CN113322188B - 一种具有促生作用的内生真菌at180及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有促生效果的内生真菌(Alternariaarborescens)AT180及其应用。属于微生物技术领域。本发明以促进烟草生长、提高烟叶品质为目标，对分离获得的烟草内生真菌进行了筛选，获得具有明显促生效果的功能菌株，可应用于制备烟草专用微生物菌肥。

Description

一种具有促生作用的内生真菌AT180及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及一种具有促生作用的内生真菌AT180及其应用。
背景技术
烟草(学名：Nicotiana tabacum L.)是茄科烟草属植物，一年生或有限多年生草本，全体被腺毛；根粗壮。茎高0.7～2米，基部稍木质化。叶矩圆状披针形、披针形、矩圆形或卵形，顶端渐尖，基部渐狭至茎成耳状而半抱茎。花序顶生，圆锥状，多花；花梗长5～20毫米。蒴果卵状或矩圆状，长约等于宿存萼。种子圆形或宽矩圆形，径约0.5毫米，褐色。夏秋季开花结果。原产于南美洲。中国南北各省区广为栽培。
内生真菌是生长在健康植物组织内的一类微生物种群，在植物生长发育及在植物抗生物和非生物胁迫中发挥着重要作用。研究表明内生真菌能促进植物生长、诱导植物产生抗病性、提高植物对重金属的耐性等。烟草是重要的叶用经济作物，在国民经济中占据重要的地位。烟草产量和品质的提高，是烟草产业健康发展的基础。通过发掘利用烟草内生真菌资源，对促进烟草生长、提高烟草抗病虫害、抗重金属和抗干旱胁迫具有积极意义。
因此，从烟草内生真菌中筛选获得具有显著促生效果的菌株，同时通过烟草-内生真菌共培养体系实现稳定促生效果，使烟苗的个体间差异较小是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种具有促生作用的内生真菌AT180及其应用。
其中，内生真菌(Alternaria arborescens)AT180保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏编号：CGMCCNo.21950；保藏日期2021年4月12日。
本发明以促进烟草生长、提高烟叶品质为目标，对分离获得的烟草内生真菌进行了筛选，获得具有明显促生效果的功能菌株，可应用于制备烟草专用微生物菌肥
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种烟草促生的菌肥，包括内生真菌(Alternaria arborescens)AT180，保藏编号为CGMCC No.21950。
本发明还提供了一种烟草促生的方法，使用内生真菌AT180作为菌肥施用，保藏编号为CGMCC No.21950。
本发明还提供了一种内生真菌AT180在促进烟草生产中的应用，使用包括内生真菌AT180的菌肥，保藏编号为CGMCC No.21950。
优选的：包括以下步骤：
1)育苗：取烟草种子置于无菌水浸泡后揉搓；育苗土于育苗盘中吸满水备用，将揉搓后的种子，均匀的洒在育苗盘中，温室中培养，长至4片叶时用于移栽；
2)菌肥的制备：大麦粒在水中浸泡过夜后，密封高温湿热灭菌，冷却备用，得麦粒固体培养基；菌株活化后，接种于麦粒固体培养基中，恒温黑暗培养，待菌丝布满麦粒；
3)菌肥的施用：采用“土壤层+菌肥层+土壤层”的方法施用菌肥，水分吸透后，育苗至5片叶时，移栽至花盆中，温室中培养。
优选的：步骤1)和步骤3)温室的环境：25℃16h光照，光照强度80μmm-2sec-1，再置于22℃8h黑暗培养，交替循环；培养时间45～60d。
优选的：步骤2)高温湿热灭菌：121℃灭菌20min，灭菌三次。
优选的：步骤2)恒温为25℃，黑暗培养时间为24h。
