CN108676744A - 一种巨大芽孢杆菌菌株zt-p及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种巨大芽孢杆菌菌株ZT‑P及其应用，菌株ZT‑P为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium.)，其性质为溶解有机磷无机磷菌，于2018年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCC NO.15602。本发明提供的菌株ZT‑P活力高，适应性强，可广泛用于土壤中减肥减药的微生物肥料的处理中。菌株ZT‑P制成的微生物肥料经过试验，在第5天的时候摇瓶中的溶磷量达到最大156.7μg/mL。与诱变前相比，菌株的溶磷率提高了20％，缩短了土壤中有机磷和无机磷的溶解速率。说明制成的微生物有机肥缩短了土壤中有机磷和无机磷的溶解周期和溶解量。

Description

一种巨大芽孢杆菌菌株ZT-P及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物领域，涉及一种具有溶解无机有机磷的巨大芽孢杆菌菌株ZT-P及其在土壤肥料方面的应用。

背景技术

现代的农业生产对于化肥的多功能性和高效率性有极大的要求。随着科学技术的不断发展，化肥使用量的逐年增加，农耕土壤受到的影响也越来越大。化肥的使用量每年都有增加，随之而来的是化肥的利用率和肥效越来越低，农作物增产效率逐年降低与化肥使用量逐年增加，土壤肥力也随之下降，土壤荒漠化越来越严重；农药的使用量也在逐年上升，引起了环境的污染以及农产品中农药残留的超标；农耕土壤生态环境恶化，生态功能下降。

虽然传统化肥可快速提高农作物产量，但是如果长期大面积、大量的使用，不仅对农作物产量提高的效率会大大下降，而且会对环境造成严重污染。微生物肥料相对于传统化肥所体现的优势正是在于对农作物产量提高的持续有性，以及它对于环境的友好性。如果用微生物有机肥部分的替代传统化学肥料，则能在一定程度上，起到增加土壤中的有效养分含量，提高肥料利用率的作用。将微生物肥料、有机肥、传统无机化肥三元结合，能够最大程度的开发和利用土壤中蕴藏的养分资源，提高农作物的产量，并在一定程度上提升农作物的品质。所以对于微生物有机肥的研究、开发和应用，具有很大的研究价值和市场前景，对于农业的可持续发展也具有特别重要的意义。它在环境净化与生态系统的平衡，营养元素的转化，土壤肥力的提高与保持和提高化肥利用率，促进农作物的生长，拮抗土壤病原菌，等方面都起着重要的作用。我们应当充分利用和发挥微生物肥料的以上诸多功能和优点，从而为现代农业的生产和农业可持续发展服务。随着生活品质的提高，现代人类的饮食结构已经同以前大不一样，对粮食的摄入在逐年下降，取而代之的是高品质的水果、蔬菜。所以在一定程度上，肥料市场对于微生物肥料的需求促进和推动了它的发展。目前中国的国家生态示范区，绿色和有机农产品基地等都在大规模使用微生物有机肥料，微生物肥料近年来的市场占有比重也在逐年增加，慢慢的在农业生产中转变为主力军，带来越来越明显的生态效益、社会效益和经济效益。

微生物肥料，也称作微生物制剂、生物肥料和菌肥。国家农业部微生物肥料标准的定义：含有一定量的活性微生物，并且通过其生命活动，补充和增加植物营养元素的供应量(包括土壤和生产环境中植物元素的供应量和植物营养元素的可用供应量)，又能分泌一定的植物生长激素或控制有害微生物活动的活体成品。日本主要委员会对于微生物肥料的定义：应用到土壤中，通过微生物的生命活动来起作用的一种制剂，能够促进土壤中植物的生长。我们国家，又把微生物肥料叫做细菌肥料、生物肥料。如果按照微生物肥料成品中含有的微生物种类，则可以分为以下五大类。第一，固氮细菌肥料类(自生或联合共生类)、溶磷细菌肥料类、解钾细菌(硅酸盐细菌)肥料类、根瘤菌肥料类、光合细菌肥料类；第二，放线菌肥料(如抗生菌类)；第三，真菌类肥料，包括外生菌根菌剂和内生菌根菌剂(VA菌根菌剂、兰科菌根菌剂)；第四，藻类肥料(如固氮蓝藻)；第五，复合型生物肥料，通过固体吸附剂，将多种不能功能的肥料菌混合搅拌在一起，起到吸附作用；或者直接采用液体发酵后混合，甚至可以将多种细菌接入发酵罐一起发酵。

