CN113969252B - 根瘤菌scauy041及其用途 - Google Patents

根瘤菌scauy041及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN113969252B
CN113969252B CN202111457555.5A CN202111457555A CN113969252B CN 113969252 B CN113969252 B CN 113969252B CN 202111457555 A CN202111457555 A CN 202111457555A CN 113969252 B CN113969252 B CN 113969252B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rhizobium
scauy041
sweet potato
soil
strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111457555.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113969252A (zh
Inventor
刘轶豪
陈强
张凌子
赵珂
张紫薇
李静
廖德聪
辜运富
余秀梅
向泉桔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan Agricultural University
Original Assignee
Sichuan Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Agricultural University filed Critical Sichuan Agricultural University
Priority to CN202111457555.5A priority Critical patent/CN113969252B/zh
Publication of CN113969252A publication Critical patent/CN113969252A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113969252B publication Critical patent/CN113969252B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G22/00—Cultivation of specific crops or plants not otherwise provided for
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/08—Organic fertilisers containing added bacterial cultures, mycelia or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05G—MIXTURES OF FERTILISERS COVERED INDIVIDUALLY BY DIFFERENT SUBCLASSES OF CLASS C05; MIXTURES OF ONE OR MORE FERTILISERS WITH MATERIALS NOT HAVING A SPECIFIC FERTILISING ACTIVITY, e.g. PESTICIDES, SOIL-CONDITIONERS, WETTING AGENTS; FERTILISERS CHARACTERISED BY THEIR FORM
    • C05G3/00—Mixtures of one or more fertilisers with additives not having a specially fertilising activity
    • C05G3/80—Soil conditioners
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
    • Y02P60/20—Reduction of greenhouse gas [GHG] emissions in agriculture, e.g. CO2
    • Y02P60/21—Dinitrogen oxide [N2O], e.g. using aquaponics, hydroponics or efficiency measures

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Soil Sciences (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一株根瘤菌菌株Rhizobium tibeticum SCAUY041，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：61504。本发明分离筛选提供的西藏根瘤菌(Rhizobium tibeticum)SCAUY041具有高效共生结瘤固氮能力，并同时具有产生IAA，铁载体，溶磷、降解纤维素和几丁质等促生能力和耐盐、耐酸碱、耐旱等抗逆功能。通过在凉山光叶紫花苕子上的应用，获得能够促进凉山光叶紫花苕子生长的效果，本发明不仅增加了牧草的产量同时也提升了土壤质量改良了植烟土壤，为后茬烟叶种植以及稳定烟叶品质提供了保障，在农业生产具有较好的应用潜力。

Description

根瘤菌SCAUY041及其用途
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株根瘤菌SCAUY041及其用途。
背景技术
