CN105494445A - 一种防治辣椒枯萎病制剂和应用 - Google Patents

一种防治辣椒枯萎病制剂和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种防治辣椒枯萎病制剂和应用。该制剂的活性成分为一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus？amyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCC？No.5722的发酵液。本发明制剂同时具有促生长和防病作用，能显著地抑制植物真菌的生长，对植物真菌如辣椒黒斑病菌、辣椒枯萎病菌的生长抑制率达62.44％～77.33％，对辣椒枯萎病菌的防治效果达53.75％～68.54％。本发明制剂是一种无毒、无污染、无残留，对人畜安全，对生态环境友好的微生物产品。

Description

一种防治辣椒枯萎病制剂和应用
技术领域
本发明涉及辣椒枯萎病的防治，具体的说是一株解淀粉芽孢杆菌的制剂及其对辣椒枯萎病的防治应用。
背景技术
辣椒枯萎病，又称辣椒萎蔫病，是由半知菌亚门尖孢镰刀菌(FusariumOxysporium)侵染引起的，是一类毁灭性的世界土传植物病害，其分布广、危害重，主要危害辣椒根茎部维管束，病部变褐，最后导致全株性枯萎死亡。该病在国外早有报道，20世纪50年代在我国由俞大绂首次报道。近年来，在全国各地普遍发生，已成为大棚辣椒栽培中的主要病害之一，并且越来越重，该病发病率一般为15％～30％，严重时达70％～80％，甚至全田枯萎死亡，给产量造成了很大损失，成为辣椒生产上的一大障碍因素。多年来，人们尝试用晒田和抗病品种等多种不同方法控制枯萎病的发生及流行，但效果甚微。传统化学药剂，如敌克松、五氯硝基苯、多菌灵等，虽能达到防治该类病害的目的，但同时也带来了抗药性和环境污染等一系列问题，这不仅影响人类健康，而且严重威胁整个生态系统。土传病害病原菌寄生于土壤中，化学农药一般难以从根本上控制其危害。因此，寻找安全有效的防治措施成为一个亟待解决的问题。生物防治可以克服化学农药所带来的弊病，具有无毒、无公害、无污染、不易产生抗药性等优点，不仅符合人们对绿色食品的需求，而且为农业的可持续发展提供保障，因此，生物防治已成为辣椒枯萎病防治的重要研究领域。在用于植物病害防治的生防菌中，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的研究很多，不仅有促生长作用，而且能产生多种抑菌相关的代谢产物，对真菌和细菌都具有强烈的抑制作用，具有实际应用的潜力。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)是芽孢杆菌属中的一个种，是土壤和植物微生态的优势群，也是一种有益微生物。具有较强的次级代谢产物的生产能力，可分泌植物生长激素(如吲哚乙酸)，促进植物生长；可分泌植酸酶和有机酸，降解土壤中植酸及矿质磷；可以产生多种抑菌相关的代谢产物(如蛋白酶，杆菌素、杆菌烯、风齐素，大环内酯等)，对真菌和细菌都具有强烈的抑制作用，具有实际应用的潜力。
发明内容
本发明目的是提供一种效果特别显著的防治辣椒枯萎病的制剂和应用。
本发明的技术方案如下：
1.一种防治辣椒枯萎病制剂，它的活性成分为一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的发酵液。
2.根据技术方案1所述的一种防治辣椒枯萎病制剂，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的发酵液通过以下方法制备得到：
(1)将所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722活化后，按5～10％接种量，将活化的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722接种到种子培养基，在培养温度35℃、转速120rpm/min条件下，摇床培养36～48h，得到一级种子液，所述种子培养基为液体LB培养基，pH7.0～7.2；
(2)按10～12％接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在28～37℃，转速100rpm/min，通气量为1000L/h，罐压保持在0.02～0.03MPa条件下培养36～48h，得到二级种子液；所述二级种子培养基由以质量分数计的以下成分组成：淀粉1.5～3％，麸皮粉1～2％，酵母膏0.05～0.3％，蛋白胨0.5～1％，磷矿粉1～2％，MgSO4·7H2O0.01～0.05％，CaCl20.1～0.4％，(NH4)2SO40.01～0.04％，余量为水，pH7.0～7.2；
(3)按10～12％接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基，在28～37℃，转速100rpm/min，通气量为10000L/h、罐压保持在0.02～0.03MPa条件下培养48～72h，培养后的发酵液中解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的有效活菌数≧1×1010cfu/ml时，该发酵液即为所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的发酵液，所述发酵培养基与步骤(2)所述二级种子培养基相同。
3.技术方案1或2所述的防治辣椒枯萎病制剂在防治辣椒枯萎病上的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明防治辣椒枯萎病制剂同时具有促生长和防病作用，在防治植物真菌病害的应用方面，能显著地抑制植物真菌的生长，对辣椒枯萎病菌的防治效果达53.75％～68.54％，对枯萎病的防效是预防效果均优于治疗效果，表明制剂增强了植物抗病能力，细菌在根系大量繁殖，在一段时间内成为根系的优势菌群，抑制和减少了病原微生物的滋生，起到防病作用，可以作为防治植物真菌病害的微生物制剂。
2、本发明制剂是一种无毒、无污染、无残留，对人畜安全，对生态环境友好的微生物产品。
本发明所述的解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensYN2010-KC于2012年1月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.5722，并于2012年1月12日检测为存活。该普通微生物中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编:100101。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明，各实施例无特殊说明为常规方法。
实施例1解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KC的获得、鉴定和保藏
1、本发明解淀粉芽孢杆菌YN2010-KC的获得
1.1材料
采自云南农业大学后山农场玉米根际周围的土壤。
1.2培养基制备
将LB固体培养基和PSA培养基(马铃薯蔗糖琼脂培养基)融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却，制成LB和PSA平板。
1.3分离培养
采用稀释平皿分离法和平板划线分离，将分离纯化所得的一菌株命名为YN2010-KC。