农耕土壤中的磷主要有三种形式，由于土壤本身的特性，其含有的无机磷也存在一定的区别。在碱性和中性土壤中，主要以磷酸钙和磷酸镁的化和态形式存在；在酸性土壤中主要以磷酸铁和磷酸铝形式存在；最后一类就是闭蓄态磷(Occludedphosphorus)，是磷酸盐被铁铝化合物胶膜包裹形成的难溶的化合物。可溶性游离态的磷在酸性的土壤中被铁和铝固定后，再进一步陈华脱水形成的难溶性磷酸盐。磷酸铁(FePO₄)和磷酸铝(AIPO)在土壤中的容积度和溶解度都很低，在湿润的条件下时，他们能够转化成另一种容积度更小的基性磷酸铁[FePO₄·Fe(OH)₃]和基性磷酸铝[AIPO₄·Al(OH₃)]等。随着进一步的反应，在表面形成了由氢氧化铁和氢氧化铝组成的胶模，这层胶质将基性磷酸铁和磷酸铝包裹起来，使他很难被溶解。一般在酸性且有机质含量少的土壤中闭蓄态磷的含量较高。土壤pH超过7之后，一般都以磷酸钙形式存在。

目前，溶磷细菌的主要有巨大芽孢杆菌，无色杆菌，假单胞菌属，枯草芽孢杆菌，蜡样芽孢杆菌，不动细菌，肠细菌。溶磷真菌：曲霉，青霉，但现有的溶磷细菌存在活性不足、适应性差等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种巨大芽孢杆菌菌株，属芽孢杆菌属，以解决现有技术中土壤溶磷量不足，土壤中有效磷较少的困扰，本发明所提供的溶磷菌ZT-P不仅具有溶磷作用，还能够促进植物发芽率。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种溶磷菌株ZT-P，经鉴定该菌株属于巨大芽孢杆菌属(Bacillus megaterium)ZT-P，其性质为溶解有机磷无机磷菌，于2018年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCC NO.15602。地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

该菌株呈现典型的巨大芽孢杆菌菌落形态，菌落为圆形，白色，长时间放置后有褶皱，形态巨大。显微镜下观察有芽孢。

本发明还提供了菌株ZT-P在土壤溶磷中的应用。

本发明还提供了菌株ZT-P在制备微生物肥料中的应用。

本发明还提供一种微生物肥料，该微生物肥料包括本发明所述的菌株ZT-P。

本发明所述的微生物肥料，其中，肥料成品中活菌总浓度优选为0.8～1.2CFU/g，优选为1×10⁸CFU/g。

本发明的有益效果：

1.本发明所述的菌株ZT-P是从不同样本中分离、筛选到高效降解无机磷的优势巨大芽孢杆菌菌种，对其进行紫外诱变，得到的正向突变其具有高效降解无机磷能力的菌株，经过多次传代仍保留其属性。并且经过12h后就能在LB培养基上生长，在生孢培养基中培养24小时芽孢数量能达到1×10⁸CFU/ml。说明本发明提供的巨大芽孢杆菌活力高，适应性强，遗传性高，而且本发明所述菌株ZT-P可以在35-55℃下生长，具有很好的耐高温特性，适用范围更广。

2.本发明提供的巨大芽孢杆菌菌种ZT-P，可广泛用于土壤中无机磷，有机磷变成植物可利用的有效磷的过程，也可广泛用于土壤中减肥减药的微生物肥料的处理中。以该菌株诱变后的稳定菌株制成的微生物肥料经过试验，溶磷细菌在第5天的时候摇瓶中的溶磷量达到最大156.7μg/mL。与诱变前相比，菌株的溶磷率提高了20％，缩短了土壤中有机磷和无机磷的溶解速率。说明制成的微生物有机肥缩短了土壤中有机磷和无机磷的溶解周期和溶解量。再通过植物生长的中试研究，为土壤中磷的转化提供理论参考，能够开发出能够应用于农业生产的微生物肥料。

3.通过紫外诱变筛选获得的溶磷菌ZT-P，经过驯化成高效稳定的菌株并制成微生物肥料，经过菌株摇瓶上清液的催芽试验，接种溶磷菌ZT-P，水稻植物的发芽率为80％，芽长与对照相比提高了2.45倍。根长与对照相比提高了1.82倍。因此，此菌株制成的微生物肥料既可以增加土壤中的有机质含量，培肥地力，改善土壤结构，又可以促进植物发芽和生根，有利于实现农业的可持续发展，同时减少了化肥和农药的使用量，降低了农业面源污染，提高作物产量及品质。