优选的：步骤3)土壤层采用混合土；混合土包括泥炭、蛭石和珍珠岩，质量比为4：2：1。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种具有促生作用的内生真菌AT180(乔木链格孢)及其应用，取得的技术效果为烟草幼苗与内生真菌共培养后，烟草生物量均有不同程度增加，表现为叶长、叶宽、根长增长，地上部干重和根干重均增加，且烟苗的个体间差异较小，促生效果较明显。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的内生真菌AT180在PDA平板上的形态特征图。
图2附图为本发明提供的烟苗与内生真菌AT180平皿共培养7d的生长情况图，其中，左图为空白对照，右图为与AT180共培养7d的烟草幼苗。
图3附图为本发明提供的具有促生效果的内生真菌AT180在盆栽中的促生效果图，其中左侧为空白对照，右侧为实验组。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种稳定促生的内生真菌AT180及其应用。
实施例涉及的原料、试剂均为市售渠道获得，对其品牌不做要求，未提及的方法均为实验常用方法，在此不再一一赘述。
实施例1
1样品来源
烟草品种为普通栽培种云烟87，从湖北省恩施州采集不同组织部位(根、茎、叶)、不同生长时期(苗期、团棵期、旺长期、成熟期)、不同海拔样地(600、1000、1300m)的样品。
2分离
将采集的样品在自来水下充分冲洗，除去表面的泥土。然后将冲洗的烟草组织按“75％乙醇(1min)-2.5％次氯酸钠(30s)-75％乙醇(1min)”三步消毒法进行表面灭菌，之后用无菌水冲洗3遍。将组织切成0.5×0.5cm的小块，将切口插入含有0.5％氯霉素的PDA培养基上，28℃恒温培养箱内培养3～30d。待培养基中组织切口处有菌丝长出，用灭菌的接种环挑取菌丝至新的PDA培养基上纯化直至获得纯培养。已纯化的菌株置于40％的甘油中保存。
3烟草与内生真菌共培养体系的建立及促生效果菌株的初筛
3.1菌株的活化
用灭菌的牙签挑取PDA斜面保存管中的少许菌丝，于PDA培养基上划开，封口后置于恒温光照培养箱中(24h黑暗，25℃)活化培养。
3.2云烟87的发苗
适量云烟87的种子置于1.5mL离心管中，加入无菌水浸泡48h。云烟87的种皮较厚，发苗前需要搓种处理，泡好的烟草种子转移至PE手套中，轻轻揉搓20～30min，至种子浅褐色为止。种子搓好后，移入灭菌的1.5mL离心管中，加入70％的酒精1mL，震荡消毒30s，酒精吸出后加入2％的次氯酸钠，震荡消毒10min，再用无菌水冲洗5～6次。滤纸放入玻璃皿中灭菌备用，洗好的种子倒在无菌滤纸片上，用灭菌的牙签沾取种子，点种在MS培养基上，每皿约30粒。封口后置于光照培养箱中(25℃、16h光照80μmm-2sec-1与22℃、8h黑暗交替)萌发，烟草长出4片真叶时可用于共培养体系的建立。
3.3共培养体系的建立
选取长势相同，大小一致烟草幼苗用于共培养。共培养体系使用10×10cm的一次性塑料方皿。移入烟草幼苗前，10×10cm的1/2MS改良培养基预先用灭菌的载玻片切去1/3，留出空白供烟草叶片生长。培养基处理好后，将长至4片叶的烟草幼苗转移至1/2MS培养基上，烟苗根部舒展在养基上，叶片部位留空，每个方皿中可放入烟草苗3株。移入烟草后，用灭菌的牙签挑取内生真菌菌丝，点在烟草苗根部下方1cm处，空白对照的烟苗不接种真菌，培养基封口后置于光照培养箱中(25℃、16h光照80μmm-2sec-1与22℃、8h黑暗)培养，14d后观察烟草长势，筛选出生长情况优于对照的实验组，拍照记录。
3.4具有良好、稳定促生效果菌株的获得
根据烟草的叶长、叶宽、叶数、叶色、根长、根数等指标初步选择出对烟草有促生效果的菌株，但这些菌株的促生效果是否稳定，内生真菌自身是否易变异等还需要进一步的验证，因此需要重复筛选实验进行菌株的复筛。复筛的指标主要有两个：一是内生真菌的促生效果要持久而稳定，个体间差异微小；第二个是内生真菌继代培养的过程中不易发生变异，菌种较为稳定。
3.5有良好促生效果菌株平皿上的复筛
菌株活化、烟草发苗、共培养体系建立的方法同上，重复烟草与初步筛选有促生效果的内生真菌的共培养实验，每个菌株做三个平皿的重复，重复5～6批次，观察促生效果，得到促生效果较好的菌株，拍照记录并统计生物量，计算促生效果。
3.6有良好促生效果菌株在盆栽中的促生效果
土壤的准备：按照泥炭：蛭石：珍珠岩＝4：2：1的比例拌土，混合均匀后备用。花盆填入土壤之前，需在底部放入9cm滤纸，以防土壤漏出，填土时尽量使每盆的土量一致。填入土壤的花盆放在托盘中，托盘放满水使土壤吸水，烟草苗期对水分要求较高，托盘中的水需要及时补充，保证土壤吸水充分，吸透水的土壤用于烟草苗的移栽。
烟草苗的移栽：将共培养后促生效果较好的烟苗、空白对照烟苗取出，小心清洗根部后移入盆栽，移栽时尽量保持根系完整，以提高移栽成活率。盆栽放在温室中(25℃、16h光照80μmm-2sec-1与22℃、8h黑暗交替)培养。移栽后，初期浇水不宜过勤，盆栽培养约20d后，观察烟苗的生长情况并拍照记录，采集烟叶、洗净后置于80℃烘箱中至恒重，称量统计叶片干重，计算促生效果。
3.7具有促生效果的内生真菌的形态鉴定及分类地位
菌株的活化
用灭菌的牙签挑取PDA斜面保存管中的少许菌丝，于PDA培养基上划开，封口后置于恒温光照培养箱中(24h黑暗，25℃)活化培养。
菌落形态的观察及形态观察
内生真菌活化培养过程中注意观察，记录菌落形态、不同生长期形态的变化、菌落质地、生长速度、菌丝形态等，7d后，记录菌落直径并拍照。
内生真菌的来源及分类地位
查找并整理内生真菌的分离寄主植物、分离部位的信息。根据通用引物ITS的PCR扩增产物在GenBank数据库中BLAST找出最相近的序列信息，确定大致的分类地位。
具体的：采用CTAB法提取纯化菌株的基因组DNA，DNA完整性利用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳条件：电压120V，时间15～20min；Maker：λDNA/Hind Ⅲ marker，DNA浓度和纯度利用Nanodrop检测。
利用通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)扩增菌株的ITS序列。
PCR扩增体系为：0.3μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，5.0μL Taq缓冲液(10×PCRbuffer)，3.0μL MgCl2(25mmol/L)，1.0μL dNTP(每种碱基各10mmol/L)，1.5μL ITS1引物，1.5μL ITS4引物，3.0μL模板DNA，34.7μL超纯水(pH＝8.0)。
PCR反应程序：95℃15min；95℃30s，56℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；25℃10min，4℃保存。
扩增成功的PCR产物纯化后经上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。将测序成功的ITS序列在NCBI上进行NR比对，搜索与PCR产物序列相似的序列片段，初步确定物种的分类地位。
结合NCBI上已有的近缘物种的序列，使用DNAMAN工具对序列进行比对分析，根据相似度来判断其与已知序列的同源性。
实验结果：
将分离获得的内生真菌与云烟87在平皿中共培养的初步筛选，得到促生效果良好，个体间差异较小，促生效果较明显的菌株，编号为乔木链格孢AT180(参见图1)。
将AT180采用形态学和分子生物学相结合的方法鉴定为Alternaria arborescensAT180。所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.21950。
实施例2
一种烟草促生的菌肥，有效成分包括内生真菌AT180，保藏编号为CGMCCNo.21950。
云烟87的育苗：适量云烟87的种子置于1.5mL离心管中，加入无菌水浸泡48h。泡好的烟草种子转移至PE手套中，轻轻揉搓20～30min。育苗土于育苗盘中吸满水备用，种子搓好后，均匀的洒在育苗盘中，育苗盘放在温室中(25℃、16h光照80μmm-2sec-1与22℃、8h黑暗交替)培养，育苗时间约为45～60d，长至4片叶时可用于移栽。
菌株的活化：用灭菌的牙签挑取PDA斜面保存管中的少许菌丝，于PDA培养基上划开，封口后置于恒温光照培养箱中(24h黑暗，25℃)活化培养。
菌肥的制备：大麦粒在水中浸泡过夜后，置于800mL锥形瓶中，每瓶体积约为200mL，8层纱布四层报纸封口后高温湿热灭菌。121℃灭菌20min，灭菌三次，冷却备用。
菌株活化后，用打孔器打取菌饼，菌饼放入麦粒固体培养基中，将锥形瓶置于恒温光照培养箱中(24h黑暗，25℃)培养，待菌丝布满麦粒后即可使用。
菌肥的施用：采用“三明治法”即“土壤层+菌肥层+土壤”的方法施用菌肥，土壤层采用混合土(泥炭：蛭石：珍珠岩质量比为4：2：1)。花盆按“三明治法”填入土壤和菌剂，花盆放入盛满水的托盘中吸水，水分吸透后，将育苗盘中育苗至5片叶的云烟87幼苗移栽至花盆中，温室中(25℃、16h光照80μmm-2sec-1与22℃、8h黑暗交替)培养约60d。
实验结果
烟草幼苗与内生真菌AT180共培养7d后，烟苗的叶色更为浓绿、叶长、叶宽、根长、根毛数目等都有不同程度的提高，且烟苗的个体间差异较小，促生效果较明显的菌株其促生效果见图2，各组均设置15个重复，处理后的烟草最大叶长、最大叶宽、根长、叶片干重、根系干重较对照均有显著差异，具体数据见表1。
表1
内生真菌平皿共培养7d的烟草生物量
Figure BDA0003071978830000071
Figure BDA0003071978830000081
待共培养14d后移入盆栽，盆栽于温室中培养20d后，可观察到实验组生长势优于空白对照对照，其促生效果参见图3。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种烟草促生的菌肥，其特征在于，所述菌肥为Alternaria arborescens AT180，保藏编号为CGMCC No.21950。
2.一种烟草促生的方法，其特征在于，使用Alternaria arborescens AT180作为菌肥施用，保藏编号为CGMCC No.21950。
3.一种Alternaria arborescens AT180在促进烟草生产中的应用，其特征在于，以Alternaria arborescens AT180为菌肥，保藏编号为CGMCC No.21950。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：
1)育苗：取烟草种子置于无菌水浸泡后揉搓；育苗土于育苗盘中吸满水备用，将揉搓后的种子，均匀的洒在育苗盘中，温室中培养，长至4片叶时用于移栽；
2)菌肥的制备：大麦粒在水中浸泡过夜后，密封高温湿热灭菌，冷却备用，得麦粒固体培养基；菌株活化后，接种于麦粒固体培养基中，恒温黑暗培养，待菌丝布满麦粒；
3)菌肥的施用：采用“土壤层+菌肥层+土壤层”的方法施用菌肥，水分吸透后，育苗至5片叶时，移栽至花盆中，温室中培养。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤1)和步骤3)所述温室的环境：25℃16h光照，光照强度80μmm-2sec-1，再置于22℃8h黑暗培养，交替循环；培养时间45～60d。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)所述高温湿热灭菌：121℃灭菌20min，灭菌三次。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)所述恒温为25℃，黑暗培养时间为24h。
8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤3)所述土壤层采用混合土；所述混合土包括泥炭、蛭石和珍珠岩，质量比为4：2：1。
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