CN106434445B - 一种枯草芽孢杆菌bs01、其菌剂及其在抑制水果采后病原菌中的应用 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌bs01、其菌剂及其在抑制水果采后病原菌中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)BS01、其菌剂及其在抑制水果采后病原菌中的应用，所述的枯草芽孢杆菌BS01，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2016年8月29日，保藏编号为GDMCC NO.60069。本发明所提供的枯草芽孢杆菌BS01菌株发酵液上清对采后水果病原菌，尤其是炭疽菌的离体抑菌活性可达90％以上，是优化前普通LB培养基发酵产生发酵液上清抑菌活性的3倍左右；以优化后发酵条件获得的BS01菌株发酵液上清对香蕉炭疽病、番茄炭疽病及鳄梨炭疽病等炭疽病的抑制作用都能达到65％以上的防效。

Description

一种枯草芽孢杆菌BS01、其菌剂及其在抑制水果采后病原菌 中的应用
技术领域
本发明涉及微生物学领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)BS01、其菌剂及其在抑制水果采后病原菌中的应用。
背景技术
炭疽菌(Colletotrichum spp.)是导致大多数果蔬采后病害的主要病原菌之一，其在芒果、番木瓜、鳄梨、番石榴、草霉等水果采后发生非常普遍，这些水果的采后损失大部分要归咎于包括炭疽菌在内的采后病原真菌所致的病害腐烂。目前防治采后病原真菌主要是采用针对甾醇合成的化学杀菌剂。然而，长期高频率地使用一类杀菌剂常引起病原菌的抗药性，已经导致防治效果下降，甚至失效。而且，化学杀菌剂的应用存在危害人体健康及污染环境等问题，因此有必要寻找新的安全且环境友好的生物防治制剂。
枯草芽孢杆菌是目前最为有效的防控植物病害的生防制剂。国外已有多个枯草芽孢杆菌生防菌株获得商品化生产应用许可。我国利用枯草芽孢杆菌现已成功开发并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗(B-908)、麦丰宁(B3)、纹曲宁等，其防治效果都在50％以上，主要用于农作物种植田间病害的防治。
目前，用于果实采后病原真菌病害控制方面的枯草芽孢杆菌制剂并不多见。CN1853489A公开的含有枯草芽孢杆菌(CCTCCM204085)发酵液和芽孢的防腐保鲜复配制剂在果实采后防腐保鲜方面的效果较好。CN101870959A公开的枯草芽孢杆菌菌株J18的发酵剂与氯化钙和壳聚糖混合制成干粉剂和被膜剂对多种水果的采后病害都有显著的防治效果。CN102851244A公开了一种防治香蕉冠腐病的芽孢杆菌菌株B28及其应用。CN104982516A公开的一种柑橘生物保鲜剂含有枯草芽孢杆菌R31。杨佐忠等利用枯草芽孢杆菌PRS5处理苹果和脐橙，也取得了较好的防腐保鲜效果(参见杨佐忠等，“枯草芽孢杆菌PRS5菌剂控制水果贮藏期病害的研究”，南京林业大学学报(自然科学版)，第30卷第1期，2006年1月)。因此，枯草芽孢杆菌在采后防腐保鲜方面具有很好的应用前景。
目前来看，已公布的枯草芽孢杆菌多数必须将发酵液及活菌体与化学防腐保鲜剂或其他抑菌活性物质复配才能产生良好的抑菌活性，以达到控制果实采后病害的目的。枯草芽孢杆菌活菌体的使用存在储存时间长活性降低、对环境的适应性不稳定、定殖困难防效不稳定、使用有效剂量大、抗菌谱较窄等问题。
由于枯草芽孢杆菌不同菌株的抑菌谱、抑菌作用效果等作用能力不同，差异也较大。因此分离获得新的高效菌株一直是枯草芽孢杆菌生防制剂开发应用中需要重点解决的问题，特别是筛选可在发酵过程中高产具有高效抑菌活性发酵液的菌株，以便将发酵液上清直接用于病害的防治，避免活菌体的使用存在的各种问题。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubstilis)BS01、其菌剂及其在抑制水果采后病原菌中的应用，本发明所提供的枯草芽孢杆菌BS01菌株发酵液上清对水果采后病原菌，尤其是炭疽菌的离体抑菌活性可达90％以上，是优化前普通LB培养基发酵产生发酵液上清抑菌活性的3倍左右；以优化后发酵条件获得的BS01菌株发酵液上清对番茄炭疽病、鳄梨炭疽病及香蕉炭疽病等炭疽病的抑制作用都能达到65％以上的防效。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)BS01，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期为2016年8月29日，保藏编号为GDMCC NO.60069。
