KR20120030630A - 신규한 바실러스 아밀로리퀴에파션스 ｊｂｃ36 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물 - Google Patents

신규한 바실러스 아밀로리퀴에파션스 ｊｂｃ36 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 병원균에 길항효과를 나타내는 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P 균주)에 관한 것이다. 본 발명의 신규 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 균주는 광범위한 진균성 병원균에 대하여 길항효과가 있으며, 특히 과일류의 녹색곰팡이병과 푸른곰팡이병에 대해 방제효과가 뛰어나기 때문에, 본 균주 또는 그 배양액은 감귤과 배, 사과 등의 저장 및 유통 중에 발생하는 여러 가지 병해를 방제하는데 유용하게 이용할 수 있다.

Description

신규한 바실러스 아밀로리퀴에파션스 ＪＢＣ36 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물{Bacillus amyloliquefaciens JBC36 and composition comprising the same for control of plant pathogens}
본 발명은 장기간 저장 후 유통을 하는 과일류에서 피해가 심한 녹색곰팡이병, 푸른곰팡이병, 잿빛곰팡이병 등에 대한 방제효과가 우수한 바실러스 아밀로리퀴에파션스 균주 및 이를 유효성분으로 하는 식물 병원균 방제용 조성물에 관한 것으로, 동 균 및 동 균이 생산하는 물질을 유효성분으로 하는 미생물의 제제화 방법과 수확 후 진균병해 방제를 위한 전문 약제로의 활용에 관한 것이다.
최근에 시설 재배를 이용한 채소, 과일 및 화훼의 재배 면적이 점차 증가하고 있다. 그러나 우리나라의 시설재배는 대부분 소규모이고 영세하며 단경기에 높은 가격을 목표로 한 생산에 비중을 두고 있어 겨울철 난방비의 지출을 극도로 제한하기 때문에 환기 불량에 의한 시설 내의 다습조건으로 작물에 많은 병해가 발생되어 수량과 품질저하를 가져오는데, 주요 진균 병해로는 잿빛곰팡이병, 역병, 겹무늬병, 시들음병 등 18종이 보고되어 있다. 특히, 비닐하우스에서 잿빛곰팡이병이 많은 피해를 주고 있으며, 기주 범위가 넓어 거의 모든 작물에 병을 일으키는데, 시설원예작물과 과수에도 큰 피해를 주며, 특히 과일의 경우 저장, 수송에 병이 한 번 발생하면 빠른 속도로 전파되어 그 경제적 손실이 매우 크다.
진균의 방제를 위해 재배환경을 개선해 주는 물리적 방법, 살균제를 이용한 화학적 방법 및 미생물을 이용한 미생물학적 방법 등으로 나누어 방제할 수 있다. 그러나 물리적 방제만으로는 큰 효과를 기대할 수 없으며, 화학적 방제는 최근 약제 저항성 균의 출현으로 포장에서의 방제효과가 크게 저하되었을 뿐만 아니라, 화학농약의 다량 살포에 의한 인체에 대한 잔류 독성 및 잔류 농약에 의한 심각한 환경 오염으로 이의 대체 방안으로 미생물학적 방제에 관한 연구가 최근 활발하게 진행되어 오고 있으며, 환경친화적 농업을 위한 미생물농약에 관한 연구에 주목하고 있다.
현재 미생물농약으로 특허 등록된 살균제용 미생물로 세균류에는 바실러스 속 (Bacillus sp. BS555, KCTC 8821P), 바실러스 폴리목사 (Bacillus polymoxa B36, ferm bp-6068), 슈도모나스 오레오파시엔스 (Pseudomonas aureofaciens B5, FERM BP-6067), 엔테로박터 클로아제 (Enterobacter cloase B51, FERM BP-6069) 및 항진균 물질을 분비하는 방선균인 스트렙토마이세스 속의 Bom1 (KFCC 10992호), Bom2 (KFCC 10993호) 등이 있다. 또한 병원성 진균에 대한 길항능력을 갖는 미생물로 바실러스 서브틸리스 바 아밀로리크파시엔스 (Bacillus subtilis var. amyloliquefaciens Kl114, KCTC 8913P), 알칼리진스 파에칼리스 (Alcaligenes faecalis KL1179, KCTC 8914P), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa KL1121, KCTC 8915P), 슈도모나스 아우란티아카 (Pseudomonas aurantiaca KL1326, KCTC 8916P) 등이 있다.
