CN111172041B

CN111172041B - 一株对杂花苜蓿有明显增产效果的根瘤菌株

Info

Publication number: CN111172041B
Application number: CN201911415850.7A
Authority: CN
Inventors: 石凤翎; 闫伟; 钱亚斯; 张雨桐; 乔雨
Original assignee: Inner Mongolia Agricultural University
Current assignee: Inner Mongolia Agricultural University
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2023-03-17
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN111172041A

Abstract

本发明涉及中华根瘤菌SJN2017及其应用，属于农业微生物应用领域。所述中华根瘤菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16414。本发明的中华根瘤菌显著提高杂花苜蓿的产量，尤其是内蒙古西部地区广泛种植的耐盐碱苜蓿品种草原3号杂花苜蓿。

Description

一株对杂花苜蓿有明显增产效果的根瘤菌株

技术领域

本发明适于农业微生物的应用领域，本发明主要针对苜蓿的高产栽培条件之一接种根瘤菌而进行的，具体而言，涉及一株中华根瘤菌及利用其提高杂花苜蓿的产量。

背景技术

在苜蓿高产栽培的过程中，采用播前根瘤菌接种，可以有效提高苜蓿牧草产量。其中选择与各苜蓿品种相匹配的有效菌株进行接种是其增产与否的重要环节。而在实际生产中选择最佳匹配的菌株主要考虑寄主植物及种植区的土壤环境两方面因素，通常因土著根瘤菌、土壤养分、与寄主匹配等差异会导致接种效果不佳。

近年来，内蒙古西部地区种植的耐盐碱紫花苜蓿品种大规模推广种植，而且内蒙古的奶业企业伊利、蒙牛等的迅猛发展使得呼和浩特地区的苜蓿种植面积的不断的扩大，但在产量及质量方面与国外相比还有很大的差距。为了获得最大的经济效益，过去在杂花苜蓿的育种、施肥、灌溉、病虫害防治以及苜蓿的收获、加工、运输贮存等关键技术研究方面做了许多工作，但对筛选与之相匹配的根瘤菌株进行接种从而达到最大增加效益的研究尚未见报道，尤其以内蒙古西部地区的盐碱种植环境，因此，在内蒙古西部地区进行根瘤菌的采集并与杂花苜蓿进行各个种植区的匹配筛选，是至关重要的。

发明内容

本发明对杂花苜蓿在内蒙古西部4个试点栽培区(沙尔沁、海流图、内蒙古农业大学校区试验基地、关碾房)进行适宜根瘤菌的匹配筛选，首先分别从其种植区采集苜蓿属互接种族内(苜蓿属和草木樨属的牧草)的根瘤，经分离纯化及16SrDNA鉴定分类后，进一步进行室内初步筛选及田间复筛，通过对接种后苜蓿植株的生长情况的测定，分析筛选对杂花苜蓿增产效果明显的根瘤菌株，为这些试点区杂花苜蓿的高产栽培提供依据。

从沙尔沁、海流图、内蒙古农业大学校区试验基地、关碾房4个苜蓿栽培基地，采集苜蓿属互接种族内牧草材料的根瘤，从中分离纯化得到17份苜蓿根瘤菌菌株，并通过16SrDNA进行鉴定；经各项生长指标分析，通过室内无菌试验初步筛选得到土著根瘤菌株促生能力强于商用菌株DZ，其中JZ9表现较为优异，将其命名为SJN2017。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一株中华根瘤菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16414，保藏日期为2018年09月03日，保藏地址为北京市朝阳区北辰路1号院3号。该菌采集自内蒙古西部苜蓿种植区的土著根瘤菌株。经鉴定，是一株中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)，命名为SJN2017。

保藏信息：

分类命名：中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏编号：CGMCC No.16414；

保藏日期：2018年09月03日；

保藏地址：北京市朝阳区北辰路1号院3号。

本发明还提供了一种接种根瘤菌促进苜蓿种子增产提质的应用方法，包括以下步骤：将灭菌后的椰砖基质装入育苗盘，湿润，待含水量70％左右后，每穴放入发芽并浸泡过菌液的种子1粒，再加入中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)的根瘤菌菌液，分别于生长30d、60d、90d时测定其各生物量指标；其中，苜蓿种子先用95％乙醇浸泡3min后用0.1％HgCl₂灭菌3min后用无菌水清洗10次。将灭菌后的种子在无菌的培养皿内发芽48h，幼苗长0.5～1cm；而根瘤菌液采用如下方法制备：用不加琼脂的YEMA培养基培养菌株4天，测其OD值λ＝600为0.5左右。

本发明通过对内蒙古西部地区种植的各苜蓿属、草木樨属材料根部根瘤菌的采集、分离、鉴定以及室内、各个种植区的筛选，为内蒙古西部各地区推广种植的杂花苜蓿筛选与其相匹配的根瘤菌株SJN2017，尤其适用于对广泛种植的3号杂花苜蓿有明显促进生长效果，以期用运到实际生产推广中。