本发明所述枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)BS01，其单个细胞呈椭圆到柱状，菌落细小圆形，表面光滑粘稠，无明显凸起，污灰色。
为进一步确定其分类学地位，扩增了BS01菌株的16S rDNA序列，经序列测定及同源性比对分析证明BS01为枯草芽孢杆菌，其16S rDNA序列(共1404bp)同已报导的多种枯草芽孢杆菌同源性达96.09％，BS01 16S rDNA序列及其与基因库中登记的枯草菌BS501(登录号：FJ755787)、PRE23(登录号：EU880528)、DN2.6(登录号：EU382218)和CU03(登录号：EF522122)的同源性比对结果如图6-1、图6-2和图6-3所示。
第二方面，本发明还提供了由第一方面所述的枯草芽孢杆菌BS01制备的复合微生物菌剂，具体可以是浓缩液、原液提取物、被膜剂等。其中浓缩液和原液提取物的制备方法可以是将由枯草芽孢杆菌BS01发酵得到的发酵液离心后去湿菌体得到的上清液，上清液经不同程度的蒸发、浓缩和干燥等工序得到，对于其蒸发浓缩干燥方法不作特殊限定；对于被膜剂的制备方法可以是，将由枯草芽孢杆菌BS01发酵得到的发酵液离心后去湿菌体得上清液，将上清液与果蜡、壳聚糖等成膜物质及其他果蔬保鲜功能组分复配制成的被膜剂，对于其具体的制备方法，本发明不作特殊限定。
第三方面，本发明还提供了如第一方面所述的枯草芽孢杆菌BS01的发酵培养方法，所述方法包括：取活菌浓度为1×107～1×108cfu/mL的枯草芽孢杆菌BS01种子液1～4mL，接种于培养基中进行摇瓶发酵培养；所述培养基由如下组分组成：每1000mL蒸馏水中含有葡萄糖1.0％～3.0％，细菌蛋白胨2.0％～3.0％，氯化钠0.5％～1.0％，pH值为7.0～8.0。其中的“％”表示质量百分含量。
本发明中对枯草芽孢杆菌BS01的发酵培养基组分及含量进行了优化，其中将培养基中的碳源、氮源和无机盐成分设置为葡萄糖1.0％～3.0％、细菌蛋白胨2.0％～3.0％和氯化钠0.5％～1.0％的组合，这三者之间具有协同增效作用，相比采用普通LB培养基(每1000mL水中含胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl 10g)，其发酵产生的发酵液上清抑菌活性可提高3倍左右，对炭疽菌的离体抑菌活性可达到90％以上。
本发明中，所述细菌蛋白胨是指市售的国产或进口peptone商品，国产的如环恺微生物产品，进口的如美国BD Difco品牌，法国Solabia品牌等等。
根据本发明，所述培养基中葡萄糖的质量百分含量为1.0％～3.0％，例如1.0％、1.1％、1.3％、1.5％、1.7％、1.8％、2.0％、2.1％、2.3％、2.5％、2.8％或3.0％；所述培养基中细菌蛋白胨的质量百分含量为2.0％～3.0％，例如2.0％、2.05％、2.1％、2.15％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％或3.0％；所述培养基中氯化钠的质量百分含量为0.5％～1.0％，例如0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％或1.0％。
根据本发明，所述培养基的pH值为7.0～8.0，例如7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。
根据本发明，所述培养基优选由如下组分组成：葡萄糖1.0％～3.0％，细菌蛋白胨2.0％～3.0％，氯化钠0.5％～1.0％和蒸馏水1000mL，pH值为7.0～8.0。
根据本发明，所述培养基进一步优选由如下组分组成：葡萄糖2.0％，细菌蛋白胨3.0％，氯化钠1.0％和蒸馏水1000mL，pH值为8.0。
本发明通过采用如上所述培养基的组分构成，其能够使获取的枯草芽孢杆菌BS01的发酵上清抑菌活性达到81％以上。
根据本发明，所述摇瓶发酵培养的条件为：起始培养基pH值7.0～8.0，接种量10～15％，装液量1/10～1/5，培养温度30～37℃，培养时间48h～60h，转速180rpm～220rpm。其中“起始培养基pH值”意指摇瓶发酵培养中所用培养基的起始pH值。
根据本发明，所述摇瓶发酵培养的条件中，所述起始培养基pH值为7.0～8.0，例如7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0；所述接种量为10～15％，例如10％、10.1％、10.3％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.2％、13.5％、14％、14.5％、14.8％或15％；所述装液量为1/10～1/5，例如1/10、1/9、1/8、1/7、1/6或1/5；所述培养温度为30～37℃，例如30℃、30.5℃、31℃、31.5℃、32℃、32.5℃、33℃、33.5℃、34℃、35℃、35.5℃、36℃、36.5℃或37℃；所述培养时间为48h～60h，例如48h、49h、50h、51h、53h、55h、56h、57h、58h、59h或60h；所述转速为180rpm～220rpm，例如180rpm、185rpm、190rpm、195rpm、200rpm、205rpm、210rpm、215rpm或220rpm。
根据本发明，所述摇瓶发酵培养的条件优选为：起始培养基pH值8.0，接种量10％，装液量1/5，培养温度35℃，培养时间60h，转速220rpm。
本发明通过对摇瓶发酵培养条件进行优化，能够进一步提高获取的枯草芽孢杆菌BS01的发酵液上清的抑菌活性，可使其高达99.34％以上。
前述发酵培养方法中，种子液的培养基和培养条件与摇瓶发酵的培养基和培养条件相同或不同，本领域技术人员根据公知的培养条件进行操作。
本发明所述枯草芽孢杆菌BS01的发酵培养方法，具体可以包括以下步骤：
(1)保存菌种的活化：枯草芽孢杆菌BS01菌株保存于超低温冰箱，菌种取出后在冰上解冻，然后用接种针取种在LB(每升含胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl 10g)平板上划线培养，1天后即长出BS01单菌落；
(2)种子液的制备：从上述LB固体平板上挑单菌落至50mL LB液体培养基，37℃，200rpm，培养24h后即为BS01发酵种子液；
(3)发酵培养：将上述制备的种子液用无菌水调整浓度为1×107～1×108cfu/mL，按10％～15％的比例转接至优化后的发酵培养基中；摇瓶的装液量为瓶容积的1/10～1/5，然后30～37℃，180rpm～220rpm，震荡培养48h～60h后即获得发酵液；5000～6000rpm离心15min～20min后去除湿菌体即获得发酵液上清。
其中，优化后的发酵培养基由以下组分组成：每1000mL蒸馏水含葡萄糖1.0％～3.0％，细菌蛋白胨2.0％～3.0％，氯化钠0.5％～1.0％，pH值为7.0～8.0。
根据本发明，所述发酵培养基的配置方法为：将各组分按比例称重后溶解于蒸馏水中，混合均匀后调pH值至7.0～8.0，24h内分装进行高压蒸汽灭菌。灭菌条件：压力0.1MPa，温度121℃，灭菌时间15～20min。灭菌后的培养基可暂时置于10℃下保存，应在1周内用完。
第四方面，本发明还提供了由第三方面所述的发酵培养方法获得的枯草芽孢杆菌BS01发酵液。
根据本发明，所述BS01菌株发酵液上清对胶胞炭疽菌的离体抑菌活性可达90％以上，是优化前普通LB培养基发酵产生发酵液上清抑菌活性的3倍左右；以优化后的发酵条件获得的BS01菌株发酵液上清对番茄炭疽病、鳄梨炭疽病及香蕉炭疽病的抑制作用都可达到65％以上的防效。
