CN105349454A - 一株同温层芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株同温层芽孢杆菌及其应用，该菌株分类命名为同温层芽孢杆菌(Bacillus？stratosphericus)PR1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年8月28日，保藏编号：CGMCC？No.9612。本发明菌株对蛋白质具有很好的降解效果，福林芬法测得该菌株所产蛋白酶酶活力为7.493IU；用溶磷圈法和钼蓝比色法测得该菌株具有很好的解磷效果；用保绿法测得该菌株具有很好的保绿效果，可以产生细胞分裂素。表明PR1菌株对促进烟草生长具有潜在的应用价值。

Description

一株同温层芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于植物根际促生菌及其应用技术领域，具体涉及一株促进烟草生长的具有降解蛋白质和解磷，以及产细胞分裂素功能的同温层芽孢杆菌及其促生特性的应用。

背景技术

烟草是茄科(Solanaceae)烟草属(Nicotiana)一年生草本植物。喜温、喜光、耐旱、怕涝、耐瘠、需钾较多。烟草叶、茎、花萼和果都有多细胞的毛，其中腺毛细胞中含有叶绿素，能综合含有树胶和树脂的渗出物，与烟草的香气有一定关系。烟草叶柄不明显或成翅状柄，其圆锥花序顶生，花萼筒状，花冠漏斗状，末端粉红色。蒴果，种子黄褐色。烟草原产于南美洲，因其叶片含烟碱(尼古丁)，采收后经过调制、分级和加工处理，可制卷烟、雪茄烟、旱烟等，是烟草工业重要的原料。近年来我国烟田施肥出现很大的问题，具体表现为：(1)肥料利用率不高，有资料表明我国烤烟肥料利用率较低，南方一些省份肥料利用率仅20％左右。其原因是对肥料利用率的相关性技术缺乏深入研究，特别是对南方烟区肥料流失的控制和北方烟区的营养吸收障碍等没有从根本上研究解决；(2)烟田土壤肥力不同程度出现下降趋势，由于缺乏良好的培肥地力措施，加之轮作条件差，烟田常年连作，土壤主要营养元素都不同程度出现下降趋势，同时土壤物理性状变劣；(3)营养不平衡，重氮轻磷缺钾；(4)对旱作烟草的施肥技术缺乏研究。

研究发现植物根际土壤中含有一些可以促进植物生长的微生物，一般有固氮、解磷、释钾、产生植物激素和分泌抗生素等能力或至少具有其中之一能力的细菌、蓝细菌等。统称为植物根际促生菌(PGPR)，其促生作用机制主要有以下几大类：提供植物营养物质、产生植物生长调节物质、植物根际生物修复剂和环境胁迫调节剂等。但筛选出具有多种功能且高效的微生物菌株一直是本领域追寻的目标。

蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，蛋白酶种类的多样性和水解活性的专一性，使其在食品、皮革、洗涤剂等工业生产领域成为具有重要商业价值的工业酶。土壤中含有大量蛋白质，可以利用PGPR产蛋白酶将土壤中的蛋白质分解，产生可以供给烟草使用的氮，为烟草田提供大量的氮源，这样就可以减少化肥的使用，避免了对土壤及环境的破坏。但目前还未见同时具有高效降解蛋白质和解磷，以及产细胞分裂素功能的同温层芽孢杆菌及其促进烟草生长的应用报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株同温层芽孢杆菌及其促进烟草生长的应用，该菌株具有降解蛋白质和解磷，以及产细胞分裂素功能。

一株同温层芽孢杆菌(Bacillusstratosphericus)PR1，该菌株保藏编号：CGMCCNo.9612。

所述的同温层芽孢杆菌的培养条件，采用的LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌20min，培养温度37℃，pH7.0。

