CN104263673A - 一种枯草芽孢杆菌b51及其应用 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌b51及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌B51，保藏编号为：CGMCCNo.7541，保藏日期为2013年04月28日，其分类命名为枯草芽孢杆菌( Bacillussubtilis )，已保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心。本发明枯草芽孢杆菌B51对铁皮石斛根腐病菌、小麦赤霉病、草莓灰霉病等多种病原真菌具有很好的抑制作用，该拮抗细菌对其他植物病害也有很好的防治效果；具有繁殖速度快；能够人工培养，易于操作，便于生产应用；抗逆能力强等优点，尤其是对真菌引起的铁皮石斛根腐病的防治具有重要意义；培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

Description

一种枯草芽孢杆菌B51及其应用
技术领域
本发明属于植物保护领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51及其在防治铁皮石斛根腐病中的应用。 
背景技术
近年来，随着公众对食品和环境中化学农药安全性的普遍关注，以及一些危险性化学农药的禁用，促使人们寻求安全有效的植物病害控制新途径，利用有益微生物防治植物病害日趋受到重视。它是向被打破了的植物自然生态系中引入对植物有益的外源拮抗菌、或通过调节环境促使自然的有益微生物群体增长，并表现出生防活性，通过微生物之间的相互作用达到防病目的。目前，植物病害的生防已成为各国研究重点。 
自然界潜在的微生物资源种类丰富，在微生物农药的产品开发方面有明显优势，因此世界各国都投入大量的人力和财力，研究、开发具有自主知识产权的新型微生物农药，并以此带动其他高科技产业的全面发展。我国也把微生物农药的研制和开发列为国家重点科技攻关和高新技术发展计划，江苏省政府也把微生物农药创制作为生物农业的一个重要组成部分。 
生物农药(biopesticides)，按照Copping和Menn的定义包含了活体微生物(真菌、细菌和病毒)，昆虫植病线虫，植物源农药，微生物农药，微生物次生代谢物(抗生素)等，用于防治各种昆虫和病害；生物农药(特别是微生物农药)具有独特的优点是对人类健康威胁小，对环境较安全，这正是全社会最关心的问题之一。因此，进入21世纪以来，各国政府和植物保护工作者更加重视生物农药的开发和应用，已成为研究热点。 
微生物农药的特性赋予了农业可持续发展战略，为保护农业生态环境，保障食品安全提供物质基础和技术支撑；同时微生物农药产业也是未来经济中具有发展潜力的新增长点之一。研究微生物农药产业发展对于政府部门科学制定促进微生物农药产业发展的政策体系，实现农药产业结构调整，促进循环经济和可持续社会发展战略，保障我省经济建设和农业生态环境的协调发展，以及建设我省农产品安全体系等都将具有十分重要作用。 
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)属国家二级保护植物，是中药石斛中珍贵品种之一，因表皮呈铁绿色而得名；其主要成分具有独特的保健与药用价值， 被道家养生经典著作《道臧》誉为“中华九大仙草之首”。在我国，自然分布于浙江、安徽、福建、湖南、广西、四川和云南等地人迹稀少的，悬崖峭壁背阴处的石缝里，终年饱受云雾雨露滋润，生长期为3-5年，自然产量极少。是一种及其名贵、药食同源的滋阴补品。因其生存的生态条件十分特殊、苛刻，自然繁殖率极低，人间难得一见，兼以饱吸天地日月云雾雨露之精华，有着起死回生的神奇功效，故有“救命仙草”之称。 
现代医学和中医药理研究表明，铁皮石斛有效成分主要为石斛碱、石斛多糖、氨基酸等生物活性成分，能显著提高机体免疫功能，具有滋阴清热、耐缺氧、抗疲劳、抗衰老、防治肿瘤、治疗糖尿病和萎缩性胃炎等多重功效，对烟酒、劳累、夜生活、用眼用脑过度人群及声带嘶哑者有恢复作用。 
但是，尽十多年来，随着铁皮石斛人工栽培面积不断扩大，病虫害发生普遍，且较严重，特别是铁皮石斛根腐病的发生，有时会造成大面积的成片死亡，导致巨大经济损失，为此，铁皮石斛根腐病的防治具有现实意义。申请者通过2年多的研究，形成本发明专利。 
从保护生态环境和食品安全的角度出发，铁皮石斛需要有机栽培，研制对人体安全的微生物制剂来控制铁皮石斛病害，已达到安全食用的目的。也符合生物农业发展和政府、社会与生物农药产业的发展。 
发明内容
发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种对铁皮石斛根腐病菌具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌B51。 
本发明的所要解决的第二个技术问题是提供一种枯草芽孢杆菌B51在防治铁皮石斛根腐病、草莓根腐病、草莓灰霉菌、草莓炭疽菌和/或小麦赤霉病菌中的应用。 
本发明所述解决的第三个技术问题是提供了一种枯草芽孢杆菌B51菌剂。技术方案：为了解决上述第一个技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种枯草芽孢杆菌B51，其特征在于：保藏编号为：CGMCC No.7541，保藏日期为2013年04月28日，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，已保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101。 
为了解决上述第二个技术问题，本发明所采用的技术方案为： 
本发明所述的枯草芽孢杆菌B51在防治铁皮石斛根腐病中的应用。 
所述的枯草芽孢杆菌B51在抑制铁皮石斛根腐病菌生长中的应用。 
一种枯草芽孢杆菌B51菌剂，将枯草芽孢杆菌B51接种于发酵培养基中，在28℃-35℃下发酵培养48-72小时，摇床转速120～160转/分，得到的发酵液作为防治铁皮石斛根腐病菌的菌剂。 
本发明所述的发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏2-5g，蛋白胨5-10g，氯化钠4-5g，pH6.5-7.5。 
所述的枯草芽孢杆菌B51在抑制草莓根腐病菌生长中的应用。 
所述的枯草芽孢杆菌B51在抑制草莓灰霉菌生长中的应用。 
所述的枯草芽孢杆菌B51在抑制草莓炭疽菌生长中的应用。 
所述的枯草芽孢杆菌B51在抑制小麦赤霉病菌长中的应用。 
本发明中所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51的生理活性特征如下： 
