CN111440743B - 一株防病促生和土壤改良的解淀粉芽孢杆菌peba20及其应用 - Google Patents

一株防病促生和土壤改良的解淀粉芽孢杆菌peba20及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种多功能植物内生贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)PEBA20，其保藏号为CGMCC 12146。解淀粉芽孢杆菌PEBA20兼具良好的防病促生作用、线虫杀灭作用和土壤改良功能。该菌株对烟草赤星病病原菌、烟草黑胫病病原菌等真菌菌丝生长抑制作用明显；可促进烟草幼苗的株高、茎粗、叶面积，促进植物根系生长；对松材线虫具有明显的杀灭作用，5倍稀释的PEBA20发酵液对松材线虫幼虫和成虫的杀灭率达100％。烟田施用解淀粉芽孢杆菌PEBA20水剂或生物炭固态菌剂，可促进烟草的根、茎、叶片的生长，具有良好的大田促生作用；可提高土壤细菌物种丰富度，改变土壤细菌的群落结构，对于连作障碍恢复和土壤改良具有重要作用。

Description

一株防病促生和土壤改良的解淀粉芽孢杆菌PEBA20及其应用
技术领域
本发明涉及植物病害防治技术领域，具体涉及一株植物内生解淀粉芽孢杆菌PEBA20，及利用该菌株用于抗病、促生、杀线虫，及土壤改良的专利申请。
背景技术
植物内生细菌(Endophytic bacteria)泛指那些定殖于植物体内而未表现致病外部症状的或对宿主植物无负面影响的细菌。植物内生细菌易于定殖在植物体内，相对于植物外生生防微生物，在定殖方面更具优势。在地球上存在的300 000种植物中，每种植物都有内生细菌存在，但仅有少数植物的内生细菌资源被报道。
发明内容
本发明涉及解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)PEBA20的抗病、促生和杀线虫作用、土壤改良功能及其应用。
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)PEBA20，已于2016年2月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏登记号为CGMCC NO.12146；请求保藏人及地址：刘振宇，山东农业大学植物保护学院，山东泰安岱宗大街61号；该保藏为用于专利程序的生物材料保存。
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)PEBA20是分离自杨树的植物内生菌。
本发明提供了解淀粉芽孢杆菌PEBA20对植物病原真菌烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)的抑制作用。
本发明提供了解淀粉芽孢杆菌PEBA20在促进烟草生长方面的作用及应用。
本发明提供了解淀粉芽孢杆菌PEBA20在杀灭松材线虫方面的应用。
本发明提供了解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌剂的制备和在烟草大田中的应用效果及其土壤改良功能。
附图说明：
图1：解淀粉芽孢杆菌PEBA20对烟草赤星病菌的作用效果，其中A为正常生长的烟草赤星病菌；B为解淀粉芽孢杆菌PEBA20对烟草赤星病菌的对峙作用效果；
图2：解淀粉芽孢杆菌PEBA20对烟草黑胫病菌的作用效果，其中A为正常生长的烟草黑胫病病菌；B为解淀粉芽孢杆菌PEBA20对烟草黑胫病菌的对峙作用效果；
图3：不同处理后的烟草赤星病原菌菌丝情况：A为烟草赤星病菌正常菌丝生长情况；B为烟草赤星病原菌菌丝被解淀粉芽孢杆菌PEBA20抑制的生长情况；
图4：解淀粉芽孢杆菌PEBA20发酵液对烟草赤星病菌、烟草黑胫病菌生长的抑制作用；
图5：解淀粉芽孢杆菌PEBA20发酵液对烟草赤星病原菌生长的抑制作用，其中A为对照；B为2倍发酵液作用；C为4倍发酵液作用；D为6倍发酵液作用；E为8倍发酵液作用；F为10倍发酵液作用；
图6：莱斯芽孢杆菌PEBA20对烟草根系生长的作用；
图7：解淀粉芽孢杆菌PEBA20发酵液处理混合龄期松材线虫的作用效果；
图8，解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌剂对烟草农艺性状的作用；
图9：解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌剂对烟田土壤细菌α多样性的影响；
图10解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌剂对烟田土壤细菌在门、种水平上的物种相对丰度特征，其中A:门水平上的物种相对丰度，B种水平上的物种相对丰度。
具体实施方式
以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限于本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到。以下实施的定量实验均设三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、解淀粉芽孢杆菌PEBA20对植物病原真菌的抑制效果