2、解淀粉芽孢杆菌YN2010-KC的鉴定
2.1、形态学鉴定
取菌株YN2010-KC在LB培养基上培养，37℃培养36小时，进行形态观察鉴定，菌体为杆状、端圆，周生鞭毛、具运动性，产生椭圆形芽孢；在LB和PSA平板上菌落圆形、淡茶褐色、菌落中央颜色略深、隆起、表面干燥有褶皱。与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著，科学出版社，2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株YN2010-KC属于芽孢杆菌(Bacillusspp.)。
2.2、生理生化鉴定
菌株革兰氏染色、芽孢染色、淀粉水解、葡萄糖利用、柠檬酸盐利用、V-P反应、接触酶反应、硝酸盐还原、明胶液化等均呈阳性。
3、解淀粉芽孢杆菌YN2010-KC的保藏
经上述鉴定表明所分离获得的菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，其代号为YN2010-KC，所述的解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensYN2010-KC于2012年1月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.5722，并于2012年1月12日检测为存活。该普通微生物中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编:100101。
实施例2本发明防治辣椒枯萎病制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)一级种子液制备
将-80℃保存的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722接种在液体LB培养基上，28～37℃培养24-36h，得活化的菌种。按10％接种量，将活化的所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722接种到种子培养基，在培养温度35℃、转速120rpm/min条件下，摇床培养36h，得到一级种子液，所述种子培养基为液体LB培养基，pH7.0～7.2；
(2)按10％接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在35℃，转速100rpm/min，通气量为1000L/h，罐压保持在0.02～0.03MPa条件下培养36～48h，得到二级种子液；所述二级种子培养基由以质量分数计的以下各成分组成：淀粉2％，麸皮粉1％，酵母膏0.3％，蛋白胨0.5％，磷矿粉1％，MgSO4·7H2O0.02％，CaCl20.25％，(NH4)2SO40.03％，余量为水，pH7.0～7.2；所述二级种子培养基于121℃灭菌30min，待降温至30℃，接入一级种子液。
(3)按10％接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基，在35℃，转速100rpm/min，通气量为10000L/h、罐压保持在0.02～0.03MPa条件下培养48～72h，培养后的发酵液中解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的有效活菌数≧1×1010cfu/ml时，将发酵液用医用塑料瓶包装，即为所述本发明防治辣椒枯萎病制剂，存放于通风干燥处。所述发酵培养基与步骤(2)所述二级种子培养基相同。
本发明防治辣椒枯萎病制剂通过实施例2所述的本发明防治辣椒枯萎病制剂的制备方法制备得到。
实施例3本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722对辣椒多种病原菌的拮抗作用
采用平皿对峙培养法，测试解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722对辣椒黑斑病菌(Alternariaalternata)、辣椒枯萎病菌(Fusariumoxysporum)2种病原菌的拮抗效果，在直径9cm的PSA平板中央接入直径5mm的病原真菌菌饼，再按十字交叉位置在距离菌饼3cm处点接种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722。将培养皿倒置于25℃下培养。待对照菌落直径达9cm后，测量抑菌带宽度，用十字交叉法测定处理的菌落直径，计算菌落生长抑制率。试验重复3次。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722对上述2种病原真菌的生长有不同程度抑制作用见表1，对上述2种病原菌的抑制效果均达到62.44％以上。辣椒黑斑病菌(Alternariaalternata)、辣椒枯萎病菌(Fusariumoxysporum)均可从上述中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心买到。
表1本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722对辣椒病原菌的抑制作用
实施例4本发明防治辣椒枯萎病制剂对辣椒枯萎病的盆栽防治试验
辣椒种子经表面消毒后密播于灭菌的红壤土中，至5叶期当苗高约10cm时将植株拔出并浸根部于浓度为1×105cfu/mL的辣椒枯萎病病菌孢子悬浮液30min，再将其移栽到盛有灭菌红壤土的塑料杯中按单株种植。
试验设预防、治疗和对照3种处理。预防即病菌浸根后随即浇灌本发明防治辣椒枯萎病制剂的400倍稀释液(其有效活菌数2.5×107cfu/ml)，每杯5mL。治疗即3d后施入同量稀释液。对照用液体LB培养基代替，其他同预防。各处理及对照用苗100株，3次重复。观察和记录始病期，15d后调查病情。本发明防治辣椒枯萎病制剂对枯萎病的始病期可延后2d～5d，与对照比，发病率降低了60.69～70.19％，病害的防效达53.75％～68.54％，对枯萎病的防效是预防效果均优于治疗效果(表2)。
表2本发明防治辣椒枯萎病制剂对辣椒枯萎病盆栽防治效果
注：不同的小写字母表示在α＝0.05水平上差异显著，不同的大写字母表示在α＝0.01水平上差异极显著。
实施例5：本发明防治辣椒枯萎病制剂定殖能力测定
以辣椒为试验材料，采用盆栽试验检测本发明防治辣椒枯萎病制剂在辣椒根际、根表、根内定殖量，每盆浇灌本发明防治辣椒枯萎病制剂100倍液50毫升(其有效活菌数1×108cfu/ml)，施入后，于播种后第10天开始取样，每5d取样1次，共取7次，采用稀释平板法测定根际、根表、根内中微生物的定殖数量，自然土和灭菌土根际的定殖密度分别达1.68×103～1.91×104cfu/g和4.09×103～1.94×104cfu/g，根表分别达2.50×103～2.15×104cfu/g和6.44×103～3.08×104cfu/g，根内达3.33×102～1.04×104cfu/g和5.76×103～2.00×104cfu/g。
根部定殖试验中，本发明防治辣椒枯萎病制剂能在根部很好定殖，表明本发明防治辣椒枯萎病制剂中菌株生活力强并能与辣椒很好亲和。随着出苗和植株生长的加快，其菌株可从植株处如根系分泌物中获得营养而实现增殖。定殖密度大致表现为根表＞根际＞根内，这是由于根系分泌了某些营养物质等，使接种菌株在根系较近的部位形成了优势菌群。而灭菌土中的定殖密度要高于自然土壤，是由于避免了同土壤中土著菌株发生竞争的结果。