상기와 같이 국내에서는 작물의 병해방제용 균주 및 이를 함유하는 미생물제제에 관한 다수의 특허가 등록되어 있고, 포장에서 과수 병해 방제용 미생물 살균제 등에 관한 결과가 보고되어 있으나, 아직 바실러스 아밀로리퀴에파션스 (Bacillus amyloliquefaciens)를 이용한 수확 후 병원균 제어를 위한 생물농약은 개발 또는 상용화된 것이 없을 뿐만 아니라 과일의 저장 및 유통 중에 발생하는 병해의 방제에 관한 특허도 없는 실정이다.
한편, 감귤은 지역경제 활성화에 크게 기여하고 있으며, 국내외 소비자들이 고급상품부터 일반적인 상품까지 광범위하게 즐겨 찾는 과일류이다. 그러나 생산 후 유통까지의 저장기간이 비교적 긴데 반하여, 저장 중 페니실리움 디지타툼 (Penicillium digitatum)에 의한 녹색곰팡이병, 페니실리움 이탈리쿰 (Penicillium italicum)에 의한 푸른곰팡이병, 보트리티스 시네리아 (Botrytis cinerea)에 의한 잿빛곰팡이병, 다이아포티 시트리 (Diaporthe citri)에 의한 꼭지썩음병 등에 의한 부패에 의한 손실이 크고, 이의 방제를 위해 사용하는 약제로 인해 안전성이 위협을 받을 수 있다.
또한, 저장기간이 비교적 긴 배와 사과 등에도 페니실리움 엑스펜섬 (Penicillium expansum)에 의한 푸른곰팡이병과 보트리티스 시네리아 (Botrytis cinerea)에 의한 잿빛곰팡이병에 의한 피해가 심하며, 초봄에 수확하여 다음해 파종까지 종구로 보존하는 마늘에서도 페니실리움 히써툼 (Penicillium hirsutum)에 의한 푸른곰팡이병, 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum)에 의한 마른썩음병 등에 의한 피해가 심하여 막대한 피해를 끼치고 있다.
따라서 수확 후 발생하여 생산농가에 심각한 피해를 입히는 진균류의 방제를 위해 미생물농약의 개발이 절실히 필요한 실정이다. 전 세계 생물농약 시장의 규모는 2005년 672백만 달러 (전체 농약시장의 2.51%, The New Pesticide Market. 2006)에 달하며, 귤, 배 등의 과일류는 주년 공급을 위해 저장이 증가되면서 푸른곰팡이병, 잿빛곰팡이병, 과피얼룩증상 등에 의한 수량과 품질의 저하가 심하고 (과일 부패율(%) : 감귤 10-30%, 배 5-20%), 화학약제에 대한 내성균의 출현 및 건강에 대한 관심으로 인해 그 사용량 및 필요성이 증가하고 있어 미생물을 이용한 대체 방제법이 실용화될 경우 그 수요가 높을 것이다.
이에 본 발명자는 상기한 국가적 필요성과 문제점을 해결하기 위하여 고안된 것으로써, 광범위한 진균성 병원균에 대하여 억제효과를 보이는 신규 바실러스 아밀로리퀴에파션스를 분리 및 동정하고, 상기 균주 또는 이들의 배양물이 과일류의 병해를 방제하는데 유용함을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은
식물 병원균에 길항효과를 나타내는 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P)을 제공한다.
또한, 본 발명은
바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P) 균주의 배양액으로부터 분리하여 얻은 식물 병원균 천연길항물질을 제공한다.