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51在牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落较大，乳白色，直径一般4-6mm，表面隆起，干燥，有皱褶，边缘较规则，菌体杆状，两端钝圆，具周生鞭毛，大小为1.57-5.38×0.46-0.65μm，平均3.44×0.57μm；芽孢两端生，椭圆形，大小为0.81-0.97×0.42-0.75μm，平均0.80×0.53μm。 
革兰氏染色表现为阳性；酪蛋白水解、淀粉水解、明胶液化为阳性，V.P反应可变，吲哚反应阴性；糖类产酸发酵。 
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51即解淀粉芽孢杆菌的16SrDNA序列如SEQ ID No.1所示。将所测16SrDNA序列通过BLAST比对，鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。 
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是： 
(1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51对多种植物病原菌具有抑制作用，在拮抗细菌对植物病害生物防治中起到非常重要的作用，例如种类和数量众多；对病原菌的作用方式多样化；繁殖速度快；能够人工培养，易于操作，便于生产应用；抗逆能力强等优点，尤其是对真菌引起的铁皮石斛根腐病的防治具有重要意义；也是保证中药安全重要手段。 
(2)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。 
附图说明
图1a枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51的形态图； 
图1b为本发明中枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B51芽孢形态图(在一端或两端折光体) 
图2a为本发明中枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B51对铁皮石斛根腐病菌(Fusarium  proliferatum)的抑制作用； 
图2b为本发明中枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B51对草莓根腐病(Fusarium oxsporum)的抑制作用； 
图2c为本发明中枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B51对草莓灰霉菌(Botrytis cinerea)的抑制作用； 
图2d为本发明中枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B51对胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporiodes)的抑制作用； 
图2e为本发明中枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B51对小麦赤霉病菌(Fusarium asiaticum)的抑制作用； 
图3a为本发明中采用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B51对铁皮石斛根腐病的防治试验； 
图3b为本发明中未采用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B51菌液处理铁皮石斛(对照)。 
具体实施方式
下面是本发明的具体实施例 
实施例1：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51菌剂的制备方法：将枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B51接种于发酵培养基中，pH6.5，500mL三角瓶中装液量为300mL，28℃-35℃，摇床转速120转/分，48小时，得到的发酵液即为防治铁皮石斛根腐病的原菌液。 
其中发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏2g，蛋白胨5g，氯化钠5g，pH6.5。 
实施例2：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B51菌剂的制备方法：将枯草芽孢杆菌B51接种于发酵培养基中，pH7.5，500mL三角瓶中装液量为300mL，28℃-35℃，摇床转速160转/分，72小时，得到的发酵液即为防治铁皮石斛根腐病的原菌液。 
其中发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，pH7.5。 
实施例3：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B51菌剂的制备方法：将枯草芽孢杆菌B51接种于发酵培养基中，pH 7，500mL三角瓶中装液量为300mL，28℃-35℃，摇床转速150转/分，55小时，得到的发酵液即为防治铁皮石斛根腐病的原菌液。 
其中发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏3g，蛋白胨8g，氯化钠5g，pH 7。 
下面结合实验例详细阐述本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51的应用。 
实验例1：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51对铁皮石斛根腐病菌(Fusarium proliferatum)、草莓根腐病(Fusarium oxsporum)、草莓灰霉菌(Botrytis cinerea)、草莓炭疽菌(Colletotrichum gloeosporiodes)、小麦赤霉病菌(Fusarium asiaticum)的平板抑菌作用。 
将用LB斜面活化的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51菌株划线接种于90 mm PDA平板一侧，再将铁皮石斛根腐病菌、草莓根腐病、草莓灰霉菌、草莓炭疽菌和小麦赤霉病菌PDA平板培养物用直径5mm的打孔器打取同质同量的菌块，接种于平板另一侧。30±1℃培养14天和28天，观察抑菌能力，并记录抑制带的宽度(如表1)，实验效果如图2a至图2e所示。试验结果表明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51对5种病原菌均有较好的拮抗作用，以占据培养皿的直径判断拟制效果，用无菌的PDA圆块作为对照。 
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51与不同的病原真菌进行拮抗实验培养28天后，二者之间的抑制带会变小，拮抗带的宽窄各异(表2)。 