Claims (3)

1.一种防治辣椒枯萎病制剂，其特征在于：它的活性成分为一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的发酵液。
2.根据权利要求1所述的一种防治辣椒枯萎病制剂，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的发酵液通过以下方法制备得到：
(1)将所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722活化后，按5～10％接种量，将活化的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722接种到种子培养基，在培养温度35℃、转速120rpm/min条件下，摇床培养36～48h，得到一级种子液，所述种子培养基为液体LB培养基，pH7.0～7.2；
(2)按10～12％接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在28～37℃，转速100rpm/min，通气量为1000L/h，罐压保持在0.02～0.03MPa条件下培养36～48h，得到二级种子液；所述二级种子培养基由以质量分数计的以下成分组成：淀粉1.5～3％，麸皮粉1～2％，酵母膏0.05～0.3％，蛋白胨0.5～1％，磷矿粉1～2％，MgSO4·7H2O0.01～0.05％，CaCl20.1～0.4％，(NH4)2SO40.01～0.04％，余量为水，pH7.0～7.2；
(3)按10～12％接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基，在28～37℃，转速100rpm/min，通气量为10000L/h、罐压保持在0.02～0.03MPa条件下培养48～72h，培养后的发酵液中解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的有效活菌数≧1×1010cfu/ml时，该发酵液即为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的发酵液，所述发酵培养基与步骤(2)所述二级种子培养基相同。
3.权利要求1或2所述的防治辣椒枯萎病制剂在防治辣椒枯萎病上的应用。
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