解淀粉芽孢杆菌PEBA20对烟草黑胫病菌(Phytophthora parasiticavar.nicotianae)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)的作用效果。
解淀粉芽孢杆菌PEBA20活化及菌悬液的获得
用接种环挑取-80℃保存的解淀粉芽孢杆菌PEBA20的甘油菌，在LB培养基上进行划线培养。用接菌环挑取LB培养基画线得到的单菌落，置于5mL的LB液体培养基中，在28℃、150r/min的条件下震荡培养12h，再以1﹕1000的比例转接到100mL LB液体培养基中28℃、150r/min的条件下震荡培养12h。
两种植物病原真菌的活化
用0.5cm的打孔器打下烟草黑胫病菌、烟草赤星病菌，放置在晾好的PDA培养基的中央，放在28℃、黑暗条件的生化培养箱中培养，烟草黑胫病菌培养8d、烟草赤星病菌10d。
解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌体与病原菌的拮抗试验
用0.5cm的打孔器打2种病菌菌碟，在PDA平板的中央接种0.5cm烟草赤星病菌菌碟，距离菌碟边缘右侧2cm处接种2μL解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌悬液，对照组为PDA平板中央接种0.5cm每种病菌菌碟，10d以后观察抑菌情况，测量菌落直径并计算抑菌率，每个处理3个重复。
抑菌率(％)＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径×100％
并用显微镜观察拍照解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌体对三种病原菌菌丝致畸特征
解淀粉芽孢杆菌PEBA20无菌滤液与2种烟草病害病原菌的拮抗试验
解淀粉芽孢杆菌PEBA20无菌滤液的获得
用接种环挑取-80℃保存的解淀粉芽孢杆菌PEBA20的甘油菌，在LB培养基上进行划线培养。用接菌环挑取LB培养基画线得到的单菌落，置于5mL的LB液体培养基中，在28℃、150r/min的条件下震荡培养12h，再以1﹕1000的比例转接到150mL LB液体培养基中28℃、150r/min的条件下震荡培养96h。培养液4℃，10,000rpm离心10min，取上清，依次透过0.45μm、0.22μm细菌滤膜，获得无菌体的发酵液。
解淀粉芽孢杆菌PEBA20无菌滤液与植物病原菌的拮抗试验
用移液枪吸取不同量的解淀粉芽孢杆菌PEBA20无菌滤液与提前熔化好的浓缩PDA培养基进行倒平板，在晾好的PDA平板中央接种0.5cm的病原菌菌碟，并且设置对照(正常PDA培养基)，每个处理3个重复，放置在28℃、黑暗条件下的生化培养箱中进行倒置培养10d，用直尺测量烟草赤星病原菌菌落直径，并且计算出抑菌率。
抑菌率(％)＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径×100％
解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌活体与植物病菌的皿内拮抗试验结果
表1解淀粉芽孢杆菌PEBA20与植物病原菌的拮抗作用
Figure GDA0003503657190000031
由表1和图1、图2。可见，解淀粉芽孢杆菌PEBA20对2种植物病原菌菌丝的生长均有较好的抑制效果，其对烟草赤星病原菌菌丝的生长抑菌率高达83.91％，对烟草黑胫病病原菌的抑菌率达78.4％。见图1：解淀粉芽孢杆菌PEBA20对烟草赤星病菌的作用效果，A为正常生长的烟草赤星病菌；B为解淀粉芽孢杆菌PEBA20对烟草赤星病菌的对峙作用效果；见图2：解淀粉芽孢杆菌PEBA20对烟草黑胫病菌的作用效果，A为正常生长的烟草黑胫病病菌；B为解淀粉芽孢杆菌PEBA20对烟草黑胫病菌的对峙作用效果。
除抑制菌丝生长之外，解淀粉芽孢杆菌PEBA20可导致病原菌菌丝畸形，与PEBA20对峙的烟草赤星病菌、烟草黑胫病菌菌丝末端膨大呈球状，分支增多，且菌丝横隔之间距离变短。解淀粉芽孢杆菌PEBA20与对峙处理中，烟草黑胫病原菌菌丝枝杈卷曲，菌丝末端膨大呈球状，分支增多，且菌丝横隔之间距离变短。见图3：不同处理后的烟草赤星病原菌菌丝情况：A为烟草赤星病菌正常菌丝生长情况；B为烟草赤星病原菌菌丝被解淀粉芽孢杆菌PEBA20抑制的生长情况。
解淀粉芽孢杆菌PEBA20无菌滤液与烟草赤星病菌和烟草黑胫病菌的对峙试验
研究发现，振荡培养5d获得的解淀粉芽孢杆菌PEBA20无菌滤液不同稀释倍数对烟草赤星病菌、烟草黑胫病菌生长具有一定的抑制效果，对烟草赤星病菌的抑制效果更明显，分别为92.42％、68.64％、62.27％、56.82％、50％。对烟草黑胫病菌的抑菌率，分别为35.07％、11.11％、5.28％、3.99％、2.36％。见图4：解淀粉芽孢杆菌PEBA20发酵液对烟草赤星病菌、烟草黑胫病菌生长的抑制作用；见图5解淀粉芽孢杆菌PEBA20发酵液对烟草赤星病原菌生长的抑制作用，A为对照；B为2倍发酵液作用；C为4倍发酵液作用；D为6倍发酵液作用；E为8倍发酵液作用；F为10倍发酵液作用。