氮素营养是植物需求量最多，质量分数最高的营养元素，也植物生长的主要限制因子。我国农田土壤中普遍缺氮，在农业实践中施用氮肥可实现作物产量的增加和品质改善，是保障我国粮食安全和农产品供应的关键措施。但长期持续施入氮肥，会导致土壤酸化、有机质含降低等改变。近年来，由于氮肥的过量施入，导致化肥成本的持续增长超过粮食增产效益，造成增产不增收，加重了农民负担，造成了土壤中氮残留量或损失量显著增加，导致农业面源污染的加重，严重威胁着我国农业生产的可持续发展。豆科植物-根瘤菌共生体系是自然界存在的最主要的生物固氮体系之一，土壤中有70％的氮素是来自生物固氮，其中有65％是来自豆科植物与根瘤菌的共生体系，农业用地中30％-50％的氮素来自这一共生固氮体系，利用豆科植物-根瘤菌共生体系固定氮素，能起到提高作物产量和质量、减少化肥投入、提升土壤肥以及保护环境等作用，对于促进优质农产品生产、农民增收以及资源环境可持续利用等方面具有重大意义。
光叶紫花苕子(Vicia villosa var.glabresens)是豆科巢菜属一年生或越年生草本植物，喜温凉湿润气候，较耐寒耐旱，适宜海拔1500-3200m地区，尤以海拔1800-2500m区间最为适宜，光叶紫花苕子对土壤要求不高，主根粗状，入土深1-1.5m，侧根发达，主茎不明显，匍匐蔓生，有卷须，分枝长1.5-3m。光叶紫花苕子适应性强，生长快，产草量高，营养价值高，深受广大种植户喜爱，是高寒山区推广的主要当家牧草；在农业系统中光叶紫花苕子还具有保水、保肥、改土、固氮增肥作用，改善生态环境，促进农业系统的良性循环。凉山州烟区地处川西南横断山系东北缘，具备得天独厚的自然条件，是我国最适宜烟叶生产的地区之一，但由于凉山州植烟土壤的复种指数高、加之长期使用化学肥料，引起土壤板结，养分不均衡，土壤质量下降，土壤微生物多样性降低，导致烟草病虫害发生严重。凉山烟区具有长期种植光叶紫花苕子的历史，在烟田冬季空闲茬口种植光叶紫花苕子，具有充分利用光热资源和保墒的作用，还能增加土壤中有机质的含量。因此，凉山烟区公司大力推广冬季绿肥种植，采取多种形式累计推广种植适合凉山气候及土壤环境的地方品种凉山光叶紫花苕子(Vicia villosa Roth var.glabrescenscv.Liang shan)，对于稳定和提升土壤质量起到了良好的作用。然而，豆科植物需要与相应的根瘤菌互作以形成共生匹配关系，才能发挥共生固氮体系的优势，但目前并没有对凉山光叶紫花苕子根瘤菌进行系统研究，没有进行根瘤菌接种，虽然大部分种植区的土壤中存在与光叶紫花苕子相匹配的根瘤菌，但固氮效率却较低，未能充分发挥凉山光叶紫花苕子共生固氮潜力，因此需要进一步选育与凉山光叶紫花苕子匹配的高效根瘤菌菌株，充分发挥生物固氮作用，最大限度地发挥凉山光叶紫花苕子的生态效益和经济价值，既实现土地利用收益的增加，又改善土壤理化生物性状，从而达到培肥地力的目的，维持农业的可持续发展。
徐开未等人分别从从四川省凉山州盐源县、成都市温江区和蒲江县采集的野生紫花苕子以及泸州市古蔺县采集的红色紫花苕子中分离获得了V9-2、V14-2、V2-2和JSP2-5四株根瘤菌，经鉴定V9-2、V14-2和JSP2-5与Rhizobium anhuiense的16S rRNA核苷酸序列的同源性为100％，V2-2与Rhizobium fabae的16S rRNA核苷酸序列的同源性为100％，V9-2、V14-2和JSP2-5为安徽根瘤菌(Rhizobium anhuiense)，V2-2为蚕豆根瘤菌(Rhizobiumfabae)。V14-2、V2-2和JSP2-5这3株根瘤菌均能与紫花苕子结瘤共生固氮，接种后使紫花苕子鲜重产量增产29.5％，23.8％，19.1％，V9-2能与光叶紫花苕子共生结瘤固氮，接种后使光叶紫花苕子鲜重产量增产22.7％，V9-2、V14-2、V2-2这3株根瘤菌菌株具有分泌IAA、溶磷、解钾以及抗逆性强的功能JSP2-5能提高光叶紫花苕子产量及氮磷钾含量，翻压后能增加土壤有机质、速效磷、碱解氮、速效钾含量，以及土壤中三大类群微生物的数量。
虽然徐开未等人是主要是针对对紫花苕子和光叶紫花苕子的根瘤菌进行了分离以及促生效果进行了研究，但已有的研究表明，豆科植物与根瘤菌不同菌株间具有一定的选择性，同一菌种接种不同的品种，或同一品种用不同菌株接种，都会出现不同的共生效果，而且差异较大。此外，任何对根瘤菌或寄主植物的生长发育产生负面作用的环境因子，诸如温度、降水、土壤养分、盐碱度、含水量、pH等都可能对共生固氮产生影响。凉山州地域辽阔，不同地区海拔、气候、土壤等条件差异较大，同种根瘤菌在不同地区的固氮效果往往存在较大差异。此外，本发明涉及的凉山光叶紫花苕子(Vicia villosa Rothvar.glabrescenscv.Liang shan)是适合凉山多生态区种植的地方牧草品种，徐开未等筛选的根瘤菌株种类有限，V9-2、V14-2和JSP2-5是安徽根瘤菌(Rhizobium anhuiense)，V2-2为蚕豆根瘤菌(Rhizobium fabae)，且不一定适合凉山烟区的地方品种-凉山光叶紫花苕子和当地环境。因此，针对当地土壤类型以及主栽品种筛选出高效根瘤菌菌株，以进一步提高根瘤菌菌种的固氮效能、结瘤能力和竞争抗逆能力是提高根瘤菌应用效果的关键问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：为了挖掘与凉山光叶紫花苕子相匹配并适应当地环境的高效根瘤菌菌株，并将其应用于农业生产中，本发明目的之一提供一株具有抗逆、促生功能的根瘤菌，另一个目的是提供该菌株的应用。
本发明的技术方案为：根瘤菌菌株Rhizobium tibeticum SCAUY041，简称SCAUY041。该菌株已于2021年2月7日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO：61504，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
含有根瘤菌菌株Rhizobium tibeticum SCAUY041的微生物菌剂或微生物肥。
根瘤菌菌株Rhizobium tibeticum SCAUY041或上述微生物菌剂或微生物肥在凉山光叶紫花苕子(Vicia villosa Roth var.glabrescenscv.Liang shan)种植上的用途。