또한, 본 발명은
바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P) 균주 또는 동 균주의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P) 균주를 이용한 식물 병원균 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 신규 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 균주는 광범위한 진균성 병원균에 대하여 길항효과가 있으며, 특히 과일류의 녹색곰팡이병과 푸른곰팡이병에 대해 방제효과가 뛰어나기 때문에, 본 균주 또는 그 배양액은 감귤과 배, 사과 등의 저장 및 유통 중에 발생하는 여러 가지 병해를 방제하는데 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 신규 균주의 주요 병원균에 대한 길항력을 보여주는 사진이다 ((A) P. digitatum , (B) P. italicum , (C) P. expansum , (D) D. citri , (E) B. cinerea , (F) A. alternata , (G) P. citrophthora , (H) C. gloeosporioides , (I) G. candidum , (J) F. graminiarum).
도 2는 본 발명의 신규 균주처리에 의한 감귤 생체에서의 녹색곰팡이병 (왼쪽)과 푸른곰팡이병 (오른쪽) 발병율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발병의 신규 균주처리에 의한 감귤 녹색곰팡이병균 (왼쪽)과 푸른곰팡이병균 (오른쪽)의 포자발아 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발병의 신규 균주처리에 의한 감귤 녹색곰팡이병균 (왼쪽)과 푸른곰팡이병균 (오른쪽)의 균사생장 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발병의 신규 균주가 생산한 천연길항물질의 pH변화에 대한 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발병의 신규 균주가 생산한 천연 길항물질의 온도 변화에 대한 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 신규 균주를 유효성분으로 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물의 처리에 의한 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 신규 균주를 유효성분으로 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물을 감귤에 처리한 후 방제효과를 살펴본 사진이다 .
도 9는 본 발명 신규 균주 및 키토산을 유효성분으로 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물의 처리에 의한 방제효과를 나타낸 그래프이다 .
본 발명은 식물 병원균에 길항효과를 나타내는 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P)을 제공한다.
상기 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 균주는, 특히 감귤관련 녹색곰팡이병 및 푸른곰팡이병에 대하여 탁월한 방제효과를 보이는 것으로 분리 및 동정된 신규한 균주로서, 2010.09.01일자로 KACC 91582P의 수탁번호를 부여받았다.
상기 균주는 감귤, 배, 사과 등과 같은 과일류 및 마늘, 고추 등과 같은 채소류에 병을 일으키는 병원균에 대하여 우수한 길항효과를 나타낸다.
상기 균주가 방제효과를 나타내는 병원균으로는 녹색곰팡이병균, 푸른곰팡이병균, 잿빛곰팡이병균, 꼭지썩음병균, 마른썩음병균, 검은썩음병균, 역병균, 탄저병균 및 흰곰팡이병균 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
더욱 상세하게는 녹색곰팡이병균인 페니실리움 디지타툼 (Penicillium digitatum), 푸른곰팡이병균인 페니실리움 이탈리쿰 (Penicillium italicum) 및 페니실리움 엑스펜섬 (Penicillium expansum), 꼭지썩음병균인 다이아포티 시트리 (Diaporthe citri), 잿빛곰팡이병균인 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 마름썩음병균인 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum), 검은썩음병균인 알터나리아 알터나타 (Alternaria alternata), 역병균인 피토프토라 시트로프토라 (Phytophthora citrophthora) 및 피토프토라 카프시시 (Phytophthora capsici), 탄저병균인 콜렉토트리큠 아쿠타튬 (Colletotrichum acutatum) 및 흰곰팡이병균인 제오트리쿰 칸디듐 (Geotrichum candidum) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P)은 과일류의 진균관련 식물 병에 탁월한 방제효과를 가지고 있으며, 특히 감귤관련 페니실리움 디지타툼 (Penicillium digitatum)에 의해 발생하는 녹색곰팡이병 및 페니실리움 이탈리쿰 (Penicillium italicum)에 의해 발생하는 푸른곰팡이병을 예방하는 생물농약의 미생물제제로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P) 균주의 배양액으로부터 분리하여 얻은 식물 병원균 천연길항물질을 제공한다.
상기 천연길항물질은 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P) 균주를 배양하여 배양액을 형성하는 단계; 상기 배양액으로부터 본 균주를 제거하는 단계; 및 균주가 제거된 배양액에 추출용매를 처리하여 단백질을 추출하는 단계를 통하여 얻어질 수 있다.