实施例2、解淀粉芽孢杆菌PEBA20对烟草的促生效果
菌液制备：用接种环挑取-80℃保存的解淀粉芽孢杆菌PEBA20的甘油菌，在LB培养基上进行划线培养。用接菌环挑取LB培养基画线得到的单菌落，置于5mL的LB液体培养基中，在28℃、150r/min的条件下震荡培养12h，再以1﹕1000的比例转接到100mL LB液体培养基中28℃、150r/min的条件下震荡培养24h。
处理试验过程:实验组：移栽前吸取OD600＝2的菌悬液5mL，加入到装有土壤的育苗盘中，每钵中移栽1颗烟草苗，共32个。CK：移栽前吸5mL无菌水加入到装有土壤的栽培钵中，向装有土壤的栽培钵中每钵中移栽1颗烟草苗，共32个。
测量结果：移栽后的第30d测量烟草的叶长、叶宽、株高、茎粗、叶片数、茎叶鲜重、茎叶干重、总根长、根表面积。
解淀粉芽孢杆菌PEBA20对烟草的促生试验结果
表2解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌对烟草生长的影响
Figure GDA0003503657190000041
由表2、图6可知，解淀粉芽孢杆菌PEBA20对烟草具有促生作用。栽培30d后，PEBA20对于具有良好的促生效果，具体体现在有效增加烟草的总根长，根面积。同时可增加烟叶的叶长、叶宽、株高、茎粗等，处理组的烟草株高比对照组高56.57％，烟草植株的茎叶干重是较对照提高73.15％。见图6：莱斯芽孢杆菌PEBA20对烟草根系的作用。
可见在盆栽试验中解淀粉芽孢杆菌PEBA20可显著促进烟草的生长。
实施例3、解淀粉芽孢杆菌PEBA20对松材线虫的作用效果
松材线虫混合龄期的获得
灰葡萄孢接种于PDA平板，25℃培养箱中培养5-7天至灰葡萄孢的菌丝长满平板，待灰霉长满平板后用其接种松材线虫，后在25℃培养箱中培养5-7天至线虫长满平板后进行分离收集。
松材线虫的分离：采用改进贝尔曼漏斗法分离：将玻璃漏斗(直径10—15cm)，架在铁架或置物架上，下面接10cm左右的橡皮管，橡皮管中部接一弹簧夹。在漏斗内放置一张两层面巾纸，面巾纸对折两次后置于漏斗内，将长满松材线虫的培养基取出倒扣于面巾纸三层处，将分离样品放在盛满30℃清水的漏斗中，25℃分离2小时后，打开弹簧夹，收集16ml(每管8ml)线虫液，取50ul线虫悬液显微镜下观察，经稀释或离心去上清液后确保线虫总数量在200-300条/50ul，最终得线虫混合龄期悬液。
解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌悬液及发酵液处理混合龄期松材线虫
解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌悬液及发酵液的获得
用接种环挑取-80℃保存的解淀粉芽孢杆菌PEBA20的甘油菌，在LB培养基上进行划线培养。用接菌环挑取LB培养基画线得到的单菌落，置于5mL的LB液体培养基中，在28℃、150r/min的条件下震荡培养12h，再以1﹕1000的比例转接到150mL LB液体培养基中28℃、150r/min的条件下震荡培养96h。获得菌悬液。将菌悬液4℃，10,000rpm离心10min，取上清，依次透过0.45μm、0.22μm细菌滤膜，获得无菌体的发酵液。
将分离的线虫液用悬液计数法确定密度为150条/50ul左右。以清水为对照，用摇菌5天解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌5倍稀释发酵液对混合龄期松材线虫进行以下浸渍实验处理。
每个处理3次重复，并在1.5ml离心管中混匀，放到25℃恒温培养箱中进行培养，在距离处理时间2h/8h/18h/24h后用移液枪取50μL含线虫的混合液于凹玻片上，置于显微镜下观察。
解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌悬液及发酵液处理混合龄期松材线虫的作用效果
解淀粉芽孢杆菌PEBA20对松材线虫具有明显的杀灭作用，对2至4龄幼虫，以及对成虫作用效果显著。如图3，其5倍发酵液处理8h，松材线虫2龄和3龄幼虫死亡率就达到100％。其5倍发酵液处理松材线虫成虫，处理8h，既有较多的线虫成虫死亡，处理24h，松材线虫成虫的死亡率达90％以上，继续处理，则100％死亡，见图7：解淀粉芽孢杆菌PEBA20发酵液处理混合龄期松材线虫的作用效果。
实施例4、解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌剂的制备及应用
