CN111826290B - 一株红树林内生真菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一株红树林内生真菌及其应用。新菌株HS52从红树林保护区的白榄茎部组织分离而得，保藏编号为CGMCC NO.19648，根据分类学方法，该菌株是Liberomyces属的一个新种，该菌株的分类地位是Liberomyces sp。该新种的发现和利用丰富了内生真菌的可利用的菌种资源，该菌种具有促进作物生长、改善作物品质的作用，经测定接种了本申请的菌株后铁皮石斛的叶片及茎干IAA增加了8.54％和6.35％，石斛茎干多糖增加了9.95％，显著提高了铁皮石斛苗的品质。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一株红树林内生真菌及其应用。
【背景技术】
促生菌对提高农作物的生产能力，有良好的促进作用，近年来随着研究人员的不断研究努力发现了很多具有明显促生效果的促生菌，对提高农作物的生产能力、减少化肥的使用具有重要的意义，申请人一直从事这方面的研究，目前也发现并筛选了很多具有良好特性的菌株，例如，例如申请号为201410220964.7发明名称为《一种DSE菌株及其在甘蔗生产上的应用》的内生真菌，该真菌由申请人从广西北部湾红树植物分离而得，属于Devriesiasp属，该菌株具有促进铁皮石斛生长的作用；申请号为201910884589.9发明名称为《枝孢瓶霉菌株LJ1及其应用》的促生菌，该菌由申请人从土壤中分离获得，属于Cladophiaphora属，具有促进铁皮石斛生长和防治香蕉枯萎病的作用；甚至申请人还发现了一些新种，例如，申请号为201911188968.0发明名称为《新种内生真菌LZ3及其应用》的促生菌，该菌由申请人从甘蔗根围土壤分离而得中分离获得，属于Acidomelania属的一个新种，具有防治香蕉枯萎病，和促进作物生长的作用，促生菌在农业自然环境保护中具有广阔的开发利用前景。而自然界中存在很多的微生物其功能值得研究人员去不断发掘，有必要进一步在丰富多样的微生物种质资源中筛选获得更多更优异的优良菌株，为促进农作物生长提供资源保障。
【发明内容】
鉴于上述内容，为了发掘更多性状优良促生菌，促进内生菌种质资源的开发利用，本发明目的在于提供一种新种菌株Liberomyces sp.HS52及其在促进植物生长中的应用。
为达到上述目的，本发明筛选出一种新种菌株Liberomyces sp.HS52，其保藏编号为CGMCC NO.19648。属于真菌界，Delonicicolaceae科下的Liberomyces属的未知种。所述真菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19648，保藏日期为2020年06月01日。
该菌株在PDA平板培养基上的菌落形态如图1所示，28℃下培养14天后菌落直径20mm左右，呈椭圆形至近圆形，中间黑褐色，外部白色，绒毡状，不产分生孢子。
进一步的，上述菌株分离自广西防城港北仑河口红树林保护区的白榄茎部组织。
本发明还包括所述的新种菌株Liberomyces sp.HS52在促进植物生长上的应用。
本发明还包括所述的新种菌株Liberomyces sp.HS52在提高植物吲哚乙酸和多糖含量上的应用。
进一步的，所述植物为铁皮石斛。
本发明还包括一种应用所述新种菌株Liberomyces sp.HS52促进植物生长的方法，所述方法为：将菌株HS52接种到植物的组培苗和/或植株中；所述接种方法为将植物的组培苗直接移栽于接种了HS52菌株的平板上。
本发明还包括一种筛选所述新种菌株Liberomyces sp.HS52的培养基，所述培养基包括1/2玉米粉培养基和麦芽汁培养基；所述1/2玉米粉培养基主要成分含量为：玉米粉琼脂25g·L-1；琼脂粉15g·L-1；氨苄青霉素50μg·L-1；链霉素50μg·L-1；麦芽汁培养基主要成分含量为：麦芽提取物10g·L-1，酵母提取物2g·L-1，玉米粉琼脂8.5g·L-1，琼脂7.5g·L-1。
本发明具有以下有益效果：
本申请的新种菌株Liberomyces sp.HS52是申请人发现的一种新种菌株，能对植物起到良好的促生作用和改善品质的作用，特别是，能促进铁皮石斛苗的生长，尤其是能提高铁皮石斛的吲哚乙酸含量和多糖含量，是一种新型功能的种质资源；经测定接种了本申请的菌株后铁皮石斛的叶片及茎干IAA增加了8.54％和6.35％，石斛茎干多糖增加了9.95％，能显著提高铁皮石斛苗的品质。
【附图说明】
图1为本发明HS52菌株在PDA培养基上生长的菌落形态面图；
图2为本发明HS52菌株基于的ITS系统发育树图；
图3为本发明HS52菌株对铁皮石斛组培苗的促生作用效果图；图中左边为未接种HS52的CK对照组；右边为接种了HS52的处理组；
