CN101121924A - 一种枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌(Bacillius subtilis)菌株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的菌种保藏编号为CGMCCNo.1982。该菌株制成的干粉菌剂可用于防治由小麦赤霉病菌、水稻稻瘟病菌、玉米小斑病菌、黄瓜炭疽病菌、大蒜菌核病菌、黄瓜炭疽病菌等引起的农作物、蔬菜等病害；还可应用于桃、苹果、葡萄、梨等水果保鲜领域。经菌悬液处理后的水稻、玉米叶片，均不能出现相应的病斑；用粉剂拌种、粉剂根埋或菌悬液喷洒方式处理后的黄瓜种子或幼苗叶片，不仅可防止黄瓜炭疽病的发生，而且表现出良好的促生作用，有利于绿色、无公害蔬菜的生产。经菌悬液处理后的鲜桃，烂果率明显降低，贮存期延长。该菌剂制备工艺简单，适合工业化生产。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌及其菌剂的应用，属于一种广谱生防、促生菌剂。

背景技术

半个多世纪以来，化学农药防治病虫害对农业生产起了十分重要的作用。但是，随着化学农药的长期和大量使用带来的农药残留、环境污染、病虫的抗药性等问题的出现，化学农药的安全性引起了社会的普遍关注，生物防治越来越受到人们的重视。生物防治具有对人畜安全，无毒害，不污染环境等优点，逐渐成为植物病虫害防治的重要措施之一。在植物病虫害生物防治中，尤以苏云金芽孢杆菌(Bt)防治鳞翅目害虫最为成功。目前，开发利用生物杀菌剂防治农作物病害已成为生防领域的研究热点。在该领域，具有防病效果的微生物包括：芽孢杆菌、木霉、放线菌等，其中以枯草芽孢杆菌的研究开发最为活跃，在微生物杀菌剂市场中备受瞩目。枯草芽孢杆菌是一种在自然界广泛存在的微生物，革兰氏阳性，产生耐热、抗逆的芽孢，在芽孢形成初期分泌各种抗菌物质，对病原真菌有特异性的防治作用，具有显著的生防潜力。枯草芽孢杆菌具生长快、营养简单，有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中的存活、定殖与繁殖，而且批量生产工艺简单，成本也较低，施用方便，储存期长，是一种理想的生防微生物。目前已明确的枯草芽孢杆菌作为生物杀菌剂的抑菌机制有以下几个方面：一是营养和空间位点的竞争；二是分泌抗菌物质。目前已确定来自枯草芽孢杆菌的抗菌物质有低分子抗菌肽，有环状肽或环状脂肽，也有些为线状肽等，这些物质能使病原真菌菌丝发生断裂、解体、细胞质消解等现象；三是促进植物生长，增强植物的诱导抗病性。尽管很多枯草芽孢杆菌生防制剂已被证实具有防治作用，但仅有少数几种应用于生产，大部分仍处于研究和探索阶段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌菌株以及该菌株的干粉菌剂在农业病害防治、水果保鲜等领域中的应用。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

本发明人从田间玉米病叶片上分离到一株对玉米小斑病菌C小种有拮抗作用的细菌菌株，经鉴定属于典型的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，但与其它枯草芽孢杆菌相比其具有广谱抗病原真菌活性，同时其干粉菌剂对鲜桃、葡萄等水果保鲜效果较好，用于黄瓜、番茄、等大棚蔬菜的生产不仅有抗病效果，而且又有促生作用。为了证明该菌株的广谱抗病原真菌活性，发明人做了以下工作：

一、枯草芽孢杆菌CGMCC No.1982菌株的鉴定、诱变及拮抗机理

1、菌株的形态

显微镜下观察发现，该菌株菌体杆状，产生芽孢，革兰氏反应为阳性。在TSA培养基上菌落呈浅黄色，近圆形，表面干燥、有褶皱，不透明。

2、菌株的生理生化特征

生理生化实验鉴定表明，该菌株为好氧菌，接触酶阳性，V-P实验阳性，能产生淀粉酶，对盐有一定的耐受性；不能利用丙二酸盐；不产生卵磷脂酶。

3、菌株16S rDNA序列的测定

利用PCR技术扩增该菌株的16S rDNA序列，获1514bp全长片段。将测序结果与GeneBank中已知的16S rDNA进行同源性比较，发现与Bacillussubtilis(登录号：AY887082)的同源性最高，为99％。

根据菌体革兰氏染色、菌落形态特征的观察、生理生化测试及16S rDNA序列分析结果，该菌株和枯草芽孢杆菌相吻合，因此将其鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