用接种环挑取-80℃保存的解淀粉芽孢杆菌PEBA20的甘油菌，在LB培养基上进行划线培养。用接菌环挑取LB培养基画线得到的单菌落，置于5mL的LB液体培养基中，在28℃、150r/min的条件下震荡培养12h，得到种子液，将种子液以1﹕1000的比例转接到LB液体培养基中28℃、150r/min的条件下震荡培养72h，得到解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌液，将菌液与活性炭混合得到解淀粉芽孢杆菌菌剂，使解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌剂的有效活菌数为2.0×1010CFU/mL。
本研究为大田小区试验设计。共设置2个处理，每个处理重复3次，共6个小区，每个小区为50m×6.6m，以110cm×70cm株行距种植烟草6行。解淀粉芽孢杆菌PEBA20固态菌剂在春季烟田起垄时施用。处理：解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌剂，每hm2施用量为100g；对照:未施加菌剂处理。
处理分别在移栽期和团棵期追施解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌液，用量为供试菌液稀释1000倍，穴施10mL/株。
测定指标与方法：测定烟草的团棵期、现蕾期、平顶期、采烤初期进行。
菌剂对烟草农艺性状评价，主要从以下指标来分析、评价，包括：株高、茎粗、节间距、叶长及叶面积等几个方面进行评价。烟草叶面积计算公式：叶面积＝叶长×叶宽×叶面积系数(0.6345)
取样方法：选取烟草采烤期(烟草叶片成熟收获的时期)取样。每个小区选取3个点，按“S”型方法在小区的中间两行烟草的第5m、25m、45m处，在每个地块中选择健康的烟草，并且在距离每个烟草位置15-20cm的距离处的10-20cm深度处收集土壤样品。然后将每种处理的样品混合在一起，过筛(2mm)以去除地上植物材料，根和结石，储存在-80℃用于DNA提取和随后的分子分析。
烟田土壤细菌高通量测序
土样经充分混匀后，各取1.00g土样，使用OMEGA微生物基因组提取试剂盒(OMEGA公司，美国)，按照说明书进行操作，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度。
以稀释后的基因组DNA(20ng/μL)为模板，采用16S rRNA基因V4-V5区引物进行扩增，引物序列为515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’和907R：5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’[8]。PCR扩增体系(25μL)：5×reaction buffer 5μL，5×GCbuffer 5μL，dNTP(100mmol/L)5μL，515F(10μmol/L)1μL，907R(10μmol/L)1μL，DNA 2μL，ddH2O 8.75μL。扩增参数：95℃预变性2min；95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃终延伸5min，10℃保温。扩增PCR产物经琼脂糖电泳检测阳性后，送至诺禾致源生物科技有限公司，用Illumina Miseq高通量测序技术平台进行序列测序和分析。
应用软件Qiime和mothur对连接上的序列进行过滤和去除嵌合体。然后对得到的优质序列基于97％的相似水平上进行OTU聚类，并利用Greengene数据库进行物种注释。利用Qiime软件绘制稀释曲线，应用软件mothur中的summary.single命令，计算5种常用的生物多样性指数：shannon、simpson、chao1、ACE和PD_whole_tree。应用软件R对属水平上的分类及物种丰度进行主成分分析(PCA)，绘制PCA图。并在各分类水平上进行群落结构的统计分析，得到微生物群落结构组成差异。
菌剂对烟草农艺性状的作用见图8，解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌剂对烟草农艺性状的作用
由图8可知，在团棵期，解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌剂对烟草株高、茎粗、叶片数和叶面积均有促进效果，烟田施用菌剂后，烟草株高分别比对照增加20.33％，茎粗增加了13.39％，叶片数增加8.58％，烟草叶面积增加了27.90％。
由图8可知，在现蕾期，解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌剂对烟草株高有促生作用，比对照增加4.32％；对烟草叶片数也有增加效应，比对照增加10.96％；处理烟草茎粗比对照增加4.16％。对烟草最大叶面积影响不显著。
由图8可知，在平顶期，菌剂施用提高了烟草叶片的株高茎粗和叶片数以及叶面积分别提高了0.95％、4.75％、9.54％、0.11％。
从图8可以看出，在采烤初期，菌剂对株高的促进效果为明显，相对于对照增加了2.48％；对叶片面积的促进效果显著，相对于对照分别增加了10.48％。