所述的同温层芽孢杆菌的应用，用于降解蛋白质和/或解磷和/或产细胞分裂素，从而促进植物的生长。所述的的植物包括烟草。

本发明菌株培养后得到菌悬液作为液态菌剂使用，菌悬液的菌数浓度cfu≥10⁸个/mL。菌剂的使用方法：缓苗后灌根，每株烟苗加菌剂1mL。

本发明菌株的菌落及菌体特征为：该菌株在LB培养基(蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌20min，温度37℃，pH7.0。)上培养48h后菌落呈圆形，半透明，表面光滑，淡黄色，边缘整齐，菌落稍凸起。菌体呈杆状，产芽孢，革兰氏染色阳性。

该菌株的生理生化特征为：甲基红试验阴性、v-p试验阴性、淀粉水解试验阴性、硝酸盐还原试验阳性、吲哚试验阴性、硫化氢试验阳性、柠檬酸盐利用试验阳性、葡萄糖发酵试验阳性、蔗糖发酵试验阳性、麦芽糖发酵试验阳性、乳糖发酵试验阴性、甘露醇发酵试验阴性、葡萄糖碳源利用试验阳性、乳糖碳源利用试验阳性、甘露醇碳源利用试验阳性、蔗糖碳源利用试验阳性、麦芽糖碳源利用试验阳性、柠檬酸碳源利用试验阴性、2﹪NaCl耐盐试验阳性、5﹪NaCl耐盐试验阳性、7﹪NaCl耐盐试验阳性、10﹪NaCl耐盐试验阳性、产氨试验阳性。

该菌株的最适培养条件为：LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，温度37℃，pH7.0。

该菌株可以用于制备微生物菌剂；应用时用LB培养基培养得菌悬液(菌悬液的菌数浓度cfu≥10⁸个/mL)，作为液态菌剂。

菌剂的使用方法：缓苗后灌根，每株烟苗加1mL。

经研究表明，对本发明的菌株的功能测定结果如下：在脱脂奶粉的培养基(脱脂奶粉3.0g，琼脂3.0g，去离子水200mL，pH7.0～7.2，108℃灭菌20min。)中培养24h(37℃)后测得其菌落半径为0.1cm，透明圈半径为0.9cm，透明圈与菌落半径之比为9；用国标法以酪蛋白为底物测得PR1的蛋白酶酶活为7.493IU。在蒙金娜固体培养基(葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，NaCl0.3g，MgSO₄·7H₂O0.3g，FeSO₄0.03g，MnSO₄·H₂O0.03g，CaCO₃5.0g，KCl0.3g，Ca₃(PO₄)₂25.0g，卵磷脂0.3g，琼脂18～20g，pH值7.2～7.4。)上培养一周后，测得第一天其菌落直径d为1.5mm，溶磷圈直径D为5mm，D/d为3.3，第三天其菌落直径d为2.5mm，溶磷圈直径D为8.5mm，D/d为3.4，第七天其菌落直径d为3.5mm，溶磷圈直径D为13mm，D/d为3.7；在无机磷液体培养基(葡萄糖10.0g，(NH₄)₂SO₄0.5g，NaCl0.3g，KCl0.3g，MgSO₄·7H₂O0.3g，FeSO₄·7H₂O0.03g，MnSO₄·4H₂O0.03g，Ca₃(PO₄)₂25.0g，水1000mL，pH7.0-7.5。)培养4天后，用钼蓝比色法测定培养液中速效磷的含量变化，从而反应细菌的解磷能力，测得PR1培养液中速效磷含量为43.3mg/L。在放有小麦真叶的PR1的菌悬液中25℃暗室放置4d后目测叶片保绿效果，发现经PR1处理过的叶片依然是绿色，说明PR1有很好的保绿作用，可以产生细胞分裂素。盆栽30天时经PR1处理的烟株叶片数略小于对照，而最大叶片表面积大于对照，但是没有达到显著差异，60天时经PR1处理的烟株茎围、最大叶片表面积、叶片数均高于对照，而株高略低于对照，茎围比对照达到显著差异，90天时经PR1处理的烟株株高、叶片数与对照相比达到显著差异，经PR1处理的烟草植株的根、茎、叶、植株总鲜重均好于对照处理，且均达到显著差异，在采收后对生物量的统计中可以看出植株的根、茎、叶干重以及植株总干重均要优于对照，同时根干重、茎干重、植株总干重均在达到显著差异。与对照相比，根干重增幅为62.2％，茎干重增幅为49.22％，叶总干重增幅为13.97％，植株干重增幅为26.26％。以上研究结果表明，PR1菌株可以很好的促进烟草生长，在促进烟草生长方面具有潜在的应用价值。