进一步地，所述种植是指在凉山州种植凉山光叶紫花苕子(Vicia villosa Rothvar.glabrescenscv.Liang shan)。
本发明SCAUY041的菌株的形态特征：革兰氏染色阴性，可运动，需氧，短小杆菌，无芽孢，菌体大小为(1.0-1.2)×(2.0-2.2)um，在YMA培养基上28℃培养3d后，呈圆形凸状，边缘整齐，表面湿润光滑，呈珍珠白色，半透明，粘稠，直径为2-3mm的菌落。
本发明SCAUY041菌株的16S rRNA序列测定，所测序列提交EzBioCloud网站(www.ezbiocloud.net)进行同源性比对，并利用MEGA 7.0软件进行系统发育分析。结果表明，菌株SCAUY041与Rhizobium tibeticum的16S rRNA核苷酸序列的同源性为100％。综合形态特征和16S rRNA序列同源性分析等实验结果，鉴定SCAUY041为Rhizobium tibeticum。
本发明SCAUY041菌株的DNA进行16S rRNA基因系统发育分析，为序列表SEQ IDNO.1所示。
本发明SCAUY041菌株具有产IAA、产纤维素酶、产几质酶以及溶磷等促生功能，同时具有耐盐、耐旱及耐酸碱等抗逆能力。
通过砂培实验，验证了接种菌株SCAUY041对光叶紫花苕子的生长具有明显的促进作用，光叶紫花苕子株高、根长、鲜重以及干重都相较于不接种处理(CK)，分别提高了49.33％，58.08％，46.92％和42.31％。
大田试验结果表明，接种根瘤菌SCAUY041后，凉山光叶紫花苕子的鲜重、干重、根长、株高、根瘤数、有效根瘤数、叶绿素含量及粗蛋白含量均比对照提高了39.92％、40.62％、19.33％、37.81％、61.58％、42.40％、27.25％、10.87％，每亩产量较对照增加38.74％，土壤碱解氮、速效钾、有效磷、有机质均较对照增加25.29％，17.70％、19.47％、8.32％，土壤中脲酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶、蔗糖酶均较对照提升了33.71％、21.70％、34.11％、43.38％，根际土壤中可培养细菌、放线菌、真菌和根瘤菌数量与未接种处理相比分别提高73.08％、54.81％、22.63％、24.49％，细菌和真菌群落的多样性和丰富度较对照组均显著提高。
对后茬成熟期烤烟农艺性状、干物质积累以及根系结构等指标测定结果表明，前茬接种过根瘤菌的处理，后茬烤烟的株高、茎围、有效叶数、最大叶长、最大叶宽、最大叶面积较对照组分别增加了9.35％、14.87％、14.10％、15.78％、19.02％、32.39％，干物质积累量较对照组增加了20.09％，总根长、总根面积、根平均直径、根体积、根毛数较对照组分别增加了28.80％、29.29％、13.00％、25.08％、23.10％。
本发明SCAUY041是西藏根瘤菌(Rhizobium tibeticum)，与徐开未等人获得的安徽根瘤菌(Rhizobium anhuiense)和蚕豆根瘤菌(Rhizobium fabae)在遗传特性和系统发育地位都存在明显差异；其二，促生结果表明，V14-2、V2-2和JSP2-5这3株根瘤菌均能与紫花苕子结瘤共生固氮，接种后使紫花苕子鲜重产量分别增产29.5％，23.8％，19.1％，V9-2能与光叶紫花苕子共生结瘤固氮，接种后使光叶紫花苕子鲜重产量增产22.7％，而本发明筛选的根瘤菌株SCAUY041接种凉山光叶紫花苕子后，使其鲜重增产38.74％，粗蛋白含量增加10.87％，土壤的碱解氮、速效钾、有效磷、有机质、脲酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶、蔗糖酶均较对照有显著提升，表明该菌株更适合作为地方品种-凉山光叶紫花苕子的接种菌剂，也突显了筛选适合凉山烟区凉山光叶紫花苕子-根瘤菌高效共生体的重要性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明分离筛选提供的西藏根瘤菌(Rhizobium tibeticum)SCAUY041具有高效共生结瘤固氮能力，并同时具有产生IAA，铁载体，溶磷、降解纤维素和几丁质等促生能力和耐盐、耐酸碱、耐旱等抗逆功能。通过在凉山光叶紫花苕子上的应用，获得能够促进凉山光叶紫花苕子生长的效果，本发明不仅增加了牧草的产量同时也提升了土壤质量改良了植烟土壤，为后茬烟叶种植以及稳定烟叶品质提供了保障，在农业生产具有较好的应用潜力。
保藏信息：
根瘤菌菌株Rhizobium tibeticum SCAUY041，简称SCAUY041。该菌株已于2021年2月7日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：61504，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
附图说明
图1为西藏根瘤菌(Rhizobium tibeticum)SCAUY041的菌落形态图；
图2为基于16S rRNA基因序列构建的西藏根瘤菌(Rhizobium tibeticum)SCAUY041系统发育树；
图3为西藏根瘤菌(Rhizobium tibeticum)SCAUY041通过砂培方式促进凉山光叶紫花苕子生长的效果。其中左边为不接种对照，右边为接种SCAUY041处理；
图4凉山光叶紫花苕子根际土壤细菌(A)和真菌Alpha多样性(B)。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
实施例1：根瘤菌SCAUY041的分离纯化
1.1凉山光叶紫花苕子根瘤菌的分离
