CN104988079B - 一种哈茨木霉jsnl1404及其应用 - Google Patents

一种哈茨木霉jsnl1404及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种哈茨木霉JSNL1404，其分类命名为哈茨木霉（Trichoderma harzianum），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年6月9日，保藏号为CGMCC No.9281。本发明还公开了上述菌株的应用。本发明的哈茨木霉JSNL1404主要用于防治铁皮石斛白绢病菌，也对多种植物病原菌具有抑制作用，在拮抗真菌对植物病害生物防治中起到非常重要的作用，例如种类和数量众多；对病原菌的作用方式多样化；繁殖速度快；能够人工培养，易于操作，便于生产应用；抗逆能力强等优点，尤其是对真菌引起的铁皮石斛白绢病的防治效果佳。

Description

一种哈茨木霉JSNL1404及其应用
技术领域
本发明涉及植物保护领域，具体涉及一种哈茨木霉JSNL1404及其应用。
背景技术
木霉菌是广泛存在于自然界中的一种真菌，哈茨木霉菌是木霉菌中应用最广泛的一个菌种。木霉菌(Trichoderma spp.)属于半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科。广泛存在于土壤、根围、叶围、种子等生态环境中，也是一种优良的生防菌。1932年，Weindling发现木素木霉(Trichoderma lignorum)可以寄生于多种植物病原真菌，建议将该菌用于土传植物病害的生物防治，木霉菌生防研究工作从此开始。由于木霉菌的广泛适应性、广谱性及多机制性，一直是植病生防学家研究的重点对象。随着生物技术的发展，木霉菌已由单一地从自然界分离筛选，达到有目的地利用生物技术进行改造以获得新型菌株的程度，如原生质体融合技术的引入已成功地研制出商品制剂F-Stop。截止到1997年，国内外已经登记的木霉菌制剂多达11种，其中包括哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)5个，多孢木霉菌(Trichoderma polysporum)1个，绿色木霉菌(Trichoderma viride)2个，其他木霉菌(Trichoderma spp.)3个，多数用于植物土壤传播病害的防治和预防由小核菌(Sclerotiumsp.)，疫霉菌(Phytophthora sp.)，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani),腐霉菌(Pythiumsp.)，镰刀菌(Fusarium sp.)，轮枝霉(Verticillium sp.)等等，效果较佳。木霉防病的作用方式，一是在植物根围生长并形成“保护罩”，以防止根部病原真菌的侵染。二是能分泌酶及抗生素类物质，分解病原真菌的细胞壁。
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是一种药食同源植物，近年来,它在人们心目中的地位越来越高，药材的质量安全问题也引起了各级政府、国家中药材管理部门和种植公司，特别是一些有机认证的公司，对铁皮石斛产品质量、加工食品和环境中化学农药安全性给予普遍关注。一些危险性化学农药的禁用，促使人们寻求安全有效的植物病害控制新途径,利用有益微生物防治植物病害日趋受到重视。它是向被打破了的植物自然生态系中引入对植物有益的外源拮抗菌、或通过调节环境促使自然的有益微生物群体增长，并表现出生防活性，通过微生物之间的相互作用达到防病目的。
自然界潜在的微生物资源种类丰富，在微生物农药的产品开发方面有明显优势，因此世界各国都投入大量的人力和财力，研究、开发具有自主知识产权的新型微生物农药，并以此带动其他高科技产业的全面发展。我国也把微生物农药的研制和开发列为国家重点科技攻关和高新技术发展计划，江苏省政府也把微生物农药创制作为生物农业的一个重要组成部分。
微生物农药的特性赋予了农业可持续发展战略，为保护农业生态环境，保障食品安全提供物质基础和技术支撑；同时微生物农药产业也是未来经济中具有发展潜力的新增长点之一。研究微生物农药产业发展对于政府部门科学制定促进微生物农药产业发展的政策体系，实现农药产业结构调整，促进循环经济和可持续社会发展战略，保障我省经济建设和农业生态环境的协调发展，以及建设我省农产品安全体系等都将具有十分重要作用。