综上所述，解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌剂对烟草的生长具有较好的促进作用。
解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌剂对烟田土壤细菌分子多样性的影响
2个处理的土壤样本共获得106044条Taxon Tags，菌剂处理、对照，所得TaxonTags分别为50978和55066。97％的相似水平下对Taxon Tags进行OTU(OperationalTaxonomic Units)的聚类，共获得5216个OTU。其中，菌剂处理、对照测序获得的细菌OTUs分别为2680和2536。生物信息统计分析得，这些OTUs属于不同的分类类型。菌剂处理的OTUs归属于41门76纲138目241科322属，而对照的OTUs归属于37门77纲134目238科300属。分析OTUs数量，即细菌种类数，菌剂处理的烟田土壤细菌的OUTs高于对照土壤的细菌OTU，相较于对照OTU增加了5.68％。
解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌剂对烟田土壤细菌α多样性的影响
由图9可知解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌剂显著提高了烟田土壤细菌的α多样性，即增加了烟田土壤细菌的物种多样性。见图9解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌剂对烟田土壤细菌α多样性的影响。
解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌剂对烟田土壤细菌群落结构的影响
本次测序中2个土壤样本中共检测出41个细菌门，其中，Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria、Gemmatimonadetes、Chloroflexi、Firmicutes、Planctomycetes、Nitrospirae、Bacteroidetes、Verrucomicrobia共10个细菌门在该次测序中相对丰度位于前10位，其相对丰度之和在2个土壤样品中均占到土壤细菌总量的95％以上。见图10解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌剂对烟田土壤细菌在门、种水平上的物种相对丰度；A:门水平上的物种相对丰度，B种水平上的物种相对丰度。
菌剂施入后对土壤细菌丰度位于前10的菌门，产生较大的影响，且不同菌剂对土壤细菌相对丰度位于前十的菌门影响不同，相较于对照施有菌剂的处理增大了土壤中Acidobacteria、Gemmatimonadetes、Chloroflexi、Planctomycetes、Nitrospirae、Verrucomicrobia6个细菌门的丰度。降低了土壤中Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutes的丰度。由上可以看出，菌剂施入对土壤细菌门水平的群落结构影响较大。见图10解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌剂对烟田土壤细菌在门、种水平上的物种相对丰度；A:门水平上的物种相对丰度，B种水平上的物种相对丰度。
菌剂使用后引起了土壤细菌种的分类水平上细菌丰度的变化，菌剂施入后丰度位于前20的土壤细菌种水平丰度总和降低，由单施化肥的是0.0575而菌剂处理是0.0325，此外，优势细菌丰度发生改变，对照中丰度位于前3位的细菌为Streptomyces_mutabilis(0.0072)、Bradyrhizobium_elkanii(0.0064)、Telluria_mixta(0.0061)，而菌剂处理为Nitrospira_japonica(0.0036)、Telluria_mixta(0.0035)、Sporosarcina_aquimarina(0.0034)。可见菌剂施入该变了前3位的优势菌，降低了前3位菌的丰度。除此之外丰度位于前20的多数细菌丰度下降。
综上所述，解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌剂，可提高土壤细菌物种丰富度，改变土壤细菌的群落结构，对于土壤改良和恢复连作引起的土壤微生物群落失衡存在可能的意义。见图10解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌剂对烟田土壤细菌门、种水平上的物种相对丰度柱形图A:门水平上的物种相对丰度柱形图，B种水平上的物种相对丰度柱形图。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PEBA20，为一种植物内生芽孢杆菌，菌株保藏编号为CGMCC NO.12146。
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