2018年于四川省凉山彝族自治州会东县采集光叶紫花苕子，从光叶紫花苕子的根部，选择红色或粉红色根瘤，稍带点根完整地采摘根瘤，放入盛有CaCl2的冻存管中，并标注好采样点基本情况，带回实验室。取出采集的光叶紫花苕子样品，自来水冲洗干净根表泥土，用镊子取下饱满、体积大的根瘤放在培养皿中，用无菌水冲洗根瘤将其表面没有泥土为止。在无菌条件下，用75％的酒精对根瘤进行表面灭菌2min，之后再用0.1％HgCl2处理5min，再用无菌水冲洗3～5次。将镊子尖端灼烧，待其冷却后夹取根瘤并将根瘤压碎，蘸取内液在YMA刚果红固体培养基上划线分离，在28℃恒温培养箱中培养。挑取不吸色、菌落圆形、边缘整齐、表面光滑而隆起、湿润黏稠、略透明或半透明的典型菌落，用稀释平板划线法，纯化直至获得纯化菌株。将纯化菌株接种至YMA液体培养基中，28℃振荡培养7d后用30％甘油保种，-70℃冷冻保藏。
1.2菌株鉴定
1.21菌株形态
将菌株接种在YMA培养基上，置于28℃培养5天，观察菌株的菌落形态。
1.2.2菌株的分子鉴定
(1)试剂：溶菌酶，蛋白酶K，10×TAE，1×TE，3mol/L乙酸钠(pH4.8-5.2)，70％乙醇，(饱和酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1)，Mix。
(2)引物
Primer A：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(与16S rRNA5′端8-27位点碱基相同)；Primer B：5′-TTAAGGTGATCCAGCCGCA-3′(与16S rRNA3′端1523-1504位点碱基相同)。
(3)根瘤菌DNA提取
取少许菌体于无菌的1.5mL Eppendorf管中，加入20μl(50mg/mL)终浓度达到2mg/mL的溶菌酶，放入37℃摇床，200rmp/min，1-2h；加入20％SDS 50μL及蛋白酶K 5μL(20mg/mL)，混匀放入55℃摇床，200rmp/min处理1-2h；加入550μL(苯酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1)抽提，12000rmp/min离心10min，吸取上清(重复三次)；加入800μL无水乙醇，80μL 3mol/L乙酸钠(pH4.8-5.2)，混匀，于4℃沉淀DNA，1h，12000rmp/min，10min，弃上清；加入200μL 70％乙醇，清洗管壁1-2次，12000rmp/min，离心5min，弃上清；待乙醇挥发干后，加入50μL 1×TE溶解DNA，并于-20℃保存；1％琼脂糖凝胶电泳检测。
(4)根瘤菌16S rRNA基因扩增
16S rRNA基因扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延2min，30个循环，72℃总延伸10min。PCR产物经上海生工EZ Spin Column PCR ProductPurification Kit UNlQ-1柱式PCR产物纯化试剂盒(SK1142-N)纯化，按操作指南进行，纯化产物送生工生物工程有限公司测序。
(5)16S rRNA基因序列分析及系统发育树构建
将测序后所得序列利用BLAST软件在NCBI中进行相似性搜索，选取相似性最高已发表菌株的16S rRNA基因序列作为参比序列，采用Clustal X软件进行多序列比对分析，并通过MEGA7.0软件以N-J法构建系统发育树，确定根瘤菌的分类地位。
1.3实验结果
从凉山光叶紫花苕子根瘤中分离获得根瘤菌SCAUY041，在YMA培养基上28℃培养3d后，呈圆形凸状，边缘整齐，表面湿润光滑，呈珍珠白色，半透明，粘稠，直径为2-3mm的菌落，革兰氏染色阴性，可运动，需氧，短小杆菌，无芽孢，菌体大小为(1.0-1.5)×(2.0-2.5)um。
菌株SCAUY041进行16S rRNA序列测定，在NCBI数据库中进行BLAST同源性比对，该菌株与西藏根瘤菌(Rhizobium tibeticum)的相似性度达100％。综合形态特征、生理生化特征以及16S rRNA序列同源性分析等实验结果，鉴定SCAUY041为西藏根瘤菌(Rhizobiumtibeticum)。
实施例2：光叶紫花苕子根瘤菌的水培回接实验
2.1水培回接实验
将供试根瘤菌菌株先接到YMA斜面活化，然后转接于YMA培养液，过夜培养至对数期，其菌株的生长情况用平板法检测，计算含菌量。
光叶紫花苕子种子浸泡过夜后进行表面消毒，用无菌镊子夹取种子植入装有滤纸与无菌蛭石的培养皿中,每个培养皿种植10粒,再加入无菌水保持水分，并保持空气流通。将试验所需的镊子、滤纸、培养皿、塑料杯、蛭石、石英砂、无氮营养液灭菌。水培法营养液：KH2PO4 2.2g，MnSO4·H2O 100.0mg，KCl 15.5g，ZnSO4·7H2O 25.0mg，MgSO4·7H2O 25.0mg，H3BO3 25.0mg，CaCl2·2H2O 21.5g，CuSO4·5H2O 25.0mg，Na2MoO4·2H2O 5.0mg，NaNO33.0g，柠檬酸铁3.0g。
将灭菌后的蛭石装入塞有纱布条的塑料杯中,在下层的玻璃瓶中注入营养液，并用保鲜膜封好接口。用无菌镊子夹取催芽后的种子植入装有无菌蛭石的塑料杯中，每杯种植3粒，再沿各种子根部加入该菌液2mL，加入菌液后在表层覆盖一层石英砂。每个菌设置三个重复，并设置对照处理。培养45d，不定时补充营养液。培养结束后，小心地将光叶紫花苕子从杯中取出，清水洗净根上附着的蛭石后，测定株高、根长、鲜重、干重、根瘤数等指标。
2.2实验结果
水培实验结果表明，接种西藏根瘤菌(Rhizobium tibeticum)SCAUY041的凉山光叶紫花苕子的根瘤数为62.15个/株，植株的株高、根长、鲜重以及干重都相较于不接种处理(CK)，分别提高了49.33％，58.08％，46.92％和42.31％(表1),表明菌株SCAUY041具有较好的共生固氮能力，能明显促进凉山光叶紫花苕子的生长。
表1 SCAUY041水培实验结果(45d)
Figure BDA0003388308320000071
注：同列不同小写字母表示不同处理间在0.05水平上的差异显著
实施例3：根瘤菌SCAUY041的促生功能筛选
3.1促生功能筛选
3.1.1产IAA能力测定