图4为本发明HS52菌株对铁皮石斛盆栽苗的促生作用效果图；图中左边为未接种HS52的CK对照组；右边为接种了HS52的处理组；
图5为接种菌株HS52对铁皮石斛盆栽苗品质影响的结果图。
【具体实施方式】
下面结合附图和实施例和试验对本发明作进一步说明。
实施例1：
本实施例筛选出一种新种菌株Liberomyces sp.HS52，其保藏编号为CGMCCNO.19648。属于真菌界，Delonicicolaceae科下的Liberomyces属的未知种。所述真菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19648，保藏日期为2020年06月01日。
上述菌株分离自广西防城港北仑河口红树林保护区的白榄茎部组织。
上述菌株的分离、筛选方法为：
(1)对采集到的红树组织样本用自来水将表面清洗干净后进行消毒，具体消毒方法为：将组织样本剪切成0.5cm×0.5cm大小的片或块，用75％乙醇振荡消毒10～30s，再用1％次氯酸钠振荡消毒1～5min(其中根3min，茎5min，叶1min)，用无菌水漂洗3次以上后放置于无菌滤纸上晾干；
(2)培养基筛选：将消毒后的红树组织块置于1/2玉米粉培养基平板上：其主要成分为：玉米粉琼脂25g·L-1；琼脂粉15g·L-1；氨苄青霉素50μg·L-1；链霉素50μg·L-1，蒸馏水1000mL，每皿3块组织块，每个样本5皿，于26℃培养箱中培养；逐日观察是否有菌丝长出，待菌丝从组织块部位长出后，挑取组织块尖端或边缘的菌丝转接到麦芽汁培养基上：其主要成分为：麦芽提取物10g·L-1，酵母提取物2g·L-1，玉米粉琼脂8.5g·L-1，琼脂7.5g·L-1，蒸馏水1000mL，获得纯化的真菌培养物。
将上述分离得到的微生物进行形态学分类和分子生物学鉴定：
1、菌株的菌落形态
该菌株在PDA平板培养基上的菌落形态如图1所示，28℃下培养14天后菌落直径20mm左右，呈椭圆形至近圆形，中间黑褐色，外部白色，绒毡状，不产分生孢子。
2、分子生物学鉴定：
将菌株HS52培养于马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)，在26℃、转速120r/min摇床中震荡培养14d后，过滤收集菌丝、菌丝体总DNA采用柱式真菌DNA提取试剂盒提取。rDNA的ITS部分区段PCR扩增采用通用引物ITS1/ITS4(White et al.1990)。PCR反应体系总体积为20μL，包括2×EasyTaq PCR SuperMix 12μL，20μmol/L的正反引物各0.5μL，模板DNA1μL，用ddH2O定容至20μL。PCR反应条件：98℃预变性2min，94℃变性40s，50℃退火1min，68℃延伸4min，30个循环；最后72℃延伸10min。28S rDNA的区段PCR采用引物LROR/LR5。PCR反应体系同ITS。PCR反应条件：98℃预变性2min，94℃变性40s，53℃退火1min，68℃延伸4min，30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物纯化后直接用于测序，测序工作委托华大基因科技有限公司完成。
序列使用ClustalX 1.81和BioEdit v7.0软件进行分析，实验获得的rDNA的ITS部分区段序列及其在GenBank中下载的最相似序列，使用MEGA4.0软件基于Kimura双参数模型构建Neighbor-Joining系统发育树，经bootstrap1000次循环检验系统树的可靠性。
测试结果：
用测序得到的ITS序列在GenBank数据库中进行DNA序列BLAST，结果显示与菌株HS52菌株亲缘关系最近的是Delonicicolaceae科下的Liberomyces属的未知种。把Delonicicolaceae科下的三个已知属的所有已知种的代表菌株的ITS序列与菌株HS52菌株的ITS序列一起构建系统发育树，结果显示，菌株HS52与Delonicicolaceae科下Liberomyces属所有物种聚在一个分枝上(支持率为77％),而且与未知种Liberomycessp.M36以99％的支持率聚在一起。因为该菌株不产生分生孢子，鉴于目前掌握的鉴定信息，将其鉴定为Liberomyces属下的一个未知种，命名为Liberomyces sp.HS52。其系统发育树图如图2所示。
实施例2：
对铁皮石斛平皿苗的促生作用：
HS52实验组：将菌株HS52活化后接种于燕麦培养基上，每皿接3个菌块，培养10-14d待菌落长大；选取长势一致的铁皮石斛组培苗移栽至菌落上，根系平铺于菌落表面，每个菌落移栽一株，培养皿放置于组培瓶中；
对照组(CK)：直接将铁皮石斛组培苗移栽在不含菌株HS52的燕麦培养基培养皿上，设计3个重复；
