清水处理提高了1.50％。
4、沙糖桔单株产量
沙糖桔成熟后，在每个小区随机选取5株，将每株沙糖桔上收获到的所有果实进行称重、记录。
表5枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001对沙糖桔单株产量的影响
Figure BDA0003038495480000101
使用清水处理后的3个重复之间在沙糖桔单株产量上差异不显著，使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001处理后的3个重复之间在沙糖桔单株产量上差异也不显著；清水处理后的沙糖桔平均单株产量为51.31kg，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001处理后的沙糖桔平均单株产量为59.17kg，比清水处理提高了15.32％；清水和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001处理后对沙糖单株产量对比进行显著性分析，差异达显著性水平。
通过上述实验例可以看出：经过枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001制备的发酵菌液处理的沙糖桔叶片叶绿素含量显著提高，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001对沙糖桔炭疽病防治效果达80.44％，经过枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001制备的发酵菌液处理的沙糖桔单株产量显著提高。因此，该株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001可有效提高沙糖桔叶片中叶绿素的含量，对沙糖桔黄化现象具有显著的改良作用；有效防控沙糖桔炭疽病发生，促进植株健康生长；提高沙糖桔中可溶性固形物的含量，食用时口感更加甜美，商品性提高；并且对沙糖桔有良好的促生、促产效果，可使沙糖桔减少落花、落果的现象，提高产量，增加果农收益。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001菌株在柑橘促生、促产方面的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2017年11月20日，保藏编号为CGMCC NO.14929。
2.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001在柑橘促生、促产方面的应用，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001的培养方法包括如下步骤：
(1)取活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001菌株，接种于种子培养基，在温度为28～33℃、转速为180～240r/min的条件下，培养10～12h，制得液体种子；
(2)取步骤(1)制得的液体种子，按体积百分比2％的比例接种于发酵培养基，在温度为28～33℃、转速为180～240r/min的条件下，培养28～40h，制得发酵菌液。
3.如权利要求2所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001在柑橘促生、促产方面的应用，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001的培养方法,在步骤(1)前还包括将所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001菌株进行活化的步骤：
取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001菌株，斜面转接至培养基上进行活化；
其中，活化温度为28～33℃、培养时间为12～16h。
4.如权利要求3所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001在柑橘促生、促产方面的应用，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001的培养方法,活化培养基组分如下：
蛋白胨7g，NaCl 5g，牛肉膏3g，琼脂20g，H2O 1000mL，pH 7。
5.如权利要求2所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001在柑橘促生、促产方面的应用，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001的培养方法,所述步骤(1)中和步骤(2)中发酵培养基中各组分的含量以质量百分比表示如下：
葡萄糖0.3％～2％，玉米粉1％～5％，豆粕粉1％～5％，磷酸氢二钠0.1‰～0.5‰，磷酸二氢钠0.5‰～5‰，pH 6.5～7.5。
6.一种利用权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001制备的发酵菌液在柑橘促生、促产方面的应用。
7.如权利要求6所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001制备的发酵菌液在柑橘促生、促产方面的应用，其特征在于，所述发酵菌液中有效活菌数≥2×109cfu/ml。
8.一种如权利要求6所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001制备的发酵菌液在防治柑橘炭疽病害中的应用。
9.如权利要求8所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNKC001制备的发酵菌液在防治柑橘炭疽病中的应用，其特征在于，
将所述有效活菌数≥2×109cfu/ml的原菌液稀释15～25倍对沙糖桔树的叶片进行喷施，施用量为20-80mL/株。
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