本发明同温层芽孢杆菌(Bacillusstratosphericus)PR1。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年8月28日，保藏编号：CGMCCNo.9612。

附图说明

图1为60天和90天PR1处理与对照的烟株株高柱形图；

图2为60天和90天PR1处理与对照的烟株茎围柱形图；

图3为30天、60天和90天PR1处理与对照的烟株最大叶表面积柱形图；

图4为30天、60天和90天PR1处理与对照的烟株叶片数柱形图；

图5为PR1处理与对照的烟株鲜生物量柱形图；

图6为PR1处理与对照的烟株干生物量柱形图；

图7PR1降解蛋白质效果图；

图8PR1解磷效果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

本发明同温层芽孢杆菌(Bacillusstratosphericus)PR1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年8月28日，保藏编号：CGMCCNo.9612。

(1)CGMCCNo.9612的筛选

在牛肉膏蛋白胨液体培养基富集的过程：取采集自湖南桑植官地坪、浏阳烟科所的烟草根际土壤，共10个样品，编号为G1、G2、G3、G4、G5、L1、L2、L3、L4、L5，每个土样称取10g，加入100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，191r/min、37℃摇床振荡培养24h。

以脱脂奶粉为底物降解蛋白质的过程：取富集后的培养液经梯度稀释后，从10^-1、10^-2、10^-3、10^-4稀释度中吸取100μL稀释液涂布于高氏一号培养基上，在28℃条件下培养3天；从10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释度中吸取100μL涂布在PDA培养基上，37℃条件下培养1天；从10^-5、10^-6、10^-7、10^-8稀释度中吸取100μL涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上，37℃条件下培养1天。

待涂布的平板上长出菌后用灭菌牙签将菌落挑到脱脂奶粉培养基上。观察选取能够产生明显透明水解圈的细菌分离物，如此反复验证多次之后，挑取能稳定产生透明圈的菌株进行反复纯化，再在脱脂奶粉培养基上每个平板点种4株菌株，37℃恒温培养，72h后测量不同菌株的透明圈和菌落直径。根据透明圈与菌落半径比(HC)值的大小，筛选产蛋白酶能力相对较强的菌株。将纯化后的菌落接种至LB固体斜面培养基中(蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌20min，温度30℃，pH7.0。)保存。共得到144株可以降解蛋白质的菌株。

通过平板透明圈法，国标蛋白酶测定法，紫外分光光度法(测生长素含量)，保绿法，解钾能力测定法，溶磷圈法和钼蓝比色法分别测定其降解蛋白质的能力，产生长素能力，产细胞分裂素的能力，解钾能力和溶磷能力。从分离得到的菌株中筛选出一株既能降解蛋白质又可以解磷又能产细胞分裂素的菌株，记为PR1。

(2)CGMCCNo.9612菌种鉴定

基因组DNA的提取：将分离得到的菌株划线接种到LB固体培养基上于37℃中培养24h后，挑取单菌落于装有LB液体培养基的试管中37℃，150r/min摇床培养12h。具体方法参阅文献(AusubelFM,BrentR,KingstonRE,etal.ShortProtocolsinMolecularBiology.Chichester:JohnWiley&Sons,Inc,1995:36-40.)。将取得的DNA溶于50μLTE缓冲液(10mMTris-HCl，1mMEDTA，PH＝8.0)中，然后保存于-20℃冰箱备用。

16SrDNA序列扩增引物由上海生物工程有限公司合成。

PCR扩增反应体系：TaqDNA聚合酶0.5μL，10×Buffer5μL，MgCl₂3μL，dNTPs(10mmol/L)1μL，引物27F1μL，引物1492R1μL，模板0.5μL，ddH₂O补足至50μL。反应条件：95℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min。16SrDNA的测序工作由上海生物工程有限公司完成。

