CN104195071A - 一种枯草芽孢杆菌b33及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌B33，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）B33，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.7540，保藏日期为2013年04月28日。所述的枯草芽孢杆菌主要用于小麦霉病的生物防治。本发明枯草芽孢杆菌B33对小麦赤霉病菌和铁皮石斛根腐病，草莓灰霉病等多种病原真菌具有很好的抑制作用，该拮抗细菌对其他植物病害也有很好的防治效果；具有繁殖速度快；能够人工培养，易于操作，便于生产应用；抗逆能力强等优点，尤其是对真菌引起的小麦赤霉病的防治具有重要意义；培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物保护领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33及其在防治小麦霉病中的应用。
背景技术
近年来，随着公众对食品和环境中化学农药安全性的普遍关注，以及一些危险性化学农药的禁用，促使人们寻求安全有效的植物病害控制新途径，利用有益微生物防治植物病害日趋受到重视。它是向被打破了的植物自然生态系中引入对植物有益的外源拮抗菌、或通过调节环境促使自然的有益微生物群体增长，并表现出生防活性，通过微生物之间的相互作用达到防病目的。目前，植物病害的生防已成为各国研究重点。
自然界潜在的微生物资源种类丰富，在微生物农药的产品开发方面有明显优势，因此世界各国都投入大量的人力和财力，研究、开发具有自主知识产权的新型微生物农药，并以此带动其他高科技产业的全面发展。我国也把微生物农药的研制和开发列为国家重点科技攻关和高新技术发展计划，江苏省政府也把微生物农药创制作为生物农业的一个重要组成部分。
生物农药(biopesticides)，按照Copping和Menn的定义包含了活体微生物(真菌、细菌和病毒)，昆虫植病线虫，植物源农药，微生物农药，微生物次生代谢物(抗生素)等，用于防治各种昆虫和病害；生物农药(特别是微生物农药)具有独特的优点是对人类健康威胁小，对环境较安全，这正是全社会最关心的问题之一。因此，进入21世纪以来，各国政府和植物保护工作者更加重视生物农药的开发和应用，已成为研究热点。
微生物农药的特性赋予了农业可持续发展战略，为保护农业生态环境，保障食品安全提供物质基础和技术支撑；同时微生物农药产业也是未来经济中具有发展潜力的新增长点之一。研究微生物农药产业发展对于政府部门科学制定促进微生物农药产业发展的政策体系，实现农药产业结构调整，促进循环经济和可持续社会发展战略，保障我省经济建设和农业生态环境的协调发展，以及建设我省农产品安全体系等都将具有十分重要的理论意义和实践意义。
小麦赤霉病是长江流域小麦穗部主要病害，有的年份可造成小麦的严重减产。小麦(Triticum aestivum)是一种主要的粮食和饲料作物，草本科植物，也是世界上总产量占 第二位的粮食(仅次于玉米)。在小麦种植区，小麦赤霉病，小麦锈病和小麦全蚀病是阻碍小麦丰产的瓶颈。据报道，我国小麦赤霉病病原菌有多种，根据致病性强弱分为强致病性种类为，小麦赤霉病禾谷镰孢(Fusarium graminearum Schw.)分布最广，占94.5％；硫色镰乃菌(F.Sulphureum Schlecht)占0.45％；黄色镰刀菌[F.culmorum(W.G.Sm.)Saec.]占0.65％；弯角镰刀菌(F.camptoceras Wr.Rg.)占0.12％；木贼镰刀菌紧密变种[F.equiseti(Cda.)Saec.var.compactum(Wr.)Joffe]占0.04％。中等致病的有燕麦镰刀菌谷类变种[F.avenaceum(Cda.ex Fr.)var.graminum(Cda.)Saec.]占0.12％；燕麦刀菌草类变种[F.avenaceum var.herbarum(Cda.)Saec]占0.61％；三线镰刀菌[F.tricinctum(Cda.)Saec.]占0.08％；锐顶镰刀菌(F.acuminatum El et Ev.)占0.33％；雪腐镰刀菌[F.nivale(Fr.)Ces.]占0.41％。而在江苏句容地区是亚细亚镰孢菌(Fusarium asiaticum)，本发明专利的试验是以该菌为测试菌株。
从保护生态环境和食品安全的角度出发，小麦生产需要有低毒、污染少，对人体安全的微生物制剂来控制小麦赤霉病害，已达到安全食用的目的。也符合生物农业发展和政府、社会与生物农药产业的发展。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明的第一目的在于提供一种对小麦赤霉菌具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌。
本发明的第二目的在于提供一种枯草芽孢杆菌在防治小麦赤霉病中的应用。
技术方案：为了解决上述第一目的，本发明所采用的技术方案为：一种枯草芽孢杆菌B33，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，其保藏编号为：CGMCCNo.7540，保藏日期为2013年04月28日。
为了解决上述的第二目的，本发明所采用的技术方案为：所述的枯草芽孢杆菌在防治小麦赤霉病中的应用。
所述的枯草芽孢杆菌B33在抑制小麦赤霉病菌生长中的应用。
具体应用为：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33接种于液体发酵培养基中，在28℃-33℃下发酵培养48-72小时，得到的发酵液作为防治小麦赤霉病菌的菌剂。
本发明中所述发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏2-5g，蛋白胨5-10g， 氯化钠4-5g，pH6.5-7.5。
所述的枯草芽孢杆菌B33在抑制草莓根腐病菌生长中的应用。
所述的枯草芽孢杆菌B33在抑制草莓灰霉菌生长中的应用。
所述的枯草芽孢杆菌B33在抑制胶孢炭疽菌生长中的应用。
所述的枯草芽孢杆菌B33在抑制铁皮石斛根腐病菌生长中的应用
本发明中所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33的生理活性特征如下：
