CN101575574B - 一种哈茨木霉类复合菌培养物及其在植保方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明为一种哈茨木霉类复合菌培养物及其在植保方面的应用，属生物技术领域。其菌种已由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，分类命名为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)MDCGTH 18，保藏编号为CGMCCNO.2965。本发明所提供的哈茨木霉MDCGTH 18复合菌培养物是利用拮抗性微生物进行生物防治，同时又具有诱导植物抗病性及增产功能，对山杨根腐病、苹果轮纹病、柑橘黄龙病、西瓜枯萎病、烟草青枯病、小麦赤霉病、全蚀病、根腐病、纹枯病、黄瓜白粉病、霜霉病、蔬菜灰霉病、枯萎病等多种疫病有显著防治效果，可以单独用作植物病害的生物防治菌剂，也可以与其他生物杀菌剂、植物抗生素、植物生长调节剂以及现有杀菌剂进行复配，制备适用于不同植物病害防治的各种生物杀菌剂。

Description

一种哈茨木霉类复合菌培养物及其在植保方面的应用

技术领域：

本发明涉及哈茨木霉菌与毛壳菌复合菌的筛选、培养方法以及在生物防治菌剂中的应用，属于生物技术领域。

技术背景：

在世界范围内，植物病害普遍地给农业生产造成严重的损失。生产上主要以化学防治为主，不仅药剂难以长期持续有效，还严重污染环境。农作物施用农药后，极大影响品质，且严重危害人体健康，导致人畜中毒等后果。随着人类环保意识的加强，大力发展绿色农业已经成为新的时代要求，生物防治作为绿色农业的内容越来越受到人们的关注。在植物病害生物防治领域中，微生物所发挥的作用越来越大，微生物农药的研究逐步成为生物防治的支柱产业。

目前，植物病害的生防菌多是从土壤、根际或植物体表分离的真菌和细菌，但其所处的生态环境因受到外界的紫外线、暴风雨和化学物质等恶劣环境因素的影响，致使其定殖力差，往往在实验室中有一定的防治效果，而在大田生产实际中往往会出现防效不稳定。加之由于生物防治菌对化学杀菌剂普遍敏感，且有效期短，对多数疫病难以起到防治作用，严重限制了其应用范围。因此，增加生物防治菌的抗化学杀菌剂的能力、扩大对病菌的防治范围，成为当前急需解决的技术难题，而以多种菌株组合群体发展成具有防治作用兼增产作用的菌剂是生物防治的发展趋势。

发明内容：

本发明着眼点在于筛选对多种植物病原菌有抑菌活性并且具有抗化学杀菌剂能力的复合菌株，使其能够防治多种病害，且又具有增产作用，在多效性及广谱性上优于目前的微生物制剂。

本发明人以植物生态学原理为基础，经过大量实验，从植物根际土壤和植物组织上分离得到具有优良抗病促生长基因的毛壳菌与哈茨木霉菌菌株，经筛选、纯化、抑菌能力测试等挑选出抑菌能力强、抑菌谱宽的优良菌株，然后将筛选出的优良菌株进行复配，最终得到复合微生物菌剂。经过实验室、盆栽和大田实验，证明本发明复合微生物菌剂可以直接对病原菌产生拮抗作用和诱导作物产生抗病作用，且攻克了哈茨木霉和毛壳菌对化学农药非常敏感这一重大难题。另外，本发明的定殖性好、受环境影响小，能与植物长期共存，作用稳定持久。实验同时表明，本发