将所测16SrDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明：本发明的菌株位于系统发育树中芽孢杆菌(Bacillus.sp)分支中，与Bacillusstratosphericus(KC172034.1)和Bacillusaltitudinis(KF054998.1)两株菌有最近的亲缘关系，其16SrRNA基因序列相似性都为99％。

该菌株在LB培养基(蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌20min，温度37℃，pH7.0。)上培养48h后菌落呈圆形，半透明，表面光滑，淡黄色，边缘整齐，菌落稍凸起。菌体呈杆状，产芽孢，革兰氏染色阳性。该菌株的生理生化特征为：甲基红试验阴性、v-p试验阴性、淀粉水解试验阴性、硝酸盐还原试验阳性、吲哚试验阴性、硫化氢试验阳性、柠檬酸盐利用试验阳性、葡萄糖发酵试验阳性、蔗糖发酵试验阳性、麦芽糖发酵试验阳性、乳糖发酵试验阴性、甘露醇发酵试验阴性、葡萄糖碳源利用试验阳性、乳糖碳源利用试验阳性、甘露醇碳源利用试验阳性、蔗糖碳源利用试验阳性、麦芽糖碳源利用试验阳性、柠檬酸碳源利用试验阴性、2﹪NaCl耐盐试验阳性、5﹪NaCl耐盐试验阳性、7﹪NaCl耐盐试验阳性、10﹪NaCl耐盐试验阳性、产氨试验阳性。由以上菌落、菌体形态，生理生化特征和16SrDNA序列分析，鉴定CGMCC9612为同温层芽孢杆菌(Bacillusstratosphericus)。

(3)蛋白降解试验

培养基及菌种制备：配制脱脂奶粉的培养基(脱脂奶粉3.0g；琼脂3.0g；去离子水200mL；pH7.0～7.2，108℃灭菌20min)。倒平板后将该菌于平板培养基中摇床培养24h(37℃)。观察透明圈大小测量透明圈半径(R)和菌落半径(r)，并测量其比值R/r。经测量其菌落半径为0.1cm，透明圈半径为0.9cm，R/r＝9。降解蛋白质效果如图7所示。

国标法测蛋白酶酶活力：用福林酚法，以酪蛋白为底物每1min生成1μg酪氨酸所需酶量定义为一个酶活(IU)。经测定PR1的蛋白酶酶活为7.493IU。

(4)解磷效果测定

将本发明筛选得到的菌株接种在蒙金娜固体培养基(葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，NaCl0.3g，MgSO₄·7H₂O0.3g，FeSO₄0.03g，MnSO₄·H₂O0.03g，CaCO₃5.0g，KCl0.3g，Ca₃(PO₄)₂25.0g，卵磷脂0.3g，琼脂18～20g，pH值7.2～7.4。)上培养一周，测量其菌落直径d、溶磷圈直径D，计算D/d，解磷圈效果如图8所示，测得第一天其菌落直径d为1.5mm，溶磷圈直径D为5mm，D/d为3.3，第三天其菌落直径d为2.5mm，溶磷圈直径D为8.5mm，D/d为3.4，第七天其菌落直径d为3.5mm，溶磷圈直径D为13mm，D/d为3.7。将PR1在无机磷液体培养基(葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，NaCl0.3g，MgSO₄·7H₂O0.3g，FeSO₄0.03g，MnSO₄·H₂O0.03g，CaCO₃5.0g，KCl0.3g，Ca₃(PO₄)₂25.0g,水1000mL，pH7.0-7.5)中培养4天后，钼蓝比色法测定培养液中速效磷的含量变化，从而反应细菌的解磷能力。测得PR1培养液中速效磷含量为43.3mg/L。