4、菌株的复合诱变及抗菌活性提高

采用紫外线和氯化锂对菌株进行复合诱变处理，获得了遗传性状稳定的诱变菌株，其对致病真菌玉米小斑病菌的拮抗活性比出发菌株提高了66.2％。

5、菌株拮抗物质的理化特性分析

将菌株接种于LB液体培养基，30℃振荡培养48h，用高速离心机12，000r/min离心5min去菌体，上清液加入30％饱和度的硫酸铵，4℃静置过夜后，12,000r/min离心25min，取上清液，加入硫酸铵使达到60％饱和度，4℃静置过夜后，12,000r/min离心25min，得到具拮抗活性的蛋白性质粗提物。

对拮抗物的理化特性分析表明，菌株产生的拮抗物质能耐高温(100℃，10min)，抑菌活性pH值范围为5.0～9.0，对紫外线、胰蛋白酶部分敏感，对蛋白酶K、氯仿敏感，说明该拮抗蛋白稳定性较好。

6、菌株拮抗物质的拮抗机理

以玉米小斑病菌(Biipolaris maydis)作为指示菌，对菌株产生的拮抗物质的作用机制进行了初步研究，结果表明：拮抗物质可使玉米小斑病菌孢子不萌发或萌发异常；菌丝畸形，顶端及中部膨大、扭曲，细胞质分布不均匀。

二、枯草芽孢杆菌菌株CGMCC No.1982干粉菌剂的制备

1、液体发酵培养

(1)菌种活化  采用的培养基含：胰蛋白胨，大豆蛋白胨，NaCl，水。

将保存的甘油菌种接到活化培养基固体斜面后，34℃培养48h。

(2)种子培养  采用的培养基含：酵母膏，葡萄糖，CaCO₃，水。

将活化的斜面菌种用无菌水冲洗，制成菌悬液，按下列条件接到种子培养基中培养，培养温度35℃，摇瓶装量12％，接种量3％，初始pH值7.2。

(3)菌株补料分批发酵工艺

发酵培养基含：葡萄糖，酵母膏，CaCO₃。

流加培养基含：葡萄糖，酵母膏，制成混合液一起流加；

流加时间：发酵8h后开始；发酵时间：34±2h；

发酵液芽孢浓度：(3.41+0.151)×10⁹cfu/mL。

2、菌体的制备

发酵得到的发酵液12000r/min离心20min，弃上清，菌体加入无菌水悬浮混匀，再12000r/min离心15min，弃上清得菌体。

3、干粉菌剂的制备

菌体称重后，称等重量的无水CaCO₃，CaCO₃缓慢加入湿菌体中，边加边搅拌，直至均匀。于真空干燥箱中50℃烘干30min至粉末状。干粉菌剂中活芽孢数为2.109±0.366)×10¹¹cfu/g。

三、枯草芽孢杆菌CGMCC No.1982干粉菌剂在农业病害防治、水果保鲜等领域的应用

本发明用于农业病害防治、水果保鲜的枯草芽孢杆菌(Bacillius subtilis)菌株CGMCC No.1982干粉菌剂的组成为：湿菌体与无水碳酸钙的质量比为1∶1，菌剂中的活芽孢数含量为200～500亿/克。

上述干粉菌剂还可以制备成干粉水溶液(菌悬液)，制备方法是称取0.1g干粉菌剂溶于100mL水中，或干粉菌剂与水的质量体积比为1∶1000，搅拌均匀得菌悬液，菌悬液活芽孢数为1.0×10⁸cfu/mL。

(1.0×10⁸cfu/mL)。

本发明取得的积极效果是：本发明的菌株CGMCC No.1982可用于防治由小麦赤霉病菌、水稻稻瘟病菌、玉米小斑病菌、黄瓜炭疽病菌、大蒜菌核病菌、辣椒炭疽病菌桃等引起的农作物、蔬菜等病害；还可应用于桃、苹果、葡萄、梨等水果保鲜领域。经干粉水溶液处理后的水稻、玉米叶片，均不能出现相应的病斑；用粉剂拌种、粉剂根埋或菌悬液喷洒方式处理的黄瓜种子或幼苗叶片，不仅可防止黄瓜炭疽病的发生，而且表现出良好的促生作用，有利于绿色、无公害蔬菜的生产。经菌悬液处理后的鲜桃，烂果率明显降低，贮存期延长。本发明的干粉菌剂在农业病害防治、水果保鲜等领域展现出较好的应用前景。本发明的枯草芽孢杆菌粉剂中芽孢含量明显高于市场上现有的产品，而且其制备工艺简单，适合工业化生产。