상기 추출용매는 알코올일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올일 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 균주가 제거된 배양액 및 에탄올을 1:10의 부피비로 혼합하여 반응시킨 후, 단백질을 침전시키고 용액을 증발 건조시킴으로써 본 발명의 식물 병원균을 억제하는 천연길항물질인 단백질을 얻을 수 있었다.
본 발명은 또한 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P) 균주 또는 동 균주의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P) 균주 또는 동 균주의 배양액 외에 유효성분으로 키토산을 더 포함할 수 있다.
상기 조성물은 감귤, 배, 사과 등과 같은 과일류 및 마늘, 고추 등과 같은 채소류에 병을 일으키는 병원균에 대하여 우수한 길항효과를 나타낸다.
상기 조성물이 방제효과를 나타내는 병원균으로는 녹색곰팡이병균, 푸른곰팡이병균, 잿빛곰팡이병균, 꼭지썩음병균, 마른썩음병균, 검은썩음병균, 역병균, 탄저병균 및 흰곰팡이병균 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
더욱 자세하게는 녹색곰팡이병균인 페니실리움 디지타툼 (Penicillium digitatum), 푸른곰팡이병균인 페니실리움 이탈리쿰 (Penicillium italicum) 및 페니실리움 엑스펜섬 (Penicillium expansum), 꼭지썩음병균인 다이아포티 시트리 ( Diaporthe citri), 잿빛곰팡이병균인 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 마름썩음병균인 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum), 검은썩음병균인 알터나리아 알터나타 (Alternaria alternata), 역병균인 피토프토라 시트로프토라 (Phytophthora citrophthora) 및 피토프토라 카프시시 (Phytophthora capsici), 탄저병균인 콜렉토트리큠 아쿠타튬 (Colletotrichum acutatum) 및 흰곰팡이병균인 제오트리쿰 칸디듐 (Geotrichum candidum) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 식물 병원균 방제용 조성물은 미생물제제로 생물농약일 수 있다.
본 발명에 따른 식물 병원균 방제용 조성물은, 과일류의 진균관련 식물병에 탁월한 방제효과를 가지고 있으며, 특히 감귤관련 페니실리움 디지타툼 (Penicillium digitatum)에 의해 발생하는 녹색곰팡이병 및 페니실리움 이탈리쿰 (Penicillium italicum)에 의해 발생하는 푸른곰팡이병을 예방하는 효과가 탁월하다. 또한 본 발명에 따른 식물 병원균 방제용 조성물은 미생물을 원료로 사용하였기 때문에 이를 생물농약으로 이용하는 경우 화학성분의 농약과 같은 인체 잔류 및 환경 파괴의 문제가 없어 환경 친화적인 이점을 갖는다.
본 발명에 따른 식물 병원균 방제용 조성물은 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P) 균주를 포함하여 당업계에 통상 이용되는 방제용 조성물 (미생물 제제) 제조방법을 통해서 제조될 수 있다.
예를 들면, 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P) 균주에 카나바우 왁스 (canauba wax, 0.007%) 및 보조제를 첨가하여 액제 형태로 제제화하는 방법으로 제조될 수 있으며, 또는 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P) 균주의 배양액 또는 이의 건조분말 또는 이들의 혼합물 0.001 내지 99.9중량% 및 잔량으로서 1종 이상의 부재를 혼합하여 제조될 수 있다.
상기 부재는 계면활성제, 결합제, 자외선차단제, 부패방지제, 안정제, 보조제, 미생물의 영양원 및 증량제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P)균주를 이용한 식물 병원균 방제 방법을 제공한다.