(5)产细胞分裂素能力测定

保绿法：挑选颗粒饱满、大小一致的小麦种子，用0.1％的升汞溶液浸泡15分钟消毒，然后用无菌水冲洗5次，再用吸水纸吸干表面水分。将培养皿倒置，内置两张灭菌滤纸。把小麦种子沿培养皿周围整齐的播种到培养皿中，播种时使种子胚一律朝向培养皿中心，每皿25粒，加无菌水6mL。加盖后，将培养皿放入23℃的培养箱中避光培养。24-36h后观察种子萌发情况，弃去未萌发和发芽不整齐的种子，留下发芽整齐的种子，继续培养。当麦芽顶到皿盖时，摘去皿盖，光照，继续培养，培养过程中注意适当补充蒸发的水分。

将牛肉膏蛋白胨液体培养基分装试管，每管5mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。向液体培养基中接菌，37℃，180R/min,摇床培养24h。

当小麦苗长至10cm高时，取小麦第一片真叶放到无菌水中，待用。在每管细菌悬液中加入5mL无菌水，稀释，摇动混匀，待用。另取一支装有不接菌的培养基试管，加入5mL无菌水，稀释，摇动混匀，作为对照，待用。将麦叶取出切成1cm左右的小段，装入含有不同细菌发酵液稀释液的试管及对照试管中，每管5段。25℃暗室放置4d后，目测叶片保绿情况。将保绿效果好的菌种挑选出来，重复上述步骤，再进行两次复筛。

观察可知PR1的发酵液中小麦叶子保绿效果较好，PR1可以稳定产生细胞分裂素。

(6)盆栽试验

首先是育苗，选择同一品种的烟草种子进行育苗。育苗30天后选择健壮、无病、长势一致的烟苗进行移栽，每盆栽烟1株，主要将烟苗茎杆全部埋入土内，移栽后立即浇等量的水。

然后是进行处理，一组空白对照，一组加PR1菌剂。培养得本发明菌悬液(菌悬液的菌数浓度≥10⁸cfu/mL)，作为液态菌剂使用，缓苗后灌根，每株烟苗加菌剂1mL。

摆盆：为减少因大棚不同方向温度的差异对实验结果的影响，盆子应沿与大棚垂直方向摆放。

烟草生长期内注意土壤湿度，低于土壤相对含水量50％以后则需补水至土壤最大持水量的80％(补水可根据烟株的生长和缺水情况而定，但必须保证每盆的浇水量和土壤湿度保持一致)。

移栽后每隔10天调查叶片数，株高，茎围，叶色，最大叶长、宽，长势，所处生育期等)。在盆栽进程中发现处理间长势长相有明显差异时，将对照和处理摆在一起拍照，同时将取样烟株的根系进行对比拍照。

结果如表1、表2、表3、表4、表5所示。

表1.30天PR1对烟株农艺性状的影响

注：表中数据位平均数±标准差。同列数据后不同小写字母表示差异显著性(p<0.05)，下同。

表2.60天PR1对烟株农艺性状的影响

表3.90天PR1对烟株农艺性状的影响

表4.PR1对烟株鲜重的影响

表5.PR1对烟株干重的影响

上述虽然结合附图和实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (8)

1.一株同温层芽孢杆菌(Bacillusstratosphericus)PR1，该菌株保藏编号：CGMCCNo.9612。

2.权利要求1所述的同温层芽孢杆菌的培养条件，其特征在于，采用的LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌20min，培养温度37℃，pH7.0。

3.权利要求1所述的同温层芽孢杆菌的应用，其特征在于，用于降解蛋白质和/或解磷和/或产细胞分裂素。

4.根据权利要求3所述的同温层芽孢杆菌的应用，其特征在于，用于降解蛋白质和/或解磷和/或产细胞分裂素后促进植物的生长。

5.根据权利要求4所述的同温层芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述的的植物包括烟草。

6.根据权利要求3或4或5所述的同温层芽孢杆菌的应用，其特征在于，菌株培养后得到菌悬液作为液态菌剂使用。

7.根据权利要求6所述的同温层芽孢杆菌的应用，其特征在于，菌悬液的菌数浓度≥10⁸cfu/mL。

8.根据权利要求7所述的同温层芽孢杆菌的应用，其特征在于，菌剂的使用方法：缓苗后灌根，每株烟苗加菌剂1mL。