该菌株于2007年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种保藏编号为CGMCC No.1982。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明。

实施例1枯草芽孢杆菌CGMCC No.1982对农业生产主要病原菌的拮抗作用

(1)拮抗菌的培养  把菌株CGMCC No.1982试管菌种从4℃冰箱中取出，放置2h后，在LB平板上划线接种，并于30℃培养2d。

(2)病原真菌的培养  供试病原真菌的保存种接于PDA平板上，28℃培养使其长满平皿。供试病原真菌包括：玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.Vasinfectum)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)、辣椒疫霉病菌(Phytophora capsici)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum lagenarium)、大蒜菌核病菌(Sclerotinia allii)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、桃灰霉(Humicola Traaen)等。

(3)拮抗谱的测定  待病原真菌菌丝长满PDA平皿时，用灭菌的打孔器(Φ＝6mm)在平板上打孔，然后用接种针把菌丝块放入冷却的PDA平板中央，同时在距菌落边缘1cm处用接种环点接菌株A，然后观察生长情况，记录拮抗菌落半径(R₁)，抑菌带宽度(R₂)，以R₂/R₁表示抑菌活性强弱。

(4)结果  采用平板对峙法测定了菌株CGMCC No.1982对农业生产主要致病真菌的拮抗作用，结果表明，该菌株对上述病原真菌均有拮抗作用，说明该菌株具有广谱抗病原真菌特性。其中以对黄瓜炭疽病菌、大蒜菌核病菌、小麦赤霉病菌、烟草赤星病菌、水稻稻瘟病菌、玉米小斑病菌、黄瓜炭疽病菌拮抗活性较强，展现出其在农业生产病害生物防治方面具很好的应用前景。

实施例2枯草芽孢杆菌菌株CGMCC No.1982的菌悬液对稻瘟病的防效

(1)菌种活化：TSA培养基：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，NaCl 5g，水1000mL；

将保存的甘油菌种CGMCC No.1982接种到TSA固体斜面培养基后，34℃培养48h；

(2)种子培养：将活化的斜面菌种用无菌水冲洗后，接种到装有40mLTSA液体培养基的三角瓶中，接种量1％。160r/min，34℃振荡培养20h；

(3)发酵培养：

发酵培养基：葡萄糖1％，酵母膏1％，CaCO₃1％，pH 7.5；

流加培养基：葡萄糖1.5％，酵母膏0.5％，葡萄糖和酵母膏制成混合液800mL；

将种子液以3％的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养，采用20L搅拌式发酵罐进行补料分批发酵，装量为12L，发酵过程中通过流加Na₂CO₃调节pH值，选用食用豆油作为消泡剂，从8.5h后开始流加葡萄糖和酵母膏的混合液，发酵时间为36±2h；

发酵完成活菌数达1.5×10^gcfu/mL，芽孢数达1.29×10⁹cfu/mL。

(4)湿菌体的制备

将用发酵罐发酵培养所得的发酵液12000r/min离心20min，弃上清，菌体加入无菌水悬浮混匀，再12000r/min离心15min，弃上清得湿菌体。

(5)干粉菌剂的制备

菌体称重后，称等重量的无水CaCO₃。CaCO₃缓慢加入湿菌体中，边加边搅拌，直至均匀。于真空干燥箱中50℃烘干30min至粉末状，干粉菌剂中活芽孢数为2.109±0.366)×10¹¹cfu/g。

(6)干粉水溶液(菌悬液)制备

制备方法是称取0.1g干粉菌剂溶于100mL水中，搅拌均匀得菌悬液(1.0×10⁸cfu/mL)。

(7)试验方法

分别取水稻(丽江新团黑谷)叶片10片，分成两组。一组做对照，以清水处理后，滴加稻瘟病菌孢子悬液(浓度为3×10⁴cfu/mL)一滴，每个叶片接种3处；另一组用菌悬液处理，同样条件下接种稻瘟病菌孢子悬液。随后培养皿26℃保湿培养(光照12h，黑暗12h)，48h后去除孢子悬液，72h后观察统计叶片的发病情况。

(8)试验结果

结果表明，经菌悬液处理后的水稻叶片多不发病或只是轻微发病，病斑直径≤1mm²，而清水处理后的叶片均发病，病斑直径平均为5×2mm²，且病斑具有坏死中心。

实施例3枯草芽孢杆菌菌株CGMCC No.1982的菌悬液对玉米小斑病的防效

采用与实施例1基本相同的方法检测了该菌株菌悬液对玉米小斑病菌的防治效果。结果表明，经菌悬液处理后的玉米(B73C)叶片均未发病；而清水处理后的玉米叶片均发病，病斑直径平均为2×2mm²。