本发明相对于其他类似发明的显著技术效果在于：

1、由于根瘤菌与苜蓿相匹配必须根据苜蓿品种、根瘤菌、栽培环境三者协同才能取得最佳产量效果，本发明是以适宜内蒙古地区种植豆科牧草的当家品种草原3号杂花苜蓿筛选有明显促生作用的根瘤菌株。

2、本发明的根瘤菌株是采集分离自内蒙古西部苜蓿种植区的不同土壤养分条件下、不同苜蓿品种根部的土著根瘤菌株。而其余发明都是选用商用根瘤菌株或研究表明的具有明显促生作用的高效菌株，但结果表明，筛选自本地的土著根瘤菌株要强于商用菌株的效果。

附图说明

图1：根瘤菌菌株JZ9的16S rDNA基因序列的邻接系统发育树；

图2：根瘤菌菌株JZ9的16S rDNA基因序列信息；

图3：无菌试验条件下接种根瘤菌对草原3号杂花苜蓿株生长的影响。

具体实施方式

实施例1.菌株的采集和鉴定

1试验地概况

根瘤菌株采集于4个苜蓿种植试点区，分别为内蒙古自治区呼和浩特市土默特左旗沙尔沁试验基地、海流试验基地，属准温带大陆性季风气候，年均温6.3～7.2℃，年降水量379～400毫米，无霜期133～140天；呼和浩特市内蒙古农业大学校区试验基地，属典型的蒙古高原大陆性气候，年均温3～6.7℃，年降水量335.2～534.6毫米，无霜期113～134天；鄂尔多斯市达拉特旗关碾房试验基地，属典型的温带大陆性气候，年均气温6.1～7.1℃，年均降水量240～360毫米，无霜期135～150天。

2材料与方法

2.1根瘤菌菌株目录

供试苜蓿品种为草原3号杂花苜蓿(M.varia Martin.cv.Caoyuan No.3)。供试菌株编号DZ为北京克劳沃公司购买的苜蓿菌种，其余为自采，均为苜蓿互接种族内菌株(表1)，以下实施例，菌株JZ9为本发明保藏的菌株SJN2017的简称。

表1供试菌株寄主植物及采集地一览表

2.2试验方法

2.2.1根瘤采集方法

将生长1年-2年的苜蓿、草木樨属材料根部全部挖出，根部与根部土一起装入塑封袋，带回实验室后，立即将根部土溶于水，裸漏出根瘤后，采集淡粉或粉红色饱满的根瘤，立即进行分离纯化培养。

2.2.2根瘤菌的分离与纯化方法

配制刚果红YEMA培养基，灭菌并分倒入培养皿里。根瘤用0.1％升汞溶液浸泡1分钟后用无菌水冲洗3-5遍，放在超净工作台备用。将根瘤菌用灭菌的镊子压碎后加入一小滴无菌水，然后用灭菌的接种环蘸碾碎的根瘤菌液，在凝固后的培养基上划线。待长出根瘤菌落后(4～5天)再次进行划线纯化培养，4～5次待没有杂菌后。开始保藏并且鉴定。

YEMA刚果红培养基的配制：

甘露醇10ɡ，酵母粉0.4ɡ、K₂HPO₄ 0.5ɡ、MgSO₄.7H₂O 0.2ɡ、CaCl₂.6H₂O 0.3ɡ、NaCl0.1ɡ、刚果红(1％)1ml、琼脂18ɡ、dH₂O 1000ml、微量元素液4ml(微量元素液：H₃BO₃ 5ɡ、Na₂MoO₄5ɡ、dH₂O至1000ml)配制，于1000ml试剂瓶中调pH至7。

2.2.3根瘤菌的鉴定方法

DNA模板的提取：

DNA提取所需试剂

a.1×TE:50m M Na Cl，5m M EDTA-Na2，50m M Tris-HCl，PH8.0-8.2

b.3 M Na Ac-1m M EDTA-Na2，PH7.0

c.20％SDS

d.P:C:I(苯酚:氯仿:异戊醇)＝25:24:1(v/v)

e.C:I(氯仿:异戊醇)＝24:1(v/v)

f.溶菌酶：配制成50mg/m L的溶菌酶溶液，-20℃保存备用。

g.蛋白酶K:配制成20mg/m L，-20℃保存备用。

h.RNase:用10m M Tris-HCl,15m M Na Cl,PH7.5，溶液配成10mg/m L浓度，100℃水浴保温15min，缓慢冷却至室温，分装，-20℃保存备用。

DNA模板的提取参照试剂盒步骤。

16SrDNA PCR扩增引物分别为:

P1:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3

P2:5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’