상기 식물 병원균 방제 방법은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P) 균주에 보조제를 첨가하여 액제 형태로 제제화 한 후, 방제효과를 갖게 하고자 하는 식물에 코팅 처리하는 과정으로 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
실시예 1. 본 발명의 신규한 근권 미생물 분리 및 동정
본 발명의 신규한 균주는 제주도의 감귤 재배 과수원의 토양에서 채취한 샘플에서 희석 평판법에 의하여 분리한 후 20% 글리세롤이 함유된 LB (Luria Bertani) 배지에 넣어 -80에 보관하였다. 선발한 균주의 동정은 바이오로그 시스템 (Biolog system)을 이용한 탄소원 이용정도, 미디 시스템 (MIDI system)을 이용한 세포막의 지방산 메틸 에스테르 분석, 16S rDNA를 통한 염기서열의 상동성 분석 및 바실러스속 균의 정확한 동정을 위해 사용되는 API 50HB 키트를 이용하여 영양원 이용정도를 조사하였다. 선발한 균주의 그람 테스트 결과 Gram(+)로 확인되었고, 주요 동정결과 및 특성은 아래와 같다.
Biolog, MIDI 및 16S rDNA를 통한 동정결과 요약
Gram
test		 동 정 결 과
Biolog MIDI 16S rDNA
+ B. amyloliquefaciens Bacillus sp. B. amyloliquefaciens
발명한 균주의 표현형적 특성
구 분 특 성 구 분 특 성
형 태 간상 7% NaCl에서의 생육 +
형기적 생육 + 40℃에서의 생육 +
호기적 생육 +
API 50CHB 키트를 이용한 실험결과
영양원 결과 영양원 결과
Glycerol + D-Celiobiose +
Erythritol - D-Maltose +
D-Arabinose - D-Lactose +
L-Arabinose + D-Melibiose +
D-Ribose + D-Saccharose +
D-xylose - D-Trehalose +
L-xylose - Inulin -
D-Adonitol, , - D-Melezitose -
Methyl β-D-Xylopyranoside, - D-Raffinose +
D-Galactose - Amidon +
D-Glucose + Glycogen +
D-Fructose + Xylitol -
D-Mannose + Gentiobiose -
L-Sorbose - D-Turanose -
L-Rhamnose - D-Lyxose -
Dulcitol - D-Tagatose -
Inositol + D-Fucose -
D-Mannitol + L-Fucose -
D-Sorbitol + D-Arabitol -
Methyl α-D-mannopyranoside - L-Arabitol -
Methyl α-D-glucopyranoside + potassium Gluconate -
N-acetylglucosamine - potassium 2-Ketogluconate -
Amygdalin + potassium 5-Ketogluconate -
Arbutin + potassium 2-Ketogluconate -
Aesculin + potassium 5-Ketogluconate -
Salicin +
이상에서와 같이 본 발명의 균주는 바실러스 아밀로리퀴에파션스 (Bacillus amyloliquefaciens) JBC36로 동정되었고, 2010년 09월 01일 특허균주기탁기관인 농촌진흥청 농업유전자원센타에 기탁번호 KACC 91582P으로 기탁하였다.
실시예 2. 본 발명의 신규한 미생물의 병원균에 대한 길항효과
발명한 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 균주를 수확 후 병해에 관여하는 주요 병원균과의 대치배양을 통하여 길항력을 계산식 : [(무처리 균사 신장길이-균처리 균사신장 길이)/무처리의 균사신장길이×100]으로 조사한 결과 감귤 녹색곰팡이병균 (Penicillium digitatum), 푸른곰팡이병균 (Penicillium italicum), 꼭지썩음병균 (Diaporthe citri), 잿빛곰팡이병균 (Botrytis cinerea) 등과 배의 푸른곰팡이병균 (Penicillium expansum), 잿빛곰팡이병균, 마늘의 마름썩음병 (Fusarium oxysporum) 등 수확 후 저장 중에 발생하는 진균성 병원균의 균사신장억제 효과가 우수하였다.
아래 [표 4]는 본 발명의 신규 균주가 감귤 등의 식물 수확 후 관련 주요 병원균의 균사생육 억제정도를 실험한 결과이다 (도 1 참조).