附图说明

图1本发明提供的溶磷菌ZT-P的菌落形态；

图2菌株ZT-P未诱变前在PVK平板上的透明圈；

图3菌株ZT-P诱变后在PVK平板上的透明圈；

图4培养时间对诱变前与诱变后的芽长根长比较；

图5诱变前后溶解磷酸三钙的量比较；

图6诱变前后溶解卵磷脂量的比较；

图7诱变后的ZT-P连续传代的溶磷圈大小。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件。

本研究采用以下4种指标作为ZT-P具有溶磷的评价标准，即溶磷量、植物发芽率、植物芽长、植物根长。

①溶磷量：在较短时间内能够使无机磷转变为有机磷。

②植物发芽率：使用此菌株有利于提高植物发芽率或不影响植物发芽率。

③植物芽长：能过促进芽的生长。

④植物根长：能过促进根的生长

实施例1溶磷菌ZT-P的筛选与鉴定

培养基配方：LB Trptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，固体培养基加入15g-18g的琼脂粉，蒸馏水定容至1000mL。121℃，20min。

PVK培养基：Glucose 10g，Ca₃(PO₄)₂ 5g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 0.2g，MgSO₄ 0.1g，KCl 0.2g，酵母浸膏0.5g，MnSO₄ 0.002g，FeSO₄0.002g，0.4％溴酚蓝6mL，蒸馏水定容至1000mL。121℃，20min。

蒙金娜解无机磷培养基：Glucose 10.0g，(NH₄)₂SO₄0.5g，KCl 0.3g，NaCl 0.3g，MgSO₄·7H20 0.3g，FeS0₄·7H₂O0.03g，MnS0₄·4H₂O 0.03g，Ca₃(PO₄)₂(无机磷源)10g，pH7.0～7.5固体培养基加入15g～18g的琼脂粉，蒸馏水定容至1000mL。121℃，20min。蒙金娜解有机磷培养基：Glucose 10.0g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，KCl 0.3g，NaCl 0.3g，MgS0₄·7H₂00.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，软磷脂(有机磷源)0.2g，pH 7.0～7.5固体培养基加入15g～18g的琼脂粉，蒸馏水定容至1000mL。121℃，20min。

生孢培养基：Glucose 1g，peptone 1g，酵母膏0.7g，MgSO₄.7H₂O 0.2g，K₂HPO₄1.0g，(NH₄)₂SO₄ 0.2g，固体培养基加入15g-18g的琼脂粉，蒸馏水定容至1000mL。121℃，20min。

1)采取溶磷圈法初步筛选具有溶磷作用的溶磷细菌。

准确称取土壤样品10g，将其放入已经装有90mL无菌水和玻璃珠的250mL锥形瓶中，置于28℃，180rpm的恒温摇床中震荡30min。然后取10mL上清液至干净无菌试管中，利用漩涡震荡仪逐级稀释，取为10^-2，10^-3，10^-4的土壤稀释液各100μL在PVK平板上涂布，置于28℃恒温培养箱培养4D，挑取能够形成透明圈的单菌落，然后采用三区划线法挑取单菌落于PVK平板上继续纯化。挑取能够继续形成透明圈的单菌落于LB液体培养基中，28℃，180rpm隔夜培养，用50％灭菌甘油和菌液等体积混合置于-70℃超低温冰箱中保种。

2)溶磷圈的制作与利用

在改良的PVK平板上分区，用牙签钝头挑取单菌落后，轻轻在PVK平板上转圈，注意不要戳破平板，然后置于28℃恒温培养箱中培养3D，用直尺测定菌落的直径和透明圈的直径，计算透明圈与菌落的直径比。

3)未诱变前的菌株鉴定

采用伯杰氏细菌手册上的方法，测定分离菌株的生化特性，结果如表1

表1菌株ZT-P诱变前的生理生化特性

该表显示菌株ZT-P诱变前的生理生化结果与巨大芽孢杆菌相符，属巨大芽孢杆菌属。

4)紫外诱变的筛选

将原始菌株接种于LB液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养12h，至OD600＝1.0时，离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。将菌悬液放入已灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数达10⁸个/ml左右，作为待处理菌悬液。取2～4mL制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射90s-120s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。取未照射的制备菌液和照射菌液各0.1ml进行稀释分离涂布。待长出单菌落后划线到LB固体培养基中，然后长出单菌落后点到PVK平板上，寻找比诱变前透明圈大的菌株，获得菌株ZT-P，其菌落形态如图1所示，经鉴定该菌株属于巨大芽孢杆菌属(Bacillus megaterium)ZT-P，于2018年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCC NO.15602。地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