16S r DNA PCR反应体系体积均为50μl，反应体系组成如下：

按上述组分配制好反应液，分装于PCR管中，加入模板DNA混匀后进行PCR反应。PCR反应条件：

PCR扩增产物的检测PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶，100V、40min水平电泳，溴化乙锭(EB)染色10-15min，凝胶成像系统UV拍照，检查有无条带和非特异性扩增，目标条带约1500bp(以100bp Marker作为标记)。

序列测定及序列数据分析:

将PCR产物送至华大基因公司测序，通过Internet网(http://www.ncbi.nlm.nihgov/blast.cgi)进行比对，再用Mega(4.0)程序包中的Neighbor-Joining法构建系统进化树，确定各根瘤菌在微生物系统发育学上的地位(图1)，其中确定了JZ9株菌的16SrDNA序列分析(图2)，菌株JZ9现保存于中国微生物菌种保藏中心，命名为SJN2017，CGMCC No.16414。

实施例2.无菌条件下根瘤接种试验方法

将灭菌后的椰砖基质装入育苗盘(高11cm，直径6cm)，湿润，待含水量70％左右后，每穴放入发芽并浸泡过菌液的种子1粒，再加入3ml菌液，分别于生长30d、60d、90d时测定其各生物量指标(株高、根长、根瘤数量及重量、干重、叶绿素)。将筛选到的优良菌株进行大田筛选试验。

种子制备：苜蓿种子先用95％乙醇浸泡3min后用0.1％HgCl₂灭菌3min后用无菌水清洗10次。将灭菌后的种子在无菌的培养皿内发芽48h，幼苗长0.5～1cm。

根瘤菌液：用不加琼脂的YEMA培养基培养菌株4天，测其OD值λ＝600为0.5左右(超过0.5用不加菌的培养基稀释，不足0.5继续培养)。

无菌条件下接种不同菌株对草原3号杂花苜蓿生长的影响如图3所示。

实施例3.根瘤大田接种试验方法

试验于在沙尔沁试验基地进行。将无菌条件下筛选得到的优良菌株同后采集未经室内筛选的3个菌株在3个试点区与草原3号杂花苜蓿进行接种匹配筛选，试验设计为接种处理及不接种对照，采用自制丸衣种子进行接种播种，每个处理3个重复，小区面积3×3m²，小区间隔30cm。草原3号杂花苜蓿1.62kg(0.02kg/小区)及育苗盘筛选得到的优良菌株同后采集的5株菌株(前期未采集的两个苜蓿属材料，直接在大田中筛选而未进行室内试验，菌株寄主植物及采集地见表2)。

丸衣种子制备：

(1)根瘤菌液：同育苗盘菌液配制。

(2)泥炭吸附剂：泥炭488.5g；蔗糖1g；过磷酸钙0.5g；石灰10g；钼酸钠(0.5％)1ml；硼酸(0.5％)1ml；121℃高压灭菌30min。

(3)根瘤菌剂：制备好的菌液和泥炭吸附剂按1：2比例混匀。

(4)丸衣种子：15g根瘤菌液加入4～5ml浓度为4％的粘着剂(阿拉伯糖)，搅拌均匀，再加入100g种子，反复搅拌，使每粒种子上都粘有根瘤菌剂(含菌量不少于109/粒)。

表2大田试验条件下接种根瘤菌对草原3号杂花苜蓿株生长的影响

结果分析

1无菌试验条件下接种不同菌株对草原3号杂花苜蓿生长的影响

如图3所示，从接种效果上来看，本研究中在无菌试验条件下接种根瘤菌菌株JZ9的植株与CK相比，株高、根长、根瘤重、单株干重等接种有效性指标差异显著(P<0.01)。

综合各项指标得出，在温室育苗盘中在无其他菌干扰的条件下，15个接种处理综合表现优异的是JZ5、JZ9、JZ14、JZ17与DZ。

2大田试验条件下接种不同菌株对草原3号杂花苜蓿生长的影响

如表2所示，在沙尔沁大田试验中，接种根瘤菌菌株JZ9的处理单株干重显著CK及其余处理，高于CK 88.8％，高于商品菌株DZ 17％。

3根瘤菌菌株JZ9的分类地位

16SrDNA因具有信息量大、保守性强、普遍性及快速简便的特点而被称为分子进化钟，被作为系统分类研究的最合适的指标，在现代细菌分类学上以此作为重要的依据之一。本发明结合根瘤菌回接结瘤试验，对效果优良的JZ9株菌进行了16SrDNA序列分析，证实了其属于苜蓿中华根瘤菌属(Sinorhizobium)，现称剑菌属(Ensifer)。

Claims

1.一株中华根瘤菌，分类命名为中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)，保藏编号为CGMCCNo.16414。

2.权利要求1所述中华根瘤菌用于提高杂花苜蓿产量的应用。