식물 수확 후 관련 주요 병원균의 균사생육 억제정도
병원균 균사생육억제 정도( %)
Peniclllium digitatum (감귤, 녹색곰팡이병균) 76.9
Penicillium italicum (감귤, 푸른곰팡이병균) 81.9
Penicillium expansum (배, 사과, 푸른곰팡이병균) 50.0
Diaporthe citri (감귤, 꼭지썩음병균) 62.5
Botrytis cinerea (감귤, 배, 잿빛곰팡이병균) 61.9
Fusarium oxysporum (마늘, 마른썩음병균) 27.9
Alternaria alternata (마늘, 검은썩음병) 67.5
Phytophthora citrophthora (감귤, 역병) 64.5
Phytophthora capsici (고추, 역병) 63.5
Colletotrichum acutatum (고추, 탄저병) 65.0
Geotrichum candidum (감귤, 흰곰팡이병) 23.3
실시예 3. 본 발명 신규한 미생물의 감귤 녹색곰팡이병 및 푸른곰팡이병 방제효과
감귤류에 가장 피해가 심하고 방제가 어려운 녹색곰팡이병균 (KACC41898)과 푸른곰팡이병균 (KACC41913)을 농촌진흥청 농업유전자원센타로에서 분양 받은후 감자한천배지 (PDA; potato dextrose agar)에 30에서 1주일간 배양한 균으로부터 포자를 채취한 후 106 포자/ml 농도로 조절한 다음 감귤 껍질부위에 1mm 정도의 상처를 낸 자리에 접종하여 마르도록 기다린 후 본 발명 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 균주를 5×107 세포/ml 농도로 동일한 부위에 접종한 다음 5일 후 병 발생 억제효과를 조사하였다. 그 결과 녹색곰팡이병균에 대해서는 80 내지 85%, 푸른곰팡이병균은 90 내지 95%정도의 방제효과를 보였다 (도 2 참조).
실시예 4. 본 발명 신규한 미생물의 녹색곰팡이병균과 푸른곰팡이병균의 포자발아 억제효과
저장 감귤에서 가장 문제가 심각한 녹색곰팡이병과 푸른곰팡이병균의 주요 전염 방법은 포자가 비산하여 전염되는 것이므로 신규한 발명 균주에 의한 포자 발아억제능력을 조사하기 위하여 감자한천액체배지 (PDB, potato dextrose broth) 20%에 녹색곰팡이병균 및 푸른곰팡이병균을 배양하여 상기한 바와 같이 획득한 포자와 본 발명 JBC36균주를 106, 107, 108, 109 세포/ml 농도로 혼합한 후 24시간후에 원래 포자 크기 이상으로 발아한 것을 정상적으로 발아한 것으로 조사하였다. 각각의 처리에서 100개의 포자발아를 조사한 결과 감귤 녹색곰팡이병균과 푸른곰팡이병균의 포자발아 억제능력이 우수하였으며, 특히 109 세포/ml 농도에서는 병원균의 포자발아를 완전히 억제하는 능력을 보였다 (도 3 참조).
실시예 5. 본 발명 신규한 미생물이 생산한 천연길항물질에 의한 녹색곰팡이병균과 푸른곰팡이병균의 균사신장 억제 효과
본 발명 신규한 JBC36 균주를 LB 배지에서 48시간동안 배양한 후 15,000 rpm에서 15분간 원심분리를 하여 미생물 세포를 제거하였다. 이 용액을 다시 필터링 (0.22㎛) 하여 남아있는 균을 완전히 제거하여 순수한 배양액만을 획득한 후 감자한천배지 (PDA)에 혼합한 다음 페트리디쉬에 분주하였다. 그 위에 녹색곰팡이병균과 푸른곰팡이병균을 접종하여 배양한 후 계산식 {100-[(처리구의 균사 신장길이)2×3.14/(무처리의 균사 신장길이)2×3.14]×100}에 의하여 조사한 결과 신규 균주가 제거된 순수한 배양액을 10%만 첨가하여도 균사신장을 현저히 억제하여 본 발명한 균주가 생산하는 물질 자체도 수확 후 발생하는 진균성 병원균에 대한 길항효과도 우수하였다 (도 4 참조).