将上述的HS52实验组和对照组(CK)置于25℃、光照强度180μmol/(m2·s2)、光照时间为16h/d的培养箱中共培养60d；培养完成后测定两组石斛的株高、茎宽、鲜重和干重；取菌株HS52处理的部分新鲜石斛根段用于定殖观察及再分离，记录这部分根段的鲜重，其余部分称量鲜重后于烘箱干燥至恒重，测量干重，并将之前记录的根段鲜重经换算后一起计入干重。结果为平均值如表1。
上述干重称量结果如表1所示：
表1菌株HS52对铁皮石斛组培苗生长的影响
| 处理 | 株高(cm) | 茎径(mm) | 分蘖(株) | 鲜重(mg) | 干重(mg) |
| HS52 | 4.53±2.18 | 3.89±0.25** | 0.67±0.39 | 1091.25±182.6 | 157.35±71.0 |
| CK | 4.33±0.83 | 3.07±0.31 | 0.17±0.19 | 853.08±61.8 | 76.93±14.7 |
注：同列数据后**表示差异1％极显著水平。
由上表1可知，相对于CK，铁皮石斛组培苗根部添加HS52后，株高提高了0.2cm,茎径提高了0.82mm，分蘖增加了0.5个，鲜重提高了238.17mg，干重提高了80.42mg。说明HS52具有促进铁皮石斛生长的作用。由图3可见，接种HS52后的铁皮石斛相较于CK长势要好。
实施例3：
对铁皮石斛盆栽苗的促生作用：
HS52实验组：对铁皮石斛组培苗炼苗后，选取长势基本一致的石斛苗移栽至育苗杯中，每杯种植1丛，每丛5株苗，培养基质为水草，定殖约30d后浇灌菌液；其中，菌液制作方法为：在马铃薯葡萄糖液体培养基(马铃薯200.0g·L-1，葡萄糖20.0g·L-1)中接入HS52菌丝块，于26℃、转速为120r/min摇床中振荡培养14d后，用灭菌纱布过滤收集菌丝团，用灭菌水冲洗数次后，将菌丝团打碎配制成浓度为5×105CFU/m L的菌液。每丛铁皮石斛苗灌根50m L菌液，每隔15d灌根1次，总共灌根3次；
对照组(CK)：未浇菌液，其它处理方式与HS52实验组相同；
上述两组铁皮石斛接种后6个月调查铁皮石斛盆栽苗的生长指标：株高、茎径、分蘖、鲜重、干重等，并对石斛苗进行了茎干和叶片吲哚乙酸(IAA)含量和茎干多糖含量进行测定具体参见表2-表3(数据均为平均值)和图5。
表2接种菌株HS52对铁皮石斛盆栽苗生长的影响
| 处理 | 株高(cm) | 茎径(mm) | 根长(cm) | 分蘖(株) | 鲜重(g) | 干重(g) |
| HS52 | 7.53±1.65 | 4.79±0.48 | 7.54±0.91 | 4.50±1.29** | 6.63±1.72* | 1.40±0.34 |
| CK | 6.01±0.60 | 4.80±0.55 | 8.87±0.97 | 0.75±0.96 | 3.38±0.46 | 0.92±0.06 |
同列数据后*与**分别表示差异达5％显著水平和1％极显著水平。
由表2可知，盆栽铁皮石斛苗接种该菌后株高、分蘖数、鲜重、干重均比对照比均有所提高，株高增加了25.29％，分蘖增加了500％，鲜重增加了96.15％，干重增加了52.17％。
表3接种菌株HS52对铁皮石斛盆栽苗品质的影响
同列数据后*与**分别表示差异达5％显著水平和1％极显著水平。
由表3和图5可知，盆栽铁皮石斛苗接种该菌后叶片吲哚乙酸、茎干吲哚乙酸和茎干多糖的含量均高于对照组，叶片及茎干IAA增加了8.54％和6.35％，石斛茎干多糖增加了9.95％。
因此，由表2-3和图5说明接种了HS52菌株后对铁皮石斛有明显的促生作用，同时其品质还有所改善和提高。且由图4可见，接种HS52后的铁皮石斛盆栽苗相较于CK长势要好。
综上所述，本申请的Liberomyces sp.HS52菌株属于新菌株，能起到促进作物生长、改善植物品种的作用，能显著提高植物的吲哚乙酸和茎干多糖含量，具有促生和改善品质的双重功能，是一种新的微生物种质资源。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (3)
1.内生真菌菌株Liberomyces sp. HS52在促进植物生长上的应用；
所述内生真菌菌株Liberomyces sp. HS52，其保藏编号为CGMCC NO.19648；
所述植物为铁皮石斛。
2.如权利要求1所述的内生真菌菌株Liberomyces sp. HS52在提高植物吲哚乙酸和多糖含量上的应用，所述植物为铁皮石斛。
3.一种应用如权利要求1所述的内生真菌菌株Liberomyces sp. HS52促进植物生长的方法，所述方法为：将菌株 HS52接种到植物的组培苗和/或植株中；所述接种方法为将植物的组培苗直接移栽于接种了HS52菌株的平板上，所述植物为铁皮石斛。
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