实施例4枯草芽孢杆菌菌株干粉水溶液(菌悬液)对黄瓜种子促芽及生长试验

(1)菌悬液的制备  同实施例1。

(2)黄瓜种子处理

用菌悬液浸泡黄瓜种子，25℃浸泡24h。然后将种子转移至铺有含菌悬液的滤纸培养皿中，25℃催芽保湿24h。以清水浸泡种子和清水催芽保湿为对照。每皿20颗种子，每个处理三次重复。观察菌悬液对黄瓜出芽和芽生长的影响。

将菌悬液浸泡催芽后的种子播种于装有无菌的营养土和蛭石的花盆中。以清水浸泡处理种子做对照。每处理6盆，重复3次。每盆播种5粒，置于培养室中，光暗时间12h/12h条件下培养。出苗后每盆留苗4株。待苗的第一片真叶展开后，统计苗成活率、株高、株重，对结果进行统计分析。

(3)结果

菌悬液对黄瓜种子的发芽无抑制作用，处理组出芽率为97.91％，对照为97.82％，处理和对照没有显著差异；出芽后菌悬液对芽表现出促生长作用，催芽2d后生菌悬液处理种子平均芽长为1.66cm，比对照高出0.27cm，促芽生长率达19.42％。

经浸种处理的黄瓜苗的平均株高、株重和苗成活率都显著高于清水处理(对照)，说明菌悬液处理对黄瓜苗的生长具有促生作用；浸种处理的黄瓜苗长势良好，苗整齐粗壮，而对照组同等条件下黄瓜苗细弱，整体长势较差。

实施例5枯草芽孢杆菌菌株干粉菌剂拌种对盆栽黄瓜苗的促生作用

(1)干粉菌剂的制备  同实施例1。

(2)拌种处理及播种

将清水浸泡和催芽的种子与干粉菌剂按照重量比100∶1拌种后，播种于装有无菌的营养土和蛭石的花盆中。以清水浸泡未拌种处理种子做对照。每处理6盆，重复3次。每盆播种5粒，置于培养室中，光暗时间12h/12h条件下培养。出苗后每盆留苗4株。待苗的第一片真叶展开后，统计苗成活率、株高、株重，对结果进行统计分析。

(3)结果

经拌种处理的黄瓜苗的平均株高、株重和苗成活率都显著高于清水处理(对照)，说明菌剂拌种对黄瓜苗的生长具有促生作用；经拌种处理的黄瓜苗长势良好，苗整齐粗壮，而对照组同等条件下黄瓜苗矮小，整体长势较差。

实施例6枯草芽孢杆菌菌悬液对离体黄瓜叶片黄瓜炭疽病发病的影响

(1)浸种与催芽处理；拌种处理及播种同上。

(2)叶面喷洒处理：待黄瓜叶苗第一片真叶完全展开后，对清水浸种的苗进行菌悬液叶面喷洒处理，每棵喷洒菌悬液10mL。

(3)接种实验

分别剪取经菌悬液浸种、干粉菌剂拌种、菌悬液叶面喷洒处理苗的第三片真叶，以清水未处理叶片做对照，置于滤纸保湿的培养皿中。每种叶片中央各滴加黄瓜炭疽病菌孢子悬液20μL(浓度为2×10⁵cfu/mL)，盖上皿盖置于光照培养箱中25℃保湿培养(光照12h，黑暗12h)，6d后统计发病情况和病斑的大小。每皿放置一片叶子，每处理30个重复。

(4)黄瓜炭疽病调查分级标准

0级：叶片无病斑

1级：病斑占整个叶片面积的5％以下

3级：病斑占整个叶片面积的6％～10％

5级：病斑占整个叶片面积的11％～25％

7级：病斑占整个叶片面积的26％～50％

9级：病斑占整个叶片面积的50％以上

病情指数＝∑(各级发病数×该级代表数)/(总数×最高级代表数)

防效％＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％

(5)结果

统计比较离体黄瓜叶片病斑直径，发现拌种处理的黄瓜苗的离体叶片对黄瓜炭疽病的防效较高，与清水处理相比，防效可达77.92％。清水处理离体叶片保湿培养6d后，病菌在叶片上生长形成明显的水浸斑；而拌种处理叶片、喷洒处理叶片、浸种处理叶片经保湿培养6d后，未见水浸斑，或只在叶片中央有很小面积的水浸斑，防病效果较好。