실시예 6. 본 발명 신규한 미생물과 동 균이 생산한 천연길항물질의 동시처리에 의한 감귤 생체에서의 녹색곰팡이병 방제효과
본 발명의 신규한 JBC36균주를 배양한 후 상기한 방법에 의해 미생물을 완전히 제거하고, 그 배양액에서 10배량의 에탄올을 첨가하여 단백질을 침전시킨 후 이를 증발 건조시킨 다음 메탄올에 녹여 총 단백질량을 비색법으로 (BCA 키트; Pierce社) 조사하였다. 단백질의 농도를 5mg/ml로 조정하고, 5×107 세포/ml의 균과 각각 또는 동시에 처리하고 병원균을 2×105 세포/ml 농도로 접종한 후 병발생 정도를 접종 7일후 조사한 결과 녹색곰팡이병의 발병율이 현저히 감소되었고, 발병된 부위의 썩는 정도도 낮았다. 이와 같이 JBC36 균주가 생산하는 천연물질을 이용한 감귤 부패를 억제하거나, 균과 동시에 처리하여 방제 효과를 현저히 증가시킬 수 있었다.
아래 <표 5>는 본 발명의 신규 균주 및 이 균이 생산한 천연길항물질을 동시에 처리했을 때 녹색곰팡이병 방제정도를 나타낸 데이터이다. 아래 <표 5>에서 나타난 바와 같이 본 발명의 신규 균주를 배양하여 얻은 천연길항물질과 동 균주를 동시에 처리한 경우 부패 발병도가 5%로 나타나, 본 발명의 신규 균주만을 처리한 경우 (20%)와 비교하여 월등히 향상된 방제효과를 보이는 것을 알 수 있었다. 이는 처리한 미생물이 과일의 생체에 정착한 후 증식한 다음 길항물질을 생산할 때까지의 시간동안에 동시에 처리해준 길항물질이 병 억제효과를 발휘하였기 때문으로, 본 발명의 미생물을 이용해 생물 농약을 개발할 때 미생물 배양액을 희석하여 첨가함으로써 병원성 진균의 포자가 비산하여 침입하는 초기 단계를 방해하여 방제효과를 높여줄 수 있는 것을 의미한다.
본 발명 신규한 JBC36균주와 이 균이 생산한 천연물질의 동시 처리에 의한 녹색곰팡이병 방제효과
처리내용 부패직경 (cm) % 발병도
무처리 3.0 100
천연길항물질 (5mg/ml) 0.62 50
JBC36 (5×107 CFU/㎖) 0.3 20
천연길항물질 (5mg/ml) +JBC36 (5×107 CFU/㎖) 0.05 5
실시예 7. 본 발명 신규한 미생물이 생산한 천연길항물질의 안정성
본 발명의 신규한 미생물을 상기한 바와 같이 배양한 후 미생물을 제거하고 배양액에서 천연길항물질을 추출하여 pH2-10으로 조절한 용액에 24시간 반응시킨 후 각 용액을 중성 즉 pH7로 다시 조절하여 녹색곰팡이병균의 균사생육 억제 정도를 조사한 결과 pH2에 24시간 반응시켰을 경우에만 활성이 저하되었다. 또한 80, 100, 121℃에서 15분간 처리 후 길항력의 소실정도를 조사한 결과 80에서는 길항력이 소실되지 않았고, 100℃ 처리 시 약 20%정도의 길항력 감소를 확인할 수 있었는데, 이상의 결과로 볼 때 JBC36 균주가 생산한 물질은 pH나 온도의 변화에 안정성이 매우 높은 것으로 확인되었다 (도 5 및 도 6참조).