铁皮石斛属国家二级保护植物，是中药石斛中珍贵品种之一，因表皮呈铁绿色而得名；其主要成分具有独特的保健与药用价值，被道家养生经典著作《道臧》誉为“中华九大仙草之首”。在我国，自然分布于浙江、安徽、福建、湖南、广西、四川和云南等地人迹稀少的，悬崖峭壁背阴处的石缝里，终年饱受云雾雨露滋润，生长期为3-5年，自然产量极少。是一种及其名贵、药食同源的滋阴补品。因其生存的生态条件十分特殊、苛刻，自然繁殖率极低，人间难得一见，兼以饱吸天地日月云雾雨露之精华，有着起死回生的神奇功效，故有“救命仙草”之称。
现代医学和中医药理研究表明，铁皮石斛有效成分主要为石斛碱、石斛多糖、氨基酸等生物活性成分，能显著提高机体免疫功能，具有滋阴清热、耐缺氧、抗疲劳、抗衰老、防治肿瘤、治疗糖尿病和萎缩性胃炎等多重功效，对烟酒、劳累、夜生活、用眼用脑过度人群及声带嘶哑者有恢复作用。
但是，尽十多年来，随着铁皮石斛人工栽培面积不断扩大，病害发生普遍而严重，在温暖潮湿的环境条件下，铁皮石斛白绢病(Sclerotium rolfssii)发生较普遍，会造成根部腐烂，叶片、嫩梢枯黄死亡，是一种毁灭性的病害，导致巨大经济损失，为此，开展铁皮石斛白绢病的防治具有现实意义。
从保护生态环境和食品安全的角度出发，铁皮石斛需要有机栽培，研制对人体安全的微生物制剂来控制铁皮石斛病害，已达到安全食用的目的。也符合生物农业发展和政府、社会与生物农药产业的发展。
发明内容
发明目的：本发明的第一个目的是提供种对铁皮石斛白绢病菌具有拮抗作用的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404。
本发明的第二个目的是提供一种哈茨木霉JSNL1404在防治铁皮石斛白绢病菌方面的应用。
本发明的第三个目的是提供一种哈茨木霉JSNL1404菌剂。
本发明的第四个目的是提供了哈茨木霉JSNL1404在防治铁皮石斛根腐病菌、铁皮石斛灰霉菌、草莓根腐病、小麦赤霉病菌或杨树大斑病菌方面的应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种哈茨木霉JSNL1404，其分类命名为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，其保藏编号为：CGMCC No.9281，保藏日期为2014年06月09日。
其中，上述哈茨木霉JSNL1404的最适生长温度为25±1℃。
上述的一种哈茨木霉JSNL1404在防治铁皮石斛白绢病菌方面的应用。
上述的应用，将哈茨木霉JSNL1404接种于液体发酵培养基中，在25℃-35℃下发酵培养48-72小时，得到的发酵液作为防治铁皮石斛白绢病菌的菌剂。
其中，上述液体发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，马铃薯120-200g，蔗糖15-20g，硫酸铵0.5～1.5g，pH4.5-6.8。
一种哈茨木霉JSNL1404菌剂，它是将所述的哈茨木霉JSNL1404发酵而成的发酵液。
上述的哈茨木霉JSNL1404菌剂的制备方法，哈茨木霉JSNL1404接种于发酵培养基中，pH4.5-6.8，500mL三角瓶中装液量为250mL，25℃-30℃，摇床转速120～160转/分，72～120小时，得到的发酵液即为防治铁皮石斛白绢病的原菌液。
其中，上述发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，马铃薯120-200g，蔗糖15-20g，硫酸铵0.5～1.5g，pH4.5-6.8。
上述的一种哈茨木霉JSNL1404在防治铁皮石斛根腐病菌、铁皮石斛灰霉菌、草莓根腐病、小麦赤霉病菌或杨树大斑病菌方面的应用。
上述的哈茨木霉JSNL1404菌剂在防治铁皮石斛白绢病菌、铁皮石斛根腐病菌、铁皮石斛灰霉菌、草莓根腐病菌、小麦赤霉病菌或杨树大斑病菌方面的应用。
有益效果：本发明具有以下优点：
(1)哈茨木霉(Trichoderma harzianum)对多种植物病原菌具有抑制作用，在拮抗细菌对植物病害生物防治中起到非常重要的作用，例如种类和数量众多；对病原菌的作用方式多样化；繁殖速度快；能够人工培养，易于操作，便于生产应用；抗逆能力强等优点，尤其是对真菌引起的铁皮石斛白绢病的防治效果佳。
(2)哈茨木霉(Trichoderma harzianum)培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1a为本发明中哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404的菌落形态图；
图1b为本发明中哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404分生孢子形态图；