取20μL菌悬液接入含0.5mol/L色氨酸的YMA液体培养基中，3次重复，设置空白对照，28℃120r/min摇床培养3d，8000r/min离心24h，取1mL菌液上清，加入2mL IAA显色液，25℃暗反应30min，530nm波长下比色，记录吸光度值。以未接菌的液体培养基为对照调零，以浓度0、5、20、40、60mg/l的吲哚乙酸标准液同上做标曲，计算出测定液中IAA的浓度。
3.1.2溶磷能力检测
将生长良好的根瘤菌菌株用无菌打孔器(d＝5mm)制成菌饼，分别将其倒置于PKO培养基上，菌饼距平板中心点2cm的4个方向，于28℃培养3d后，分别测量透明圈直径(D)和菌落直径(d)，计算二者比值(D/d)，比值越大说明溶磷效果越显著。
3.2抗逆功能筛选
3.2.1耐盐检测
将供试菌株划线于YMA培养基于28℃培养3-4d，用无菌水制成菌悬液。以NaCl浓度：0％,1％,3％,5％,7％,，制作7种YMA固体培养基，将菌悬液用无菌竹签点到培养基上，做3个重复，28℃培养3-4d，观察每株根际放线菌的生长情况并记录结果，若在某一盐浓度下菌株能正常生长，则说明该菌株有耐该盐浓度的能力。
3.2.2耐酸碱性检测
将供试菌株划线于YMA培养基于28℃培养3-4d，用无菌水制成菌悬液。以YMA培养基配方为基础，用NaOH、KH2PO4、Na2CO3、KCl、NaHCO3、Na2HPO4·10H2O、柠檬酸钠、柠檬酸三钠配置pH反应缓冲液，使培养基的pH分别达到4.0，5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，将菌悬液用无菌竹签点到培养基上，做3个重复，28℃培养3-4d，观察每株根际放线菌的生长情况并记录结果，若在某pH下菌株能正常生长，则说明该菌株有耐该酸碱度的能力。
3.2.3耐旱性检测
耐旱性的初筛试验采用聚乙二醇(PEG)6000人工模拟干旱条件进行，试验设置以下4个不同的PEG 6000水平：
(1)不加PEG 6000(对照)，仅使用YMA液体培养基；
(2)15％的PEG 6000；
(3)25％的PEG6000；
(4)35％的PEG6000。
它们对应的水势分别为：0、-0.278、-0.699、-1.309MPa。供试菌株分别挑取1环接种到已灭菌的YMA液体培养基中，置于摇床28℃、200r/min振荡培养4d制成接种液，调整OD600值约0.7左右。吸取0.1mL接种液接入不同PEG6000浓度YMA液体培养基中，28℃、200r/min摇床培养7d，然后混匀取样，在600nm下测定其OD值，以OD值的大小评价其生长繁殖状况。测定前需用相应浓PEG6000的YMA培养液对仪器进行调零。以未接菌的YMA液体培养基作为对照，若测定的OD600大于0，则表示该菌株在干旱条件下具有耐旱性。
3.3实验结果
经测定，西藏根瘤菌(Rhizobium tibeticum)SCAUY041的IAA产量为91.66mg/mL，具有溶磷能力；此外，在pH5-12，盐浓度为0.5-2％，PEG6000浓度为15％-35％的YMA培养基中生长。结果表明，根瘤菌SCAUY041具有较好的促生和抗逆功能。
实施例4：生物肥料的制备及田间应用效果
西藏根瘤菌(Rhizobium tibeticum)SCAUY041菌株田间应用
4.1菌剂制备
西藏根瘤菌(Rhizobium tibeticum)SCAUY041菌株接种在YMA斜面培养基上，于28℃恒温箱中培养至菌苔长满后，用无菌水洗下，接种于根瘤菌YMA液体培养基中，置于28℃，160r/min的恒温震荡培养至菌悬液OD值(λ＝600nm)达到0.9后，每ml含菌量不低于2×1010cfu/ml，接种灭菌好的泥炭混合均匀，湿度保持在50％-60％，置于26℃培养至每g含菌量不低于2×109cfu/g，于阴凉干燥的环境保存6个月其含菌量不低于2×108cfu/g且不影响其接种效果。
4.2菌剂SCAUY041田间应用效果
实验材料：凉山地方牧草品种凉山光叶紫花苕子。
实验地点：凉山州会东县
播种前半小时选择阴暗处进行拌种，将光叶紫花苕子的种子置于网状尼龙袋中清洗后置于的塑料盆中与含有根瘤菌菌剂的泥炭(菌数>2×108cfu/ml)进行拌种，在阴暗处风干至不粘手即可播种。种植面积1亩，同时进行不接种对照试验。在光叶紫花苕子的盛花期采集草样与土样，采用30cm×30cm的样方随机在小区内进行取样，为排除边际效应，小区两边各两行不取样。
4.2.1凉山光叶紫花苕子生长和生理指标测定
采集的光叶紫花苕子样本带回实验室，清洗去泥后，分别测定植株的株高，根长，鲜重，干重，根瘤数，有效瘤数，叶绿素含量，粗蛋白含量及产量。
4.2.2土壤理化及酶活测定
采集光叶紫花苕子根际土壤样品各分为3份，一份用于测定土壤中的碱解氮、速效钾、速效磷、有机质等理化指标，以及脲酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶、蔗糖酶等土壤酶活的测定。
4.2.3土壤微生物数量及种群多样性分析
采集的另外两份土壤样品，一份用土壤微生物的平板计数；另一份用
Figure BDA0003388308320000091
SPIN Kit for Soil(MP BIO Laboratories,California,USA)试剂盒提取土壤总DNA，采用引物515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和907R(5'-CCGTCAATTCCTTTGA GTTT-3')对细菌16S的V4-V5区进行扩增，采用引物ITS3-2024F(5'-GCA TCGATGAAGAACGCAGC-3')和ITS4-2409R(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')对真菌进行ITS2测序扩增。扩增完成后，后续文库构建、Miseq测序、序列拼接均在派诺森Illumina MiSeq测序平台进行。高通量测序数据的生物信息学分在派诺森基因云(https://www.genescloud.cn/home)进行。根据序列相似度，将有效序列聚类为OTU(97％相似度)，对OTU进行物种注释获得各样品的分类学信息，计算细菌和真菌多样性并获得相关指数。