실시예 8. 본 발명 신규한 미생물을 함유하는 미생물제제의 제조 및 방제효과
본 발명 신규한 미생물을 배양한 후 균체만을 획득하여 카나우바 왁스 (carnauba wax, 0.7%)를 주성분으로 하고, 여기에 파라핀 오일을 0.5%, 모르폴린 올레이트를 1.5% 첨가한 후 이를 증류수를 이용해 100배로 희석하였다. 이렇게 희석한 용액에 본 발명의 미생물 농도를 107 세포/ml의 균농도가 되도록 조절한 다음 감귤에 코팅 처리하였다. 여기에 녹색곰팡이병균을 105 세포/ml의 농도로 조정하여 접종한 후 20에 1개월 간 보관하면서 병 발생정도를 조사하였다. 그 결과 방제약제로 등록된 화학약제인 프로클로라츠(상품명: 스포르곤, 한국삼공)은 약 85 내지 90%의 방제효과를 보이는 반면, JBC36 균주는 약 87 내지 93%의 방제효과를 보여, 본 발명의 신규 균주를 함유하는 미생물제제의 방제효과가 더 뛰어난 것을 알 수 있었다 (도 7 및 도 8참조). 한편, 제형화후 균의 생존량을 조사한 결과 제형제는 균의 생육에 크게 영향을 미치지 않았다.
실시예 9. 본 발명 신규한 미생물을 함유하는 미생물제제의 제조 및 방제효과
본 발명 신규한 미생물을 107 세포/ml 농도로 조절하여 분자량 3,000-5,000 정도의 키토산올리고당에이치 1% 용액 (키토 라이프 연구개발 센타, www.kittolife.co.kr) 과 혼합한 후 상기한 바와 같이 녹색곰팡이병균을 접종하여 방제효과를 조사한 결과, 균이나 키토산을 단독으로 처리하였을 때 방제효과가 각각 80% 및 55% 정도였으나 혼합처리 하였을 경우 방제효과가 90% 이상으로 증가되는 것을 알 수 있었다 (도 9 참조). 키토산과 혼합했을 때 JBC36 균주는 생육이 안정적이었고, 키토산은 친환경 건강 보조식품으로 알려져 있어 키토산을 기반으로 한 친환경 제제로서의 활용도 가능할 것으로 판단된다.
농업생명공학연구원 KACC91582P 20100901

Claims (10)

  1. 식물 병원균에 길항효과를 나타내는 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P) 균주.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 과일류에 병을 일으키는 병원균에 대하여 우수한 길항효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P) 균주.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 과일류는 감귤, 배, 사과로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 균주.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 식물 병원균은 페니실리움 디지타툼 (Penicillium digitatum), 페니실리움 이탈리쿰 (Penicillium italicum), 페니실리움 엑스펜섬 (Penicillium expansum), 다이아포티 시트리 ( Diaporthe citri), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum), 알터나리아 알터나타 (Alternaria alternata), 피토프토라 시트로프토라 (Phytophthora citrophthora), 피토프토라 카프시시 (Phytophthora capsici), 콜렉토트리큠 아쿠타튬 (Colletotrichum acutatum) 및 제오트리쿰 칸디듐 (Geotrichum candidum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 균주.
  5. 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P) 균주의 배양액으로부터 분리하여 얻은 식물 병원균 천연길항물질.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 천연길항물질은 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P) 균주를 배양하여 배양액을 형성하는 단계; 상기 배양액으로부터 본 균주를 제거하는 단계; 및 균주가 제거된 배양액에 추출용매를 처리하여 단백질을 추출하는 단계를 포함하는 추출방법을 통하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 식물 병원균 천연길항물질.
  7. 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P) 균주 또는 동 균주의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 조성물은 유효성분으로 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P) 균주 또는 동 균주의 배양액 외에 키토산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 병원균 방제용 조성물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 식물 병원균은 페니실리움 디지타툼 (Penicillium digitatum), 페니실리움 이탈리쿰 (Penicillium italicum), 페니실리움 엑스펜섬 (Penicillium expansum), 다이아포티 시트리 ( Diaporthe citri), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum), 알터나리아 알터나타 (Alternaria alternata), 피토프토라 시트로프토라 (Phytophthora citrophthora), 피토프토라 카프시시 (Phytophthora capsici), 콜렉토트리큠 아쿠타튬 (Colletotrichum acutatum) 및 제오트리쿰 칸디듐 (Geotrichum candidum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 식물 병원균 방제용 조성물.
  10. 바실러스 아밀로리퀴에파션스 JBC36 (수탁번호 : KACC 91582P) 균주를 이용한 식물 병원균 방제 방법.
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