图2a为本发明中哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404对铁皮石斛白绢病菌(Sclerotium rolfssii)的抑制作用；
图2b为本发明中哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404对铁皮石斛根腐病菌(Fusarium proliferatum)的抑制作用；
图2c为本发明中哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404对铁皮石斛灰霉菌(Botrytis cinerea)的抑制作用；
图2d为本发明中哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404对草莓根腐病菌(Fusarium oxsporum)的抑制作用；
图2e为本发明中哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404对小麦赤霉病菌(Fusarium gramiearum)的抑制作用；
图2f为本发明中哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404对杨树大斑病菌(Dothichiza populea)的抑制作用；
图3a为本发明中采用哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404对铁皮石斛白绢病的防治试验。图片左边是未采用哈茨木霉JSNL1404菌液处理铁皮石斛(对照)，已死亡；图片右边是采用哈茨木霉JSNL1404菌液处理铁皮石斛防治处理的，生长旺盛；
图3b为未采用哈茨木霉JSNL1404菌液处理铁皮石斛的对照，根部生病腐烂后，顶端叶片已经枯黄。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案，以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404菌株的特性
本发明中所述的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404的形态学和生理活性特征如下：
哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404在25±1℃的PRX-250A型智能人工气候箱内培养(RH70％，黑暗)的PDA培养基平板上菌落生长快，平均日生长量为2.7cm，初为白色，渐变为淡绿色。最适温度是30℃，在35℃下生长较好。分生孢子近球形至卵状，表面光滑，淡绿色，大小为2.8-3.2×2.5-2.8μm。
哈茨木霉JSNL1404在25±1℃，pH值4-6的培养基上菌丝生长最好，平均日生长量为2.6cm；在30℃时，pH值6-8时产孢量最大。该菌最佳生长温度是25±1℃。
哈茨木霉JSNL1404的rDNA-ITS序列如SEQ ID No.1所示。将所测rDNA-ITS序列通过BLAST比对，鉴定为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404。
实施例2
哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404菌剂的制备方法：将哈茨木霉JSNL1404接种于液体发酵培养基中，pH4.5，500mL三角瓶中装液量为250mL，25℃-30℃，摇床转速120转/分，72小时，得到的发酵液即为防治铁皮石斛白绢病的原菌液。
其中液体发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，马铃薯120g，蔗糖15g，硫酸铵0.5g，pH4.5。
实施例3
哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404菌剂的制备方法：将哈茨木霉JSNL1404接种于液体发酵培养基中，pH5.5，500mL三角瓶中装液量为250mL，25℃-30℃，摇床转速160转/分，120小时，得到的发酵液即为防治铁皮石斛白绢病的原菌液。
其中液体发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，马铃薯150g，蔗糖18g，硫酸铵1.0g，pH5.5。
实施例4
哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404菌剂的制备方法：将哈茨木霉JSNL1404接种于液体发酵培养基中，pH56.8，500mL三角瓶中装液量为250mL，25℃-30℃，摇床转速150转/分，96小时，得到的发酵液即为防治铁皮石斛白绢病的原菌液。