表1 B51对铁皮石斛根腐病菌和草莓根腐病原菌14天和28天的抑制作用 
注：表1中的数字是取5个PDA平板的平均值 
1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51对铁皮石斛根腐病菌(Fusarium proliferatum)的抑制作用，如图2a所示； 
2)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51对草莓根腐病(Fusarium oxsporum)的抑制作用，如图2b所示； 
3)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51对草莓灰霉菌(Botrytis cinerea)的抑制作用，如图2c所示； 
4)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51对草莓炭疽菌(Colletotrichum gloeosporiodes)的抑制作用，如图2d所示； 
5)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51对小麦赤霉病菌(Fusarium asiaticum)的抑制作用，如图2e所示； 
实验例2：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51代谢产物对铁皮石斛根腐病菌(Fusarium proliferatum)、草莓根腐病(Fusarium oxsporum)、草莓灰霉菌(Botrytis cinerea)、草莓炭疽菌(Colletotrichum gloeosporiodes)、小麦赤霉病菌(Fusarium asiaticum)的平板抑菌作用。 
培养3天的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51的发酵液用细菌滤器过滤，细菌滤器的滤膜孔径为0.25μm；将5种植物病原真菌的90mm的PDA平板培养物用直径5mm的打孔器打取同质同量的菌块，接种于PDA平板一侧；再将PDA平板另一侧用直径5mm的打孔器打取同质同量的圆块，并将圆块取出；再将过滤后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51的100μL无菌滤液接于PDA平板另一侧空洞中，30±1℃培养14天和28天，观察B51的抑菌效果。以不接生防菌为对照，待对照菌丝长满平板后，观察拮抗活性(见表2)。试验结果表明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51代谢产物对5种病原菌均有强拮抗作用。 
表2 B51发酵液对5种铁皮石斛根腐病菌和草莓根腐病原菌14天和28天的抑制作用 
实验例3：验证枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B51对铁皮石斛根腐病菌是否有抑制作用的试验。 
1、实验设备 
超净工作台、PRX-250A型智能人工气候箱、培英牌DHZ-DA TCYQ恒温振荡器。 
2、实验原理 
在铁皮石斛栽培前，将铁皮石斛组培苗的根用清水洗净、晾干后，放在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B51的稀释液中浸泡2-3分钟，取出凉干，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B51可以粘附在铁皮石斛根上继续生长繁殖，产生代谢产物，从而抑制铁皮石斛根腐病菌的生长。 
3、实验方法： 
1)枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B51菌液的培养：将枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B51接种到含有500mL的LB培养基的三角瓶中，120转，35℃培养60小时。 
2)带菌铁皮石斛根的制备：将栽培的铁皮石斛苗放入配制好的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B51菌液(2.2亿菌体/mL)中浸泡约2-3分钟，取出晾干(根表面无水)进行栽培。 
3)对照铁皮石斛根的制备：将供栽培的铁皮石斛苗放入无菌水中浸泡约2分钟取出晾干进行栽培。 
4)拮抗实验：将步骤2)与步骤3)中浸泡好的铁皮石斛苗晾干至不滴水为止，分别栽种塑料温室大棚里，8周进行观察结果如图3a至图3b所示。 
4、实验结果 
实验结果证明，在铁皮石斛栽培前使用B51蘸根，能够有效地防止根腐病的发生，与对照相比较，防效可达75以上。 

Claims (9)

1.一种枯草芽孢杆菌B51，其特征在于：保藏编号为：CGMCC No.7541，保藏日期为2013年04月28日，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，已保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌B51在防治铁皮石斛根腐病中的应用。
3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌B51在抑制铁皮石斛根腐病菌生长中的应用。
4.一种枯草芽孢杆菌B51菌剂，其特征在于，将枯草芽孢杆菌B51接种于发酵培养基中，在28℃-35℃下发酵培养48-72小时，摇床转速120~160转/分，得到的发酵液作为防治铁皮石斛根腐病菌的菌剂。
5.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌B51菌剂，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：1000 mL蒸馏水，牛肉膏2-5g，蛋白胨5-10g，氯化钠4-5g，pH6.5-7.5。
6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌B51在抑制草莓根腐病菌生长中的应用。
7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌B51在抑制草莓灰霉菌生长中的应用。
8.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌B51在抑制草莓炭疽菌生长中的应用。
9.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌B51在抑制小麦赤霉病菌长中的应用。
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