本发明所述枯草芽孢杆菌BS01菌株可在发酵过程中高产具高效抑菌活性发酵液，仅使用该枯草芽孢杆菌BS01菌株的发酵液上清就可有效防治炭疽菌的离体生长及活体诱导的果实炭疽病，避免活菌体的使用存在的储存时间长活性降低、对环境的适应性不稳定、定殖困难防效不稳定等各种问题；并且，发酵液上清制备方法简单、产业化成本低，有利于枯草芽孢杆菌BS01菌株的产业化开发应用，避免活菌体的干燥、储存、活化等制备步骤及其带来的问题。
第五方面，本发明还提供了如第一方面所述的枯草芽孢杆菌BS01、第二方面所述的复合微生物菌剂或第四方面所述的枯草芽孢杆菌BS01发酵液在抑制水果采后病原菌中的应用。
本发明中优选将所述枯草芽孢杆菌BS01、复合微生物菌剂以及枯草芽孢杆菌BS01发酵液应用于抑制水果采后炭疽菌中，对于炭疽菌的种类，例如可以是胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、香蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)等，本发明对于果蔬中的多种炭疽病菌均能达到同样的抑菌效果，在此不做特殊限定。虽然如此，本发明优选炭疽菌为胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、香蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)中的任意一种或其组合。
本发明对水果的种类不做特殊限定，例如可以是番石榴、番木瓜、芒果、番茄、香蕉、鳄梨等，其均能达到较好的防治效果。虽然如此，本发明优选水果为番茄、香蕉或鳄梨。
本发明获得的枯草芽孢杆菌BS01菌株发酵液上清对番茄炭疽病、鳄梨炭疽病及香蕉炭疽病等炭疽病的抑制作用都可达到65％以上的防效。
因此，本发明所提供的枯草芽孢杆菌BS01菌株是一株对果实采后炭疽菌具有很强的抑制作用的菌株。
与现有技术方案相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明所提供的枯草芽孢杆菌BS01菌株发酵液上清对胶胞炭疽菌的离体抑菌活性达90％以上，其对番茄炭疽病、鳄梨炭疽病及香蕉炭疽病的抑制作用都可达到65％以上的防效；
(2)本发明所提供的枯草芽孢杆菌BS01菌株发酵液上清，可避免活菌体的使用存在的储存时间长活性降低、对环境的适应性不稳定、定殖困难防效不稳定等各种问题；
(3)本发明提供的发酵液上清的制备方法简单、产业化成本低，有利于枯草芽孢杆菌BS01菌株的产业化开发应用，避免活菌体的干燥、储存、活化等制备步骤和带来的问题。
附图说明
图1是采用实施例12和对比例4提供的发酵液上清抑制胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)活性的对比；
图2是采用实施例12和对比例4提供的发酵液上清抑制香蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)活性的对比；
图3是采用实施例11提供的发酵上清液抑制香蕉炭疽病菌的效果图；
图4是采用实施例11提供的发酵上清液抑制番茄炭疽病菌的效果图；
图5是采用实施例11提供的发酵上清液抑制鳄梨炭疽病菌的效果图；
图6-1、图6-2和图6-3是枯草芽孢杆菌BS01的16S rDNA序列(共1404bp)及其与基因库中登记的枯草菌BS501(登录号：FJ755787)、PRE23(登录号：EU880528)、DN2.6(登录号：EU382218)和CU03(登录号：EF522122)的同源性比对结果。
下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：
实施例1
枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)BS01的分离与鉴定：
枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)BS01分离自广东东莞香蕉试验园的土壤中，根据其芽孢耐高温的原理进行分离，方法为：取表层5-10cm的土壤100g左右，装入纸制样品袋中带回实验室分离；称取土壤5g放入含有50mL水的三角瓶中，摇动片刻，然后慢慢加热至沸腾，沸腾15min后静置10min，取上层液100μL用无菌水做梯度稀释，然后分别吸取10-2和10-3稀释液200μL涂布到牛肉汤蛋白胨培养基上，置37℃培养2天后进行纯化；从平板上挑取单菌落中的部分菌体，在同样的培养基上进行多次划线培养，经菌落特征观察和镜检，确定是芽孢杆菌属纯种后，从中选择多株转接于牛肉膏蛋白胨斜面上保存。BS01为其中之一，经显微观察单个细胞呈椭圆到柱状，在LB培养基上菌落细小圆形，表面光滑粘稠，无明显凸起，污灰色。为进一步确定其分类学地位，扩增了BS01的16S rDNA序列(如图6-1、图6-2和图6-3的第一行核苷酸序列所示(SEQ ID No:1))，经序列测定及同源性比对分析证明BS01为枯草芽孢杆菌，其16S rDNA序列(共1404bp)同已报导的多种枯草芽孢杆菌同源性达96.09％，BS01 16SrDNA序列及其与基因库中登记的枯草菌BS501(登录号：FJ755787)、PRE23(登录号：EU880528)、DN2.6(登录号：EU382218)和CU03(登录号：EF522122)的同源性比对结果如图6-1、图6-2和图6-3所示；图6-1至图6-3分别是BS01 16SrDNA序列的1-437bp、438-937bp、及938-1404bp同其他四种枯草菌16S rDNA序列的同源性比对结果。
将枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)BS01保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期为2016年8月29日，保藏编号为GDMCC NO.60069。
实施例2
枯草芽孢杆菌BS01的发酵培养方法，包括以下步骤：
(1)保存菌种的活化：枯草芽孢杆菌BS01菌株保存于超低温冰箱，菌种取出后在冰上解冻，然后用接种针取种在LB(每升含胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl 10g)平板上划线培养，1天后LB上即长出BS01单菌落；
(2)种子液的制备：从上述LB固体平板上挑单菌落至50mL LB液体培养基，37℃，200rpm，培养24h后即为BS01发酵种子液；
(3)发酵培养：将上述制备的种子液用无菌水调整浓度为6.5×107cfu/mL，按10％比例转接至优化后的发酵培养基中；摇瓶的装液量为瓶容积的1/5，然后30℃，180rpm，震荡培养57h后即获得发酵液；6000rpm离心20min后去除湿菌体即获得发酵液上清；
其中，优化后的发酵培养基由以下组分组成：葡萄糖2.0％，细菌蛋白胨3.0％，氯化钠1.0％；
所述发酵培养基的配置方法为：将各组分按比例称重后溶解于蒸馏水中，混合均匀后调pH值至8.0，24h内分装进行高压蒸汽灭菌；灭菌条件：压力0.1MPa，温度121℃，灭菌时间15min。灭菌后的培养基可暂时置于10℃下保存，应在1周内用完。
实施例3
与实施例2相比，除将优化后的发酵培养基替换为如下组成外，其它与实施例2相同。
优化后的发酵培养基由以下组分组成：葡萄糖3.0％，细菌蛋白胨2.0％，氯化钠0.5％。
实施例4
与实施例2相比，除将优化后的发酵培养基替换为如下组成外，其它与实施例2相同。
优化后的发酵培养基由以下组分组成：葡萄糖3.0％，细菌蛋白胨3.0％，氯化钠1.0％。
实施例5
与实施例2相比，除将优化后的发酵培养基替换为如下组成外，其它与实施例2相同。
优化后的发酵培养基由以下组分组成：葡萄糖1.0％，细菌蛋白胨3.0％，氯化钠0.5％。
实施例6
与实施例2相比，除将优化后的发酵培养基替换为如下组成外，其它与实施例2相同。
优化后的发酵培养基由以下组分组成：葡萄糖1.0％，细菌蛋白胨2.0％，氯化钠0.5％。
对比例1
与实施例2相比，除将优化后的发酵培养基替换为如下的LB培养基外，其它与实施例2相同。
LB培养基由以下组分组成：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g。
对比例2
与实施例2相比，除将优化后的发酵培养基替换为如下组成外，其它与实施例2相同。