其中液体发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，马铃薯200g，蔗糖20g，硫酸铵1.5g，pH 6.8。
实验例1
哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404对铁皮石斛白绢病菌(Sclerotiumrolfssii)、铁皮石斛根腐病菌(Fusarium proliferatum)、铁皮石斛灰霉菌(Botrytiscinerea)、草莓根腐病菌(Fusarium oxsporum)、小麦赤霉病菌(Fusarium gramiearum)、杨树大斑病菌(Dothichiza populea)的PDA平板抑菌作用。
将用PDA平面培养的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404菌株和铁皮石斛白绢病菌、铁皮石斛根腐病菌、铁皮石斛灰霉菌、草莓根腐病菌、小麦赤霉病菌和杨树大斑病菌分别用直径5mm打孔器打取同质同量的菌饼；接种于平板另一侧。在90mm PDA平板一侧接种哈茨木霉JSNL1404菌饼，另一侧接种供试病原菌的菌饼。25±1℃培养10天和20天，观察抑菌能力，并记录哈茨木霉菌落直径(如表1)，实验效果如图2a至图2f所示。试验结果表明，哈茨木霉JSNL1404对6种病原菌均有较好的抑制作用，以占据培养皿的直径判断抑制效果，用无菌的PDA圆块作为对照(表1)。
表1 JSNL1404对铁皮石斛白绢病菌等6种其他病原菌10天和20天的抑制作用
注：表1中的数字是取5个PDA平板抑制带或菌落覆盖的平均值
1)哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404对铁皮石斛白绢病菌(Sclerotium rolfssii)的抑制作用，如图2a所示；
2)哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404对铁皮石斛根腐病菌(Fusariumproliferatum)的抑制作用，如图2b所示；
3)为本发明中哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404对铁皮石斛灰霉菌(Botrytis cinerea)的抑制作用，如图2c所示；
4)为本发明中哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404对草莓根腐病菌(Fusarium oxsporum)的抑制作用，如图2d所示；
5)为本发明中哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404对小麦赤霉病菌(Fusarium gramiearum)的抑制作用，如图2e所示；
6)为本发明中哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404对杨树大斑病菌(Dothichiza populea)的抑制作用，如图2f所示。
实验例2
哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404菌剂对铁皮石斛白绢病菌(Sclerotium rolfssii)、铁皮石斛根腐病菌(Fusarium proliferatum)、铁皮石斛灰霉菌(Botrytis cinerea)、草莓根腐病菌(Fusarium oxsporum)、小麦赤霉病菌(Fusariumgramiearum)、杨树大斑病菌(Dothichiza populea)的PDA平板抑菌作用。
将培养5天的哈茨木霉JSNL1404的发酵液用灭菌滤纸过滤；将6种植物病原真菌的PDA平板培养物用直径5mm的打孔器打取同质同量的菌饼，接种于PDA平板一侧；再将PDA平板另一侧用直径5mm的打孔器打取同质同量的圆饼，并将圆块取出；再将过滤后的哈茨木霉JSNL1404的无菌滤液100μL接于PDA平板另一侧空洞中，25±1℃培养10天和20天，观察JSNL1404的抑菌效果。以不接种JSNL1404的为对照，待对照菌丝长满平板后，观察拮抗活性(表2)。试验结果表明，哈茨木霉JSNL1404代谢产物对6种病原菌均有强拮抗作用。
表2哈茨木霉JSNL1404菌剂对铁皮石斛白绢病菌等6种其他病原菌10天和20天的抑制作用
注：表2中的数字是取5个PDA平板抑制带的平均值
实验例3：验证哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404菌剂对铁皮石斛白绢病菌是否有抑制作用的试验。
1、实验设备
超净工作台、PRX-250A型智能人工气候箱、培英牌DHZ-DA TCYQ恒温振荡器。
2、实验原理
铁皮石斛白绢病在整个铁皮石斛生长期均有发生，主要为害根部，造成根部腐烂，植株死亡。使用方法是在铁皮石斛生长期间就喷洒哈茨木霉JSNL1404菌剂，JSNL1404菌丝和分生孢子可以粘附在铁皮石斛植株上，以及在根际周围的基质中迅速生长繁殖，产生代谢产物，从而抑制铁皮石斛白绢病菌的生长。
3、实验方法：
1)哈茨木霉JSNL1404菌液的培养：在500mL的三角烧瓶中，将哈茨木霉JSNL1404接种到含有250mL的PD培养液的三角瓶中，120转，25±1℃培养5d。
2)菌剂使用
①将配制好的哈茨木霉JSNL1404原菌液(浓度为4×105个孢子/mL)，兑水稀释1000倍，每丛浇灌10-15mL，浇灌在铁皮石斛植株根际周围，根据植株的大小可以适当调节用量。
②将哈茨木霉JSNL1404原菌液稀释100倍蘸铁皮石斛栽培苗的根，然后进行栽培。
3)对照：用无菌水浇灌铁皮石斛。
4)拮抗实验：将步骤2)①、②与步骤3)中喷洒和对照铁皮石斛植株进行观察，14周的观察结果如图3a和3b图所示。
4、实验结果
哈茨木霉JSNL1404是一种生长速度很快的土壤和栽培基质习居菌，对多种具有病原菌覆盖能力强，空间竞争优势强的优良菌株。哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JSNL1404菌剂对铁皮石斛白绢病菌具有明显的抑制作用。
本发明的室内外试验结果证明，在实验室筛选过程中，它对铁皮石斛白绢病菌、草莓根腐病菌、杨树溃疡病菌等6种病原菌均有很好的抑制效果。田间栽培试验是将哈茨木霉JSNL1404的PD发酵原液(浓度为4×105个孢子/mL)稀释1000倍浇浇灌根部和稀释100倍浸泡根部后栽培，14周检查结果证明，使用哈茨木霉JSNL1404的铁皮石斛植株生长旺盛，同时还具有促进铁皮石斛生长的作用。对照植株有的生长不良，部分叶片逐步变黄脱落，甚至死亡。总之，哈茨木霉JSNL1404是一种优良的植物病害生防菌株，可用于多种植物病害的生防。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种哈茨木霉JSNL1404，其特征在于，其分类命名为哈茨木霉（Trichoderma harzianum），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年6月9日，保藏号为CGMCC No.9281，所述哈茨木霉JSNL1404的最适生长温度为25±1℃。
2.权利要求1所述的一种哈茨木霉JSNL1404在防治铁皮石斛白绢病菌方面的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将哈茨木霉JSNL1404接种于液体发酵培养基中，在25℃-35℃下发酵培养48-72小时，得到的发酵液作为防治铁皮石斛白绢病菌的菌剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述液体发酵培养基的配方为：1000 mL蒸馏水，马铃薯120-200g，蔗糖15-20g，硫酸铵0.5~1.5g，pH4.5-6.8。
5.一种哈茨木霉JSNL1404菌剂，其特征在于，它是将权利要求1所述的哈茨木霉JSNL1404发酵而成的发酵液。
6.权利要求5所述的哈茨木霉JSNL1404菌剂的制备方法，其特征在于，将哈茨木霉JSNL1404接种于发酵培养基中，pH4.5-6.8，500mL三角瓶中装液量为250 mL，25℃-30℃，摇床转速120~160转/分，72~120小时，得到的发酵液即为防治铁皮石斛白绢病的原菌液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：1000 mL蒸馏水，马铃薯120-200g，蔗糖15-20g，硫酸铵0.5~1.5g，pH4.5-6.8。
8.权利要求1所述的一种哈茨木霉JSNL1404在防治铁皮石斛根腐病菌、铁皮石斛灰霉菌、草莓根腐病菌、小麦赤霉病菌或杨树大斑病菌方面的应用。
9.权利要求5所述的哈茨木霉JSNL1404菌剂在防治铁皮石斛白绢病菌、铁皮石斛根腐病菌、铁皮石斛灰霉菌、草莓根腐病菌、小麦赤霉病菌或杨树大斑病菌方面的应用。
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