4.3根瘤菌SCAUY041的田间应用效果分析
4.3.1对凉山光叶紫花苕子生长结果分析
接种根瘤菌SCAUY041后，凉山光叶紫花苕子的鲜重、干重、根长、株高、根瘤数、有效根瘤数、叶绿素含量及粗蛋白含量均比对照提高了39.92％、40.62％、19.33％、37.81％、61.58％、42.40％、27.25％、10.87％(表2)，每亩产量较对照增加38.74％(表3)。结果表明，根瘤菌SCAUY041具有较强的竞争能力，能迅速在凉山光叶紫花苕子根部定殖并结瘤，增加了有效根瘤的数量，增强了根瘤菌与凉山光叶紫花苕子根系共生结瘤能力，从而能固定较多的氮素供植物吸收利用，进而提高叶绿素含量，增强植株的光合作用，增加了植株的生物量，提升了凉山光叶紫花苕子的品质和产量。
表2接种SCAUY041菌剂对光叶紫花苕子生长的影响
Figure BDA0003388308320000101
注：同列不同小写字母表示不同处理间在0.05水平上的差异显著
表3接种SCAUY041菌剂对光叶紫花苕子产量的影响
Figure BDA0003388308320000102
注：同列不同小写字母表示不同处理间在0.05水平上的差异显著
4.3.2对土壤理化及酶活的测定结果
接种根瘤菌SCAUY041后，凉山光叶紫花苕子根际土壤中的碱解氮、速效钾、有效磷、有机质均较对照增加了25.29％，17.70％、19.47％、8.32％，土壤中脲酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶、蔗糖酶均较对照提升了33.71％、21.70％、34.11％、43.38％(表4)。结果表明，接种根瘤菌改善了根际生态，增加了植物和土壤中可利用的氮素含量，提高了微生物分解有机质的速率，促进了土壤微生物参与土壤中养分的转化，从而提高了土壤酶活性，提升了土壤肥力，为后茬作物的生长提供了良好的条件。
表4接种SCAUY041菌剂对土壤理化性质的影响
Figure BDA0003388308320000111
注：同列不同小写字母表示不同处理间在0.05水平上的差异显著
4.3.3对土壤微生物数量的分析
接种根瘤菌SCAUY041处理的根际土壤中可培养细菌、放线菌、真菌和根瘤菌数量显著高于不接种处理(表5)，与未接种处理相比分别提高73.08％、54.81％、22.63％、24.49％，结果表明接种根瘤菌SCAUY041刺激了土壤中土著微生物的繁殖，提高了可培养微生物的数量，特别是改善了土壤的微生态条件。
表5接种SCAUY041菌剂对凉山光叶紫花苕子根际土壤(单位：cfu/g)
Figure BDA0003388308320000112
注：同列不同小写字母表示不同处理间在0.05水平上的差异显著
4.3.4对土壤微生物菌群多样性分析
选取Chao1、Shannon、Simpson以及Observed_species指数来评估和分析接种根瘤菌SCAUY041和未接种(对照组CK)的凉山光叶紫花苕子根际土壤微生物多样性和丰富度。由图4可以看出接种根瘤菌SCAUY041凉山光叶紫花苕子根际土壤中细菌和真菌的Chao1、Shannon、Simpson以及Observed_species指数均显著高于未接种的对照组(图4中A，B)(p<0.05)，说明接种根瘤菌SCAUY041后，凉山光叶紫花苕子根际土壤中细菌和真菌群落的多样性和丰富度较对照组均明显提高，表明根瘤菌SCAUY041增加了凉山光叶紫花苕子根际土壤微生物的多样性，提高了微生物群落结构的复杂性，增强了其稳定性，为植株健康生长构建了良好的土壤生态环境，促进了植株的生长。
实施例5接种根瘤菌SCAUY041对后茬烟草生长的影响
5.1实验安排
供试植物：烤烟云87
实验地点：凉山州会东县
在凉山州会东烟区收割完接种根瘤菌SCAUY041光叶紫花苕子后，在试验点继续种植烤烟，施肥量按正常水平减施10％。会东烟区烤烟种植正常施肥量：烟草专用复合肥30kg/亩(N:P2O5:K2O为2：3：5)，商品有机肥50kg/亩，油枯20kg/亩。根据《YC/T 142-2010烟草农艺性状调查测量方法》于烤烟成熟期(烟苗移栽后70d)选取长势均匀一致且具代表性的5株烟株分别测定烤烟株高、茎围、有效叶片数等农艺性状，测定烤烟根系结构、活力及烤烟干物质含量。烤烟根系结构采用EPSON1680根系扫描仪(Epson，LongBeach，USA)对各组样品根系进行扫描，扫描完成后，用WinRhizo2005a根系分析软件进行分析，获得根系总根长度、总表面积、总体积和总根毛数等形态指标。烤烟根、茎、叶分别在105℃杀青20min，75℃烘干至恒重后测定生物量。
5.2实验结果
接种根瘤菌SCAUY041的凉山光叶紫花苕子收割后，在试验点继续种植烤烟云烟87，对其成熟期烤烟农艺性状测定结果表明，前茬接种过根瘤菌的处理，后茬烤烟的株高、茎围、有效叶数、最大叶长、最大叶宽、最大叶面积较对照组分别增加了9.35％、14.87％、14.10％、15.78％、19.02％、32.39％(表6)，干物质积累量较对照组增加了20.90％(表7)，总根长、总根面积、根平均直径、根体积、根毛数较对照组分别增加了28.80％、29.29％、13.00％、25.08％、23.10％(表8)。综合实例4的研究结果，说明前茬种植凉山光叶紫花苕子并接种根瘤菌后提高了土壤中氮素和其他土壤养分含量，优化了土壤微生物群落结构，改善了后茬烤烟根系生长环境，增强了根系活力，促进了烤烟对养分的吸收利，从而带动烤烟的生长和物质的积累。因此，接种根瘤菌SCAUY041不仅增加了当季凉山光叶紫花苕子的产量，也通过改善土壤质量，促进了后茬作物烤烟的生长。
表6对烤烟农艺性状的影响
Figure BDA0003388308320000121
注：同列不同小写字母表示不同处理间在0.05水平上的差异显著
表7对烤烟干物质积累的影响
Figure BDA0003388308320000122
注：同列不同小写字母表示不同处理间在0.05水平上的差异显著
表8对烤烟根系结构的影响
Figure BDA0003388308320000123
