CN104178439A - 一种动胶菌样申氏菌b184及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种动胶菌样申氏菌，其分类命名为动胶菌样申氏菌（Shinellazoogloeoides）B184，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.9278，保藏日期为2014年06月09日。所述的动胶菌样申氏菌主要用于铁皮石斛灰霉病的生物防治。本发明动胶菌样申氏菌B184对铁皮石斛灰霉病菌、铁皮石斛根腐病、杨树大斑溃疡病、小麦赤霉病等多种病原真菌具有很好的抑制作用，该拮抗细菌对其他植物病害也有很好的防治效果；具有繁殖速度快；能够人工培养，易于操作，便于生产应用。
Description
技术领域
本发明属于植物保护领域，尤其涉及一种动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184及其在防治铁皮石斛灰霉病中的应用。
背景技术
近年来，随着公众对食品和环境中化学农药安全性的普遍关注，以及一些危险性化学农药的禁用，促使人们寻求安全有效的植物病害控制新途径，利用有益微生物防治植物病害日趋受到重视。它是向被打破了的植物自然生态系中引入对植物有益的外源拮抗菌、或通过调节环境促使自然的有益微生物群体增长，并表现出生防活性，通过微生物之间的相互作用达到防病目的。目前，植物病害的生防已成为各国研究重点。
自然界潜在的微生物资源种类丰富，在微生物农药的产品开发方面有明显优势，因此世界各国都投入大量的人力和财力，研究、开发具有自主知识产权的新型微生物农药，并以此带动其他高科技产业的全面发展。我国也把微生物农药的研制和开发列为国家重点科技攻关和高新技术发展计划，江苏省政府也把微生物农药创制作为生物农业的一个重要组成部分。
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)属国家二级保护植物，是中药石斛中珍贵品种之一，因表皮呈铁绿色而得名；其主要成分具有独特的保健与药用价值，被道家养生经典著作《道臧》誉为“中华九大仙草之首”。在我国，自然分布于浙江、安徽、福建、湖南、广西、四川和云南等地人迹稀少的，悬崖峭壁背阴处的石缝里，终年饱受云雾雨露滋润，生长期为3-5年，自然产量极少。
但是，尽十多年来，随着铁皮石斛人工栽培面积不断扩大，病虫害发生普遍，且较严重，特别是在温暖潮湿的环境条件下，铁皮石斛灰霉病(Botrytis cinerea Pers.)发生较普遍，有时会造成叶片、嫩梢发病死亡，在坏死叶片上长出大量灰霉菌，导致巨大经济损失，为此，铁皮石斛灰霉病的防治具有现实意义。
由葡萄孢属(Botrytis Pers.ex Fr.)真菌引起的病害统称为灰霉病，铁皮石斛灰霉病菌是该属的一个种，有性世代为富克尔葡萄孢盘菌[Botryotinia fuckeliana(de Bary)Whetzel]。该菌能引起140余种草本和木本植物的灰霉病，分布广泛，是一种世界性病害，也是我国温室蔬菜、瓜果、草莓、花卉等生产上的最主要病害，可导致农业生产减产20％～25％, 严重时可达40％以上。
从保护生态环境和食品安全的角度出发，铁皮石斛需要有机栽培，研制对人体安全的微生物制剂来控制铁皮石斛病害，达到安全食用的目的，也符合生物农业发展和政府、社会与生物农药产业的发展。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明的第一目的在于提供一种对铁皮石斛灰霉病菌具有拮抗作用的动胶菌样申氏菌B184。
本发明的第二目的在于提供一种动胶菌样申氏菌B184在防治铁皮石斛灰霉病中的应用。
技术方案：为了解决上述第一目的，本发明所采用的技术方案为：一种动胶菌样申氏菌B184，其分类命名为动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.9278，保藏日期为2014年06月09日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101。
为了解决上述的第二目的，本发明所采用的技术方案为：所述的动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184在防治铁皮石斛灰霉病中的应用。
所述的动胶菌样申氏菌B184在抑制铁皮石斛灰霉菌生长中的应用。
具体应用为：将动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184接种于液体发酵培养基中，在28℃-35℃下发酵培养48-72小时，得到的发酵液作为防治铁皮石斛灰霉病菌的菌剂。
本发明中所述发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏2-5g，蛋白胨5-10g，氯化钠4-5g，pH6.5-7.5。
所述的动胶菌样申氏菌B184在抑制铁皮石斛根腐菌生长中的应用。
所述的动胶菌样申氏菌B184在抑制铁皮石斛白绢病菌生长中的应用。
所述的动胶菌样申氏菌B184在抑制草莓根腐病病菌生长中的应用。
所述的动胶菌样申氏菌B184在抑制小麦赤霉病菌生长中的应用。
所述的动胶菌样申氏菌B184在抑制杨树大斑病菌生长中的应用。
本发明中所述的动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184的形态学和生理活性特征如下：
所述动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184在牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落较大，浅灰色，菌落表面有波纹，边缘较规则，菌体杆状，两端钝圆，大小为1.90-5.11×0.49-0.71μm，平均3.32×0.58μm；芽孢两端生，椭圆形，大小为0.64-0.92×0.51-0.66μm，平均0.70×0.55μm。
革兰氏阴性杆菌，好氧；在固体培养基中呈黄褐色、表面光滑的圆形小菌落；在液体培养基中有自絮凝现象；对氨苄青霉素、卡那霉素、壮观霉素有抗性，对氯霉素、四环素、头孢敏感。
动胶菌样申氏菌的16SrDNA序列如SEQ ID No.1所示。将所测16SrDNA序列通过BLAST比对，鉴定为动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：
(1)动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对多种植物病原菌具有抑制作用，在拮抗细菌对植物病害生物防治中起到非常重要的作用，例如种类和数量众多；对病原菌的作用方式多样化；繁殖速度快；能够人工培养，易于操作，便于生产应用；抗逆能力强等优点，尤其是对真菌引起的铁皮石斛灰霉病的防治效果佳。
(2)动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1a为本发明中动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184的形态图；
图1b为本发明中动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184芽孢形态图(在两端折光体)；
图2a为本发明中动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对铁皮石斛灰霉菌(Botrytis cinerea)的抑制作用；
图2b为本发明中动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对铁皮石斛根腐病菌(Fusarium proliferatum)的抑制作用；
图2c为本发明中动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对铁皮石斛白绢病菌(Sclerotium delfphninii)的抑制作用；
图2d为本发明中动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对草莓根腐病(Fusarium oxsporum)的抑制作用；
图2e为本发明中动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对小麦赤霉病菌(Fusarium asiaticum)的抑制作用；
图2f为本发明中动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对杨树大斑病菌(Dothichiza populea)的抑制作用；
图3a为本发明中采用动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对铁皮石斛灰霉病的防治试验；
图3b为本发明中未采用动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184菌液处理铁皮石斛(对照)。
具体实施方式
下面结合实验例详细阐述本发明动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184的应用。
实验例1：
动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对铁皮石斛灰霉菌(Botrytis cinerea)、铁皮石斛根腐病菌(Fusarium proliferatum)、铁皮石斛白绢病菌(Sclerotium delfphninii)、草莓根腐病(Fusarium oxsporum)、小麦赤霉病菌(Fusarium asiaticum)、杨树大斑病菌(Dothichiza populea)的平板抑菌作用。
将用LB斜面活化的动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184菌株划线接种于90mm PDA平板一侧，再将铁皮石斛灰霉菌、铁皮石斛根腐病菌、铁皮石斛白绢病菌、草莓根腐病、小麦赤霉病菌和杨树大斑病菌的PDA平板培养物用直径5mm打孔器打取同质同量的菌块，接种于平板另一侧。30±1℃培养15天和30天，观察抑菌能力，并记录抑制带的宽度(如表1)，实验效果如图2a至图2f所示。试验结果表明，动胶菌样申氏菌B184对6种病原菌均有较好的拮抗作用，以占据培养皿的直径判断抑制效果，用B184细菌的PDA圆块作为对照(表2)。
表1 B184对铁皮石斛灰霉病菌等6种其他病原菌15天和30天的抑制作用
注：表1中的数字是取5个PDA平板抑制带的平均值
1)动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对铁皮石斛灰霉菌(Botrytis cinerea)的抑制作用，如图2a所示；
2)动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对铁皮石斛根腐病菌(Fusarium proliferatum)的抑制作用，如图2b所示；
3)为本发明中动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对铁皮石斛白绢病菌(Sclerotium delfphninii)的抑制作用，如图2c所示；
4)为本发明中动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对草莓根腐病(Fusarium oxsporum)的抑制作用，如图2d所示；
5)为本发明中动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对小麦赤霉病菌(Fusarium asiaticum)的抑制作用，如图2e所示；
6)为本发明中动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对杨树大斑病菌(Dothichiza populea)的抑制作用，如图2f所示。
实验例2：
动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184代谢产物对铁皮石斛灰霉菌(Botrytis cinerea)、铁皮石斛根腐病菌(Fusarium proliferatum)、铁皮石斛白绢病菌(Sclerotium delfphninii)、草莓根腐病(Fusarium oxsporum)、小麦赤霉病菌(Fusarium asiaticum)、杨树大斑病菌(Dothichiza populea)的平板抑菌作用。
培养3天的动胶菌样申氏菌B184的发酵液用细菌滤器过滤，细菌滤器的滤膜孔径为0.25μm；将6种植物病原真菌的90mm的PDA平板培养物用直径5mm的打孔器打取同质同量的菌块，接种于PDA平板一侧；再将PDA平板另一侧用直径5mm的打孔器打取同质同量的圆块，并将圆块取出；再将过滤后的动胶菌样申氏菌B184的100μL无菌滤液接于PDA平板另一侧空洞中，30±1℃培养15天和30天，观察B184的抑菌效果。以不接种B184的为对照，待对照菌丝长满平板后，观察拮抗活性(见表2)。试验结果表明，动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184代谢产物对6种病原菌均有强拮抗作用。
表2 B184发酵液对铁皮石斛灰霉病菌等6种其他病原菌15天和30天的抑制作用
注：表1中的数字是取5个PDA平板抑制带的平均值
图2a动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对铁皮石斛灰霉菌(Botrytis cinerea)的抑制作用；
图2b动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对铁皮石斛根腐病菌(Fusarium proliferatum)的抑制作用；
图2c为本发明中动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对铁皮石斛白绢病菌(Sclerotium delfphninii)的抑制作用；
图2d为本发明中动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对草莓根腐病(Fusarium oxsporum)的抑制作用；
图2e为本发明中动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对小麦赤霉病菌(Fusarium asiaticum)的抑制作用；
图2f为本发明中动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对杨树大斑病菌(Dothichiza populea)的抑制作用。
实验例3：验证动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184对铁皮石斛灰霉病菌是否有抑制作用的试验。
1、实验设备
超净工作台、PRX-250A型智能人工气候箱、培英牌DHZ-DA TCYQ恒温振荡器。
2、实验原理
铁皮石斛灰霉病主要为害叶片和嫩梢，在整个铁皮石斛生长期和越冬期，特别是在冬季塑料大棚的铁皮石斛通风不良，有时会发生严重的灰霉病。使用方法是在铁皮石斛 生长期间就喷洒动胶菌样申氏菌B184菌剂，B184菌体可以粘附在铁皮石斛植株上继续生长繁殖，产生代谢产物，从而抑制铁皮石斛灰霉病菌的生长。
3、实验方法：
1)动胶菌样申氏菌B184菌液的培养：将动胶菌样申氏菌B184接种到含有500mL的LB培养基的三角瓶中，120转，35℃培养60小时。
2)菌剂使用：将配制好的动胶菌样申氏菌B184菌液(3.6亿菌体/mL)用喷雾器均匀喷洒在铁皮石斛植株上。
3)对照：用无菌水喷洒铁皮石斛。
4)拮抗实验：将步骤2)与步骤3)中喷洒和对照铁皮石斛植株进行观察，10周的观察结果如图3a至图3b所示；
4、实验结果
结果证明，使用B184防治铁皮石斛灰霉病的效果与对照相比较，可达70％左右。
下面是本发明的具体实施例
实施例1：动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184菌剂的制备方法：将动胶菌样申氏菌B184接种于发酵培养基中，pH6.5，500mL三角瓶中装液量为300mL，28℃-35℃，摇床转速120转/分，48小时，得到的发酵液即为防治铁皮石斛根腐病的原菌液。
其中发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏2g，蛋白胨5g，氯化钠5g，pH6.5。
实施例2：动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184菌剂的制备方法：将动胶菌样申氏菌B184接种于发酵培养基中，pH7.5，500mL三角瓶中装液量为300mL，28℃-35℃，摇床转速160转/分，72小时，得到的发酵液即为防治铁皮石斛根腐病的原菌液。
其中发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，pH7.5。
实施例3：动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)B184菌剂的制备方法：将动胶菌样申氏菌B184接种于发酵培养基中，pH7，500mL三角瓶中装液量为300mL， 28℃-35℃，摇床转速150转/分，55小时，得到的发酵液即为防治铁皮石斛根腐病的原菌液。
其中发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏3g，蛋白胨8g，氯化钠5g，pH 7。
Claims (10)
1.一种动胶菌样申氏菌B184，其分类命名为动胶菌样申氏菌（Shinella zoogloeoides），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No. 9278，保藏日期为2014年06月09日。
2.权利要求1所述的动胶菌样申氏菌B184在防治铁皮石斛灰霉病中的应用。
3.权利要求1所述的动胶菌样申氏菌B184在抑制铁皮石斛灰霉菌生长中的应用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将动胶菌样申氏菌（Shinella zoogloeoides）B184接种于液体发酵培养基中，在28℃-35℃下发酵培养48-72小时，得到的发酵液作为防治铁皮石斛灰霉病菌的菌剂。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：1000 mL蒸馏水，牛肉膏2-5g，蛋白胨5-10g，氯化钠4-5g，pH6.5-7.5。
6.权利要求1所述的动胶菌样申氏菌B184在抑制铁皮石斛根腐菌生长中的应用。
7.权利要求1所述的动胶菌样申氏菌B184在抑制铁皮石斛白绢病菌生长中的应用。
8.权利要求1所述的动胶菌样申氏菌B184在抑制草莓根腐病病菌生长中的应用。
9.权利要求1所述的动胶菌样申氏菌B184在抑制小麦赤霉病菌生长中的应用。
10.权利要求1所述的动胶菌样申氏菌B184在抑制杨树大斑病菌生长中的应用。
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