CN102703360B - 一种解淀粉芽孢杆菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.6157，保藏日期为2012年05月25日。本发明还公开了该解淀粉芽孢杆菌在防治杨树溃疡病以及抑制微生物生长中的应用。该菌种对杨树、草莓上的多种病原真菌具有抑制作用，该拮抗细菌对其他植物病害也有很好的防治效果；该菌种繁殖速度快，能够人工培养，易于操作，抗逆能力强，尤其是对真菌引起的杨树溃疡病的防治具有重要意义；该菌种培养条件简单、容易保存，适于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物病害防治领域，尤其涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其在防治杨树溃疡病中的应用。
背景技术
杨树是世界重要的速生用材树种之一，也是我国速生丰产主栽树种，具有适应性广、生长速度快等特点，受到杨树栽培者欢迎。目前，我国杨树林面积已经超过800万ha，蓄积量达到4.29亿m3，居世界首位，超过其他国家的杨树人工林面积的总和，其中杨树用材林面积为309万ha，占全国杨树人工林面积的40%左右，在华东地区杨木加工业已成为当地的经济支柱。但是，杨树在生长发育的过程中，会受到多种病原微生物的危害，特别是在苗木或当年栽植幼树上的溃疡病发生严重，2010年在山东省临沂市和江苏省苏北某些地区的杨树造林成活率在10%以下，造成了重大经济和生态损失。对杨树溃疡病的传统防治方法是化学防法防治，它会造成环境污染和生态破坏，利用自然界具有拮抗能力的生防细菌防治杨树溃疡病已成为本发明的重点内容，也是今后研究的方向。
自然界存在着丰富的潜在资源微生物种类，在微生物农药的产品开发方面有明显优势，因此世界各国都投入大量的人力和财力，研究、开发具有自主知识产权的新型微生物农药，并以此带动其他高科技产业的全面发展。我国也把微生物农药的研制和开发列为国家重点科技攻关和高新技术发展计划。
生物农药(biopesticides)包含了活体微生物（真菌、细菌和病毒），昆虫植病线虫，植物源农药，微生物农药，微生物次生代谢物（抗生素）等，用于防治各种昆虫和病害，生物农药（特别是微生物农药）具有独特的优点是对人类健康威胁小，对环境安全，这正是全社会最关心的问题之一。因此，进入21世纪以来，各国政府和民众更加重视生物农药的开发和应用，已成为研究热点。
微生物农药的特性赋予了林业可持续发展战略，为保护林业生态环境安全提供物质基础和技术支撑；同时微生物农药产业也是未来经济中具有发展潜力的新增长点之一。研究微生物农药产业发展对于政府部门科学制定促进微生物农药产业发展的政策体系，实现农药产业结构调整，促进循环经济和可持续社会发展战略，保障经济建设和林业生态环境的协调发展，以及建设林产品安全体系等都将具有十分重要的理论意义和实践意义。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的在于提供一种对杨树溃疡病菌具有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌。
本发明的第二目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌在防治杨树溃疡病中的应用。
本发明的第三目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌在抑制微生物生长中的应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种解淀粉芽孢杆菌，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，其保藏编号为：CGMCC No.6157，保藏日期为2012年05月25日。
解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208的生理活性特征如下：
所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208在牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落较大，乳白色，直径一般4-6mm，表面隆起，干燥，有皱褶，边缘较规则，菌体杆状，两端钝圆，具周生鞭毛，大小为1.58-4.15×0.61-0.72μm，平均2.75×0.67μm；芽孢两端生，椭圆形，大小为0.57-1.01×0.41-0.62μm，平均0.82×0.510μm。
革兰氏染色表现为阳性；酪蛋白水解、淀粉水解、明胶液化为阳性，V.P反应可变，吲哚反应阴性；糖类产酸发酵。
解淀粉芽孢杆菌的16SrDNA序列如SEQ ID No.1所示。将所测16SrDNA序列通过BLAST比对，鉴定其为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208是在防治杨树溃疡病中的应用。
所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208是在抑制聚生小穴壳(Dothiorella gregaria Sacc.)生长中的应用。
所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208是在抑制杨树溃疡病菌可可球二孢[Lasiodiplodia theobromae(Pat.)Griffon&Maubl.]生长中的应用。
所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208是在抑制可可球二孢[Lasiodiplodia theobromae(Pat.)Griffon&Maubl.]生长中的应用。
所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208是在抑制不高双孢菌[Apiocarpella macrospore(Speg.)H.&P.Syd.]生长中的应用。
所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208是在抑制草莓灰霉菌（Botrytis cinera Pers.ex Fr.）生长中的应用。
所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208是在抑制草莓炭疽菌（Colletotrichum fragariae A.N.Brooks）生长中的应用。
其中，所述聚生小穴壳、可可球二孢、拟茎点霉和不高双孢菌均能引起杨树溃疡病；而草莓灰霉菌能引起草莓灰霉病，草莓炭疽菌能引起草莓炭疽病。
具体应用为：将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens ）B208接种于发酵培养基中，在28℃-35℃下发酵培养48-72小时，得到的发酵液作为应用菌剂。
本发明中所述发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏2-5g，蛋白胨5-10g，氯化钠4-5g，pH6.5-7.5。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：
（1）解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208对多种植物病原菌具有抑制作用，在拮抗细菌对植物病害生物防治中起到非常重要的作用，例如种类和数量众多；对病原菌的作用方式多样化；繁殖速度快；能够人工培养，易于操作，便于生产应用；抗逆能力强等优点，尤其是对真菌引起的杨树溃疡病的防治具有重要意义。
（2）解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208培养条件简单、容易保存，适于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1a为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208菌落图。
图1b解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208芽孢形态图。
图2a解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208对聚生小穴壳(Dothiorellagregaria Sacc.)的抑制作用。
图2b解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208对可可球二孢[Lasiodiplodiatheobromae(Pat.)Griffon&Maubl.]的抑制作用。
图2c解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208对拟茎点霉(Phomopsis sp.)的抑制作用。
图2d解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208对不高双孢菌[Apiocarpellamacrospore(Speg.)H.&P.Syd.]的抑制作用。
图2e解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208对草莓灰霉菌（Botrytis cineraPers.ex Fr）的抑制作用。
图2f解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208对草莓炭疽菌（Colletotrichum fragariae A.N.Brooks）的抑制作用。
图3a解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208对杨树溃疡病的防治作用。
图3b未用解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208菌液处理过的杨树溃疡病斑。
具体实施方式
下面结合实验例详细阐述本发明解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208的应用。
实验例1：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208对聚生小穴壳(Dothiorella gregaria Sacc.)、可可球二孢[Lasiodiplodia theobromae(Pat.)Griffon&Maubl.]、拟茎点霉(Phomopsis sp.)、不高双孢菌[Apiocarpella macrospore(Speg.)H.&P.Syd.]、草莓灰霉菌（Botrytis cinera Pers.ex Fr.）和草莓炭疽菌（Colletotrichum fragariaeA.N.Brooks）的平板抑菌作用。
将用LB斜面培养基活化的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208菌株划线接种于直径9cm玻璃培养皿中的PDA平板一侧，再将杨树溃疡病菌聚生小穴壳、可可球二孢、拟茎点霉、不高双孢菌、草莓灰霉菌和灰霉菌PDA平板培养物用直径5mm的打孔器打取同质同量的菌块，接种于平板另一侧。28±1℃培养30天观察抑菌能力，并记录其15天和30天时细菌菌落宽度，见表1，15天时抑菌效果如图2a至图2f所示。试验结果表明，解淀粉芽孢杆菌B208对6种病原菌均有拮抗作用，且解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B208与病原菌相互作用时会产生拮抗带，以占据培养皿的直径判断拟制效果，用无菌的PDA圆块作为对照。
表1B208对6种杨树和草莓病原菌15天和30天的抑制作用
1)解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B208对聚生小穴壳(Dothiorellagregaria Sacc.)的抑制作用，如图2a所示；
2）解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208对可可球二孢[Lasiodiplodiatheobromae (Pat.)Griffon&Maubl.的抑制作用，如图2b所示；
3）解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208对拟茎点霉(Phomopsis sp.)的抑制作用，如图2c所示；
4）解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208对不高双孢菌[Apiocarpellamacrospore(Speg.)H.&P.Syd]的抑制作用，如图2d所示；
5）解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208对草莓灰霉菌Botrytis cineraPers.ex Fr.）的抑制作用，如图2e所示；
6）解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208对草莓炭疽病菌Colletotrichumfragariae A.N.Brooks的抑制作用，如图2f所示。
由附图可知，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208对聚生小穴壳、可可球二孢、拟茎点霉、不高双孢菌、草莓灰霉菌和草莓炭疽病菌的生长均有很好的抑制作用。
实验例2：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208代谢产物对聚生小穴壳(Dothiorella gregaria Sacc.)、可可球二孢[Lasiodiplodia theobromae(Pat.)Griffon&Maubl.、拟茎点霉(Phomopsis sp.)、不高双孢菌[Apiocarpella macrospore(Speg.)H.&P.Syd.]、草莓炭疽菌（Colletotrichum fragariae A.N.Brooks）和草莓灰霉菌（Botrytis cineraPers.ex Fr.）的平板抑菌作用。
培养3天的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208的发酵液用细菌滤器过滤（滤膜孔径为0.25μm）；将6种植物病原真菌的PDA平板培养物用直径5mm的打孔器打取同质同量的菌块，接种于直径9cm玻璃培养皿中的PDA平板一侧；再将PDA平板另一侧用直径5mm的打孔器打取同质同量的圆块，并将圆块取出点；将过滤后的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208的100μL无菌滤液接于PDA平板另一侧空洞中，28℃培养10天，观察。以不接B208发酵菌液为对照，待对照菌丝长满平板后，观察拮抗活性（见表2）。试验结果表明，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208代谢产物对6种病原菌均有强拮抗作用。
表2B208发酵液对6种杨树和草莓病原菌15天和30天的抑制作用
由此可见，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208产生的代谢物质对聚生小穴壳、可可球二孢、拟茎点霉、不高双孢菌、草莓灰霉菌和草莓炭疽病菌的生长均有很好的抑制作用。
实验例3：验证解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208对杨树溃疡病菌(Dothiorella gregaria Sacc.)是否有抑制作用的试验。
1、实验设备：培养箱、摇床、超净工作台；
2、实验原理：
在杨树发生溃疡病的初期，将解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208的培养液涂刷在溃疡病版的表面，解淀粉芽孢杆菌B208通过树皮表面的微小裂缝侵入到溃疡病斑内继续繁殖、生长，产生代谢产物，从而抑制杨树溃疡病菌(Dothiorella gregariaSacc.)的生长。
3、实验方法：
1）解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208菌液的培养：将解淀粉芽孢杆菌B208接种到含有50mL的LB培养基的三角瓶中，120转，35℃培养60小时。
2）B203液体发酵菌剂的喷洒防治：在解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208发酵培养菌液中，加入5倍的水，用喷雾器将菌液喷在有溃疡病的树干上，喷洒时间在好在下午4点钟以后。
3）对照：用无菌水喷洒溃疡病斑作为对照处理。
4）拮抗实验：将步骤2）与步骤3）的防治试验，并观察结果（如图3a至图3b所示）。
4、实验结果
解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208能够很好的防治杨树溃疡病，见图3a及3b。其中，图3a为使用解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B208治疗溃疡病60天后的杨树树干；图3b为未使用解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B208菌液处理溃疡病斑的杨树树干。由此可见，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B208能够很好的防治杨树溃疡病。
下面是本发明的具体实施例：
实施例1：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208菌剂的制备方法：将解淀粉芽孢杆菌B208接种于发酵培养基中，pH6.5，250mL三角瓶中装液量为150mL，28℃-35℃，摇床转速120转/分，48小时，得到的发酵液即为防治杨树溃疡病菌(Dothiorella gregaria Sacc.)的菌剂。
其中发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏2g，蛋白胨5g，氯化钠4g，pH6.5。
实施例2：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208菌剂的制备方法：将解淀粉芽孢杆菌B208接种于发酵培养基中，pH7.5，250mL三角瓶中装液量为150mL，28℃-35℃，摇床转速160转/分，72小时，得到的发酵液即为防治杨树溃疡病菌(Dothiorella gregaria Sacc.)的菌剂。
其中发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，pH7.5。
实施例3：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208菌剂的制备方法：将解淀粉芽孢杆菌B208接种于发酵培养基中，pH7.0，250ml三角瓶中装液量为150ml，28℃-35℃，摇床转速150转/分，55小时，得到的发酵液即为防治杨树溃疡病菌(Dothiorella gregaria Sacc.)的菌剂。
其中发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏3g，蛋白胨8g，氯化钠5g，pH 7.0。
Claims (10)
1.一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B208，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.6157，保藏日期为2012年05月25日。
2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在防治杨树溃疡病中的应用。
3.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在抑制聚生小穴壳(Dothiorella gregaria Sacc.)生长中的应用。
4.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在抑制可可球二孢[Lasiodiplodia theobromae(Pat.)Griffon&Maubl.]生长中的应用。
5.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在抑制拟茎点霉(Phomopsis sp.)生长中的应用。
6.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在抑制不高双孢菌[Apiocarpella macrospore(Speg.)H.&P.Syd.]生长中的应用。
7.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在抑制草莓灰霉菌（Botrytis cinera Pers.ex Fr.）生长中的应用。
8.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在抑制草莓炭疽菌（Colletotrichum fragariae A.N.Brooks）生长中的应用。
9.根据权利要求2至8任一项所述的应用，其特征在于：将解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）B208接种于发酵培养基中，在28℃-35℃下发酵48-72小时，得到的发酵液作为应用菌剂。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏2-5g，蛋白胨5-10g，氯化钠4-5g，pH6.5-7.5。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20131030 Termination date: 20190613 |