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33在牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落较大，乳白色，直径一般4-6mm，表面隆起，干燥，有皱褶，边缘较规则，菌体杆状，两端钝圆，具周生鞭毛，大小为1.93-2.61×0.62-1.12μm，平均2.2×0.83μm；芽孢两端生，椭圆形，大小为0.89-1.01×0.41-0.65μm，平均0.83×0.51μm。
革兰氏染色表现为阳性；酪蛋白水解、淀粉水解、明胶液化为阳性，V.P反应可变，吲哚反应阴性；糖类产酸发酵。
解淀粉芽孢杆菌的16SrDNA序列如SEQ ID No.1所示。将所测16SrDNA序列通过BLAST比对，鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：
(1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33对多种植物病原菌具有抑制作用，在拮抗细菌对植物病害生物防治中起到非常重要的作用，例如种类和数量众多；对病原菌的作用方式多样化；繁殖速度快；能够人工培养，易于操作，便于生产应用；抗逆能力强等优点，尤其是对真菌引起的小麦赤霉病的防治具有重要意义；也是保证粮食安全重要手段。
(2)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1a枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33的形态图；
图1b为本发明中枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B33芽孢形态图(在一端或两端折光体)；
图2a为本发明中枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B33对小麦赤霉病菌(Fusarium asiaticum)的抑制作用；
图2b为本发明中枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B33对草莓根腐病(Fusarium oxsporum)的抑制作用；
图2c为本发明中枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B33对草莓灰霉菌(Botrytis cinerea)的抑制作用；
图2d为本发明中枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B33对胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporiodes)的抑制作用；
图2e为本发明中枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B33铁皮石斛根腐病菌(Fusarium proliferatum)的抑制作用；
图3a为本发明中枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B33的防治试验，在4月20日再刚开花时间进行处理，同时设对照处理)；
图3b为本发明中枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B33菌液处理小麦，发病率降低约70％。
具体实施方式
下面结合实验例详细阐述本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33的应用。
实验例1：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33对小麦赤霉病菌(Fusarium asiaticum)、草莓根腐病(Fusarium oxsporum)、草莓灰霉菌(Botrytis cinerea)、草莓炭疽菌(Colletotrichum gloeosporiodes)、铁皮石斛根腐病菌(Fusarium proliferatum)的平板抑菌作用。
将用LB斜面活化的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33菌株划线接种于PDA平板一侧，再将小麦赤霉病菌、草莓根腐病、草莓灰霉菌、草莓炭疽菌和铁皮石斛根腐病菌PDA平板培养物用直径5mm的打孔器打取同质同量的菌块，接种于平板另一侧。30±1℃培养10天观察抑菌能力，并记录其宽度(如表1)，实验效果如图2a至图2e所示。试验结果表明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33对5种病原菌均有较好的拮抗作用，以占据培养皿的直径判断拟制效果，用无菌的PDA圆块作为对照。
表1 B33对小麦赤霉菌和其他4种病原菌10天的抑制作用
实验例2：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33代谢产物对对小麦赤霉病菌(Fusarium asiaticum)、草莓根腐病(Fusarium oxsporum)、草莓灰霉菌(Botrytis cinerea)、草莓炭疽菌(Colletotrichum gloeosporiodes)、铁皮石斛根腐病菌(Fusarium proliferatum) 的平板抑菌作用。
培养3天的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33的发酵液用细菌滤器过滤，细菌滤器的滤膜孔径为0.25μm；将5种植物病原真菌的PDA平板培养物用直径5mm的打孔器打取同质同量的菌块，接种于PDA平板一侧；再将PDA平板另一侧用直径5mm的打孔器打取同质同量的圆块，并将圆块取出；再将过滤后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33的100μL无菌滤液接于PDA平板另一侧空洞中，30±1℃培养10天，观察B33的抑菌效果。以不接生防菌为对照，待对照菌丝长满平板后，观察拮抗活性(见表2)。试验结果表明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33代谢产物对5种病原菌均有强拮抗作用。
表2 B33对小麦赤霉病菌和其他4种病原菌10天的抑制作用
实验例3：验证枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33对小麦赤霉菌是否有抑制作用的试验。
1、实验设备
培养箱、超净工作台、培英牌DHZ-DA TCYQ恒温振荡器。
2、实验原理
在小麦抽穗后，开花前，将培养3天的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B33的培养液取出，加水稀释成1.9亿菌体/mL菌液，用喷雾器喷洒小麦；最好在下午4点钟以后喷施，利用夜间露水和凉爽的天气，让B33细菌能在小麦上定殖，产生代谢产物，从而抑制小麦赤霉病菌的生长；如果是在晴天上午喷施，因天气干燥和太阳曝晒会使B33菌体不能在小麦上定殖，甚至会被太阳晒死，失去活性。
3、实验方法：
1)枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B33菌液的培养：将枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B33接种到含有300mL的LB培养基的三角瓶中，用2mm长的灭菌牙签蘸取细菌放进三角烧瓶内培养，然后放在培英牌DHZ-DA TCYQ恒温振荡器，120转/分钟，30±1℃培养72小时。
2)试验麦地准备：已选择供防治试验的麦地约为1200m2，日常管理同其他麦地。
3)把培养好的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B33细菌原液配制成用于大田喷洒的菌液，细菌原液:水比例为1:10。对照用清水喷洒。
4)拮抗实验：将步骤2)与步骤3)中喷洒好的小麦试验地，每2周观察一次，4周进行观察结果如图3a至图3b所示，图3a示开花B33处理小麦，图3b示喷洒处理4周的结果，中间仍有感病麦穗。
4、实验结果
1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33对小麦赤霉病菌的作用：如图2a所示；
2)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33对草莓根腐病作用：如图2b所示；
3)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33对草莓灰霉菌的作用：如图2c所示；
4)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33对胶孢炭疽菌的作用：如图2d所示；
5)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33对铁皮石斛根腐病菌的作用；如图2e所示；
从上面的图片可以看出，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33对小麦赤霉病菌(Fusarium asiaticum)、草莓根腐病(Fusarium oxsporum)、草莓灰霉菌(Botrytis cinerea)、草莓炭疽菌(Colletotrichum gloeosporiodes)、铁皮石斛根腐病菌(Fusarium proliferatum)的生长有很好的抑制作用。
下面是本发明的具体实施例：
实施例1：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B33菌剂的制备方法：将枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B33接种于发酵培养基中，pH6.5，500mL三角瓶中装液量为300mL，28℃-33℃，摇床转速120转/分，48小时，得到的发酵液即为防治草莓灰霉菌的菌剂。
其中发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏2g，蛋白胨5g，氯化钠5g，pH6.5。
实施例2：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B33菌剂的制备方法：将枯草芽孢杆菌B33接种于发酵培养基中，pH7.5，500mL三角瓶中装液量为300mL，28℃-33℃，摇床转速160转/分，72小时，得到的发酵液即为防治草莓灰霉菌的菌剂。
其中发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，pH7.5。
实施例3：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B33菌剂的制备方法：将枯草芽孢杆菌B33接种于发酵培养基中，pH 7，500mL三角瓶中装液量为300ml，28℃-33℃，摇床转速 150转/分，55小时，得到的发酵液即为防治草莓灰霉菌的菌剂。
其中发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏3g，蛋白胨8g，氯化钠5g，pH 7。
Claims (9)
1.一种枯草芽孢杆菌B33，其特征在于，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.7540，保藏日期为2013年04月28日。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌B33在防治小麦赤霉病中的应用。
3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌B33在抑制小麦赤霉病菌生长中的应用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)B33接种于发酵培养基中，在28℃-33℃下发酵培养48-72小时，得到的发酵液作为防治小麦赤霉病菌的菌剂。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：1000 mL蒸馏水，牛肉膏2-5g，蛋白胨5-10g，氯化钠4-5g，pH6.5-7.5。
6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌B33在抑制草莓根腐病菌生长中的应用。
7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌B33在抑制草莓灰霉菌生长中的应用。
8.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌B33在抑制胶孢炭疽菌生长中的应用。
9.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌B33在抑制铁皮石斛根腐病菌生长中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20141210 |