4)菌株ZT-P溶磷能力的测定

在250ml的三角瓶中加入100ml无机磷液体培养基中和100ml有机磷液体培养基，并分别以磷酸三钙和卵磷脂为磷源，121℃灭菌20分钟。将培养至对数期的溶磷菌按1％体积分数的接种量分别接入到液体培养基中。以不接菌的处理为空白对照1，以接未诱变的未空白对照2。每个处理3个重复，置于37℃、170r/min摇床培养3天，每天定时取样5ml，将菌液以4℃，5000r/min离心10min，采用钼锑抗比色法测定上清液的水溶性磷含量。并测定上清液pH值的变化。如图5和图6所示，本发明所提供菌株ZT-P可明显提高磷酸三钙和卵磷脂的溶解，具有更好的溶磷能力。继续培养在第5天的时候，菌株ZT-P摇瓶中的溶磷量达到最大156.7μg/mL。与诱变前相比，菌株的溶磷率提高了20％，缩短了土壤中有机磷和无机磷的溶解速率。说明制成的微生物有机肥缩短了土壤中有机磷和无机磷的溶解周期和溶解量。

5)诱变后的菌株传代培养

菌株ZT-P未诱变前在PVK平板上的透明圈如图2所示，菌株ZT-P诱变后在PVK平板上的透明圈如图3所示。诱变后对其菌株进行5代的传代培养，然后在PVK固体培养基上反复划线纯化。在PVK平板点板培养直到有透明圈的出现。出现观察并记录透明圈的直径(D，cm)和菌落直径(d，cm)，计算其比值H，即H＝D/d。经观察测得，5代培养后的诱变菌株ZT-P得到的水解圈的H值相同，目测观察透明圈大小也是相同的大小，说明此诱变菌株具有稳定性和遗传性，如图7所示。

实施例2溶磷菌ZT-P的菌株摇瓶上清液的催芽试验

植物种子表面消毒：挑选饱满的水稻种子，用自来水充分冲洗，然后再用蒸馏水洗净；用75％乙醇浸泡3min，弃去75％乙醇后再用1.6％次氯酸钠浸泡3min，无菌水洗涤5～10次，直至没有次氯酸钠的味道为止。

把溶磷细菌按照1％的接菌量接入到100/250mL的LB培养基中置于37℃、180rpm恒温摇床中培养3D；将得到的发酵产物用10000rpm离心10min，保留上清液备用。发酵产物对水稻种子萌发的影响(发芽率、发芽势、根长、芽长)：本试验共设置3个处理，每个处理设3个重复，即对应的富集液体培养基，未诱变前的发酵原液，诱变后的菌株发酵原液。将制备好的发酵液按对应的稀释浓度稀释好，置于灭菌的锥形瓶中；然后将已经进行过表面消毒的水稻种子加入到对应的3个处理液中浸种12h；将浸种的水稻种子用镊子转移至玻璃平板上，玻璃平板底部垫有灭过菌的滤纸片，每个平板总再加入5mL无菌水；置于22℃恒温培养箱中避光培养，每隔24h统计水稻的发芽数，对蒸发较快的平板适当补水；在第5天时，在统计发芽数的基础上，每个平板随机挑取3个水稻种子测量根长和芽长。结果如图4所示，本发明提供菌株ZT-P可明显促进根和芽的伸长。

Claims (9)

1.一种溶磷菌株ZT-P，保藏编号CGMCC NO.15602。

2.权利要求1所述的菌株ZT-P在土壤溶磷中的应用。

3.权利要求1所述的菌株ZT-P在促进植物发芽或生根中的应用。

4.权利要求1所述的菌株ZT-P在制备微生物肥料中的应用。

5.一种微生物肥料，该微生物肥料包括本发明所述的菌株ZT-P。

6.权利要求5所述的微生物肥料，其特征在于肥料成品中活菌总浓度为0.8～1.2CFU/g。

7.权利要求5所述的微生物肥料，其特征在于肥料成品中活菌总浓度为1×10⁸CFU/g。

8.权利要求5～7任一项所述微生物肥料在土壤溶磷中的应用。

9.权利要求5～7任一项所述微生物肥料在促进植物发芽或生根中的应用。