注：同列不同小写字母表示不同处理间在0.05水平上的差异显著。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 根瘤菌SCAUY041及其用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1364
<212> DNA
<213> Rhizobium tibeticum
<400> 1
ttaacacatg caagtcgagc gccccgcaag gggagcggca gacgggtgag taacgcgtgg 60
gaacgtaccc tttactacgg aataacgcat ggaaacgtgt gctaataccg tatgtgccct 120
ttgggggaaa gatttatcgg taaaggatcg gcccgcgttg gattagctag ttgggggggt 180
aaaggcctac caaggcgacg atccatagct ggtctgagag gatgatcagc cacattggga 240
ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga caatgggcgc 300
aagcctgatc cagccatgcc gcgtgagtga tgaaggccct agggttgtaa agctctttca 360
ccggtgaaga taatgacggt aaccggagaa gaagccccgg ctaacttcgt gccagcagcc 420
gcggtaatac gaagggggct agcgttgttc ggatttactg ggcgtaaagc gcacgtaggc 480
ggatcgatca gtcaggggtg aaatcccaga gctcaactct ggaactgcct ttgatactgt 540
cgatctggag tatggaagag gtgagtggaa ttccgagtgt agaggtgaaa ttcgtagata 600
ttcggaggaa caccagtggc gaaggcggct cactggtcca ttactgacgc tgaggtgcga 660
aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgaatgt 720
tagccgtcgg gcagtatact gttcggtggc gcagctaacg cattaaacat tccgcctggg 780
gagtacggtc gcaagattaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 840
catgtggttt aattcgaagc aacgcgcaga accttaccag cccttgacat gcccggctag 900
ctacagagat gtagtgttcc cttcggggac cgggacacag gtgctgcatg gctgtcgtca 960
gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctcg cccttagttg 1020
ccagcattca gttgggcact ctaaggggac tgccggtgat aagccgagag gaaggtgggg 1080
atgacgtcaa gtcctcatgg cccttacggg ctgggctaca cacgtgctac aatggtggtg 1140
acagtgggca gcgagacagc gatgtcgagc taatctccaa aagccatctc agttcggatt 1200
gcactctgca actcgagtgc atgaagttgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1260
cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gttggtttta 1320
cccgaaggta gtgtgctaac cgcaaggagg cagctaacca cggt 1364

Claims (5)

1.根瘤菌菌株Rhizobium tibeticum SCAUY041，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：61504。
2. 含有权利要求1所述的根瘤菌菌株Rhizobium tibeticum SCAUY041的微生物菌剂。
3. 含有权利要求1所述的根瘤菌菌株Rhizobium tibeticum SCAUY041的微生物肥。
4. 权利要求1所述的根瘤菌菌株Rhizobium tibeticum SCAUY041或权利要求2所述的微生物菌剂或权利要求3所述的微生物肥在凉山光叶紫花苕子（Vicia villosa Roth  var.glabrescenscv.Liang shan）种植上的用途。
5. 根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述种植是指在凉山州种植凉山光叶紫花苕子（Vicia villosa Roth var.glabrescenscv.Liang shan）。
CN202111457555.5A 2021-12-02 2021-12-02 根瘤菌scauy041及其用途 Active CN113969252B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111457555.5A CN113969252B (zh) 2021-12-02 2021-12-02 根瘤菌scauy041及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111457555.5A CN113969252B (zh) 2021-12-02 2021-12-02 根瘤菌scauy041及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113969252A CN113969252A (zh) 2022-01-25