发酵培养基由以下组分组成：葡萄糖2.0％，胰蛋白胨3.0％，氯化钠1.0％。
对比例3
与实施例2相比，除将优化后的发酵培养基替换为如下组成外，其它与实施例2相同。
发酵培养基由以下组分组成：酵母提取物2.0％，细菌蛋白胨3.0％，氯化钠1.0％。
将上述实施例2-6和对比例1-3获得的发酵液上清测定抑菌活性，结果如表1所示。
表1
通过表1可以看出，与对比例1相比，实施例2-6获得的发酵液上清具有更高的抑菌活性，说明本发明通过对LB培养基的氮源和碳源进行优化，提高了枯草芽孢杆菌BS01发酵液上清的抑菌活性；与对比例2-3相比，实施例2-6获得的发酵液上清同样具有更高的抑菌活性，说明本发明通过对发酵培养基中的组分进行组合优化选择，同样提高了菌种发酵液上清的抑菌活性；与实施例3-6相比，实施例2所获得的发酵液上清具有最优的抑菌活性。
实施例7
与实施例2相比，除发酵培养条件采用如下操作外，其它与实施例2相同。
发酵培养条件：发酵培养基的起始pH值为7.0，按15％比例转接至优化后的发酵培养基中；摇瓶的装液量为瓶容积的1/7，然后32℃，220rpm，震荡培养48h后即获得发酵液。
实施例8
与实施例2相比，除发酵培养条件采用如下操作外，其它与实施例2相同。
发酵培养条件：发酵培养基的起始pH值为7.0，按10％比例转接至优化后的发酵培养基中；摇瓶的装液量为瓶容积的1/10，然后30℃，220rpm，震荡培养55h后即获得发酵液。
实施例9
与实施例2相比，除发酵培养条件采用如下操作外，其它与实施例2相同。
发酵培养条件：发酵培养基的起始pH值为8.0，按10％比例转接至优化后的发酵培养基中；摇瓶的装液量为瓶容积的1/10，然后30℃，220rpm，震荡培养55h后即获得发酵液。
实施例10
与实施例2相比，除发酵培养条件采用如下操作外，其它与实施例2相同。
发酵培养条件：发酵培养基的起始pH值为7.0，按15％比例转接至优化后的发酵培养基中；摇瓶的装液量为瓶容积的1/7，然后37℃，220rpm，震荡培养60h后即获得发酵液。
实施例11
与实施例2相比，除发酵培养条件采用如下操作外，其它与实施例2相同。
发酵培养条件：发酵培养基的起始pH值为8.0，按10％比例转接至优化后的发酵培养基中；摇瓶的装液量为瓶容积的1/5，然后35℃，220rpm，震荡培养60h后即获得发酵液。
将上述实施例7-11获得的发酵液上清测定抑菌活性，结果如表2所示。
表2
实施例7 实施例8 实施例9 实施例10 实施例11
平均抑菌率(％) 86.22 85.65 84.65 82.82 99.34
通过表2可以看出，与实施例7-10相比，实施例11所获得的发酵液上清具有更有的抑菌活性，说明本发明通过对发酵培养条件进行优化，可进一步提高发酵液上清的抑菌活性。
实施例12
与实施例2相比，采用的发酵培养基组成为：葡萄糖2％，细菌蛋白胨3％，氯化钠0.5％，pH值为7；发酵条件为：接种的种子液浓度为1×107cfu/mL，按10％比例转接至优化后的培养基中，装液量为摇瓶的1/5，温度32℃，200rpm，震荡培养60h后的发酵液上清。
对比例4
与实施例2相比，采用LB为发酵培养基，其组成为胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，按5％接种1×108cfu/mL的种子液，装液量为摇瓶的1/5，37℃，200rpm震荡培养48h的发酵液上清。
对照例
在M3S培养基上正常生长的胶胞炭疽病菌。
将上述实施例12和对比例4获得的发酵液上清分别测定对胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)及香蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)的抑菌活性，计算方法为(对照例菌圈平均直径-对比例4/实施例12菌圈平均直径)/对照例菌圈平均直径。结果如表3所示，其中实施例12和对比例4以及对照例获得的发酵液上清的抑菌圈如图1和图2所示。图1-2中的“对照”是采用对照例的发酵上清液获得的结果；“优化前”是指采用对比例4的发酵上清液获得的结果；“优化后”是指采用实施例12的发酵上清液获得的结果。
表3
由表3、图1和图2均可以看出，在对发酵培养基和培养条件进行优化后，相比采用对比例4的LB培养基和培养条件，实施例12获得的发酵液上清具有更高的抑菌活性，几乎完全抑制了两种所测炭疽菌的离体生长。对胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)来说，是优化前普通LB培养基发酵产生发酵液上清抑菌活性的3倍左右，对香蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)的抑制率也提高了20％以上。
实施例13
实施例11获得的发酵液上清抑制香蕉、番茄、鳄梨炭疽病菌的效果
表4和图3、图4、图5为香蕉、番茄、鳄梨经挑选及表面消毒后创伤接种炭疽病菌孢子液，放置过夜后用实施例11所采用的优化培养基及优化发酵条件获得的发酵液上清浸泡处理2～3min，然后贮藏在室温条件下观察统计果实炭疽病的发病情况。发病率＝发病的果实个数/处理的总果实个数，相对防治效果(％)＝(未处理对照病情指数-处理病情指数)/未处理对照病情指数X100。各处理病情指数＝100X∑(各级别病果数X各级别代表值)/(调查总果数X最高级代表值)。其中化学杀菌剂是采用珠海真绿色技术有限公司的保鲜剂产品，为咪酰胺和抑霉唑的混合悬浊液。
表4
通过表4和图3、图4、图5都可以看出，采用实施例11所获得的优化发酵液上清处理接种有炭疽菌的香蕉、番茄和鳄梨，均可显著抑制炭疽病病斑的扩展，相对防治效果在65％以上，并可显著降低果实炭疽病菌的发病率。
综合上述结果可以看出，本发明所提供的枯草芽孢杆菌BS01菌株发酵液上清对胶胞炭疽菌的离体抑菌活性可高达90％以上，其对番茄炭疽病、鳄梨炭疽病及香蕉炭疽病的抑制作用都可达到65％以上的防效；而且，本发明所提供的枯草芽孢杆菌BS01菌株发酵液上清，可避免活菌体的使用存在的储存时间长活性降低、对环境的适应性不稳定、定殖困难防效不稳定等各种问题。由于菌种发酵液上清的制备方法简单、产业化成本低，有利于枯草芽孢杆菌BS01菌株的产业化开发应用，避免活菌体的干燥、储存、活化等制备步骤和带来的问题。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (6)

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)BS01的发酵液，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌BS01保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2016年8月29日，保藏编号为GDMCC NO.60069；
所述的枯草芽孢杆菌BS01的发酵培养方法包括：取活菌浓度为1×107～1×108cfu/mL的枯草芽孢杆菌BS01种子液1～4mL，接种于培养基中进行摇瓶发酵培养；所述培养基由如下组分组成：葡萄糖1.0％～3.0％，细菌蛋白胨2.0％～3.0％，氯化钠0.5％～1.0％和蒸馏水1000mL，pH值为7.0～8.0。
2.如权利要求1所述的发酵液，其特征在于，所述摇瓶发酵培养的条件为：起始培养基pH值7.0～8.0，接种量10％～15％，装液量1/10～1/5，培养温度30～37℃，培养时间48h～60h，转速180rpm～220rpm。
3.如权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌BS01的发酵液在抑制水果采后病原菌中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述水果采后病原菌为炭疽菌。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述炭疽菌为胶胞炭疽菌、香蕉炭疽菌中的任意一种或其组合。
6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述水果为番茄、香蕉、番石榴、番木瓜、芒果和鳄梨中的至少一种。
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