实施例7枯草芽孢杆菌菌悬液对盆栽黄瓜苗黄瓜炭疽病的防治

(1)菌悬液的制备  同实施例1。

(2)浸种与催芽处理、拌种处理及播种同上。

(3)黄瓜炭疽病菌孢子悬液制备同上。

(4)黄瓜苗处理

待黄瓜苗第一片真叶完全展开，菌悬液浸种和干粉拌种的苗直接接种黄瓜炭疽病菌孢子；对清水浸种的苗分别进行菌悬液浇苗处理和叶面喷洒理，每盆浇菌悬剂40mL，每棵喷洒菌悬剂10mL。浇苗或喷洒72h后接种病菌孢子。每株喷洒接种黄瓜炭疽孢子悬液5mL，25℃保湿培养(光照12h，黑暗12h)。每处理6盆，重复3次。以清水处理接种和不接种病菌为对照，分别于接种后7d、14d调查发病率及发病程度。

(5)黄瓜炭疽病调查分级标准同上

(6)结果

三种处理方式在接种病菌7d和14d后有较好的防效。浸种处理7d后的防效为84.86％，浇灌处理14d的防效达49.69％。对照组中大部分黄瓜苗发病，黄瓜叶片因发病干枯；而经生防菌处理过的黄瓜苗只有少部分叶片有发病症状。

实施例8枯草芽孢杆菌干粉水溶液(菌悬液)对鲜桃果实灰霉病的防治

(1)菌悬液的制备

同实施例1。

(2)病菌孢子悬液的制备

将长满桃灰霉的PDA平板中加入含0.01％吐温-80的无菌水，将孢子洗下，经四层纱布过滤得孢子悬液，血球计数板计数，孢子浓度为1×10⁴cfu/mL。

(3)刺伤接种

选择健壮、无机械损伤、新鲜、大小一致的桃子，先用2％的NaClO消毒，然后用无菌水冲洗干净，晾干后在每个桃子上用灭菌的接种针刺一个大小为5×3mm，深度为3mm的孔，孔中加入菌悬液20μL，2h后，每孔中再加入桃灰霉孢子20μL。以刺伤后接种无菌水，2h后再接种桃灰霉孢子处理为对照。每处理9个果，各三次重复。每9个果放入一个塑料筐中，25℃储藏。每天统计桃发病情况。

发病率％＝(发病水果数-该处理的总水果数)×100％

防效％＝[(对照发病率-处理发病率)/对照发病率]×100％

(4)结果

接种病菌4d后菌悬液仍能显著抑制病菌在刺伤处的蔓延生长；而清水处理的对照，所有桃子在刺伤接种的部位已经长出一个较大的病斑，且随时间的延长病斑直径继续增大。处理组6d后生防菌株的菌悬液仍能抑制病菌生长，没有灰霉病斑长出。菌悬液能显著降低灰霉病发病率，病菌接种4d后防效达90％以上，6d后的防效达到40％。

实施例9枯草芽孢杆菌菌悬液对小批量鲜桃贮藏保鲜效果试验

(1)菌悬液的制备

制备方法同实施例1。

(2)喷洒接种

选择健壮、无机械损伤、新鲜、大小一致的桃子，分别喷洒菌悬液，晾干后，单果用纸包裹放入纸箱中25℃储藏。每处理9个果实，三次重复。以不做任何处理为对照。随时观察发病情况，待有一部分果实发病时，统计发病情况，计算发病指数。

(3)病果分级标准

0级：无病斑               1级：病斑直径≤1.0cm

2级：病斑直径1.1-2.0cm    3级：病斑直径2.1-3.0cm

4级：病斑直径3.1-4.0cm    5级：病斑直径≥4.1cm

病情指数＝∑(各级腐烂数×该级代表数)/(总数×最高级代表数)

防效％＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％

(4)结果

菌悬液对桃储藏有明显的保鲜、防病效果。3d后的防效为92.8％，6d后防效为40.74％。

Claims (4)

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillius subtilis)菌株，其特征在于在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为：CGMCC No.1982。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株CGMCC No.1982的应用，其特征在于由该菌体制备的菌剂作为抗农作物病害、蔬菜病害的生防、促生剂及水果保鲜剂。

3.按权利要求2所述的枯草芽孢杆菌菌株CGMCC No.1982的应用，其特征在于所述菌剂为干粉菌剂，其组成为：湿菌体与碳酸钙的质量比为1∶1，菌剂的活芽孢数含量为200～500亿/克。

4.按权利要求2所述的枯草芽孢杆菌菌株CGMCC No.1982的应用，其特征在于所说的菌剂为干粉水溶液，其组成为干粉菌剂与水的质量体积比为1∶1000，菌悬液活芽孢数为1.0×10⁸cfu/mL。