CN113969252B true CN113969252B (zh) 2023-05-02

Family

ID=79590551

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111457555.5A Active CN113969252B (zh) 2021-12-02 2021-12-02 根瘤菌scauy041及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113969252B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104277994A (zh) * 2014-04-16 2015-01-14 四川农业大学 一株中华根瘤菌SCAUs65及其应用
CN106167774A (zh) * 2016-07-06 2016-11-30 四川省原子能研究院 根瘤菌Scot1305及其在促进植物修复土壤重金属污染中的应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2017010294A (es) * 2015-02-09 2018-02-09 Bioconsortia Inc Microbios, composiciones de microbios, y consorcios beneficiosos para la agricultura.
CN107904192B (zh) * 2017-12-26 2020-06-02 四川农业大学 根瘤菌v9-2及其应用
CN110257283B (zh) * 2019-06-14 2021-08-06 中国农业大学 一株适合黄淮区的耐药抗逆固氮的慢生根瘤菌及其应用
EP4006173A1 (en) * 2019-12-10 2022-06-01 Universidade de Évora Microbial compositions based on native rhizobia strains and method of improving legume pastures in acid soils with manganese toxicity
CN113999804B (zh) * 2021-12-02 2023-01-24 四川省烟草公司凉山州公司 根瘤菌scauy033及其用途
CN114181852B (zh) * 2021-12-02 2023-03-10 四川农业大学 放线菌菌株scaut001及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104277994A (zh) * 2014-04-16 2015-01-14 四川农业大学 一株中华根瘤菌SCAUs65及其应用
CN106167774A (zh) * 2016-07-06 2016-11-30 四川省原子能研究院 根瘤菌Scot1305及其在促进植物修复土壤重金属污染中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113969252A (zh) 2022-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106987541B (zh) 一株具有抗逆、促生性能的高效苜蓿根瘤菌及其应用
US8252720B2 (en) Use of Gluconacetobacter with reduced use of nitrogen fertilizer to improve beet crop production
CN114107118B (zh) 放线菌菌株scaut009及其应用
CN110669691B (zh) 一种防治植物线虫病害的巨大芽孢杆菌及其应用
US20220369648A1 (en) Endophytic falciphora oryzae fo-r20 and its application
CN114181852B (zh) 放线菌菌株scaut001及其应用
CN116103158B (zh) 一株抗病促生的高山被孢霉菌、含有该菌的菌剂及其应用
CN114015615B (zh) 放线菌菌株scaut011及其应用
CN114015614B (zh) 放线菌菌株scaut013及其应用
CN114381379B (zh) 一株具有提高石斛幼苗萌蘖能力的胶膜菌菌株tp-8及其应用
CN101748088B (zh) 一种根瘤固氮菌株系ry3菌株及其应用
CN109749953B (zh) 蜡样芽孢杆菌、菌剂及其制备方法和应用
CN108841748B (zh) 中华根瘤固氮菌株系h6及其应用
CN113999804B (zh) 根瘤菌scauy033及其用途
CN109486711B (zh) 一种根瘤菌axlq16 及其应用
CN108841761B (zh) 促进三叶草生长和/或提高三叶草产量的方法及其所用菌剂
CN108034604B (zh) 根瘤菌jsp2-5及其在改善烟地轮作土壤上的应用
CN113969252B (zh) 根瘤菌scauy041及其用途
CN101781630A (zh) 一种根瘤固氮菌株系ry1菌株及其应用
CN109355234B (zh) 一种根瘤菌yzm0144及其应用
CN109439589B (zh) 一种根瘤菌yzlh133及其应用
CN114891658B (zh) 一种箭筈豌豆根瘤菌株系hbuj010033及其应用
CN112646734B (zh) 一株兰花菌根真菌pf06及其应用
CN117586931B (zh) 一种木糖氧化无色杆菌ivf-wk240及其用途
CN111172041B (zh) 一株对杂花苜蓿有明显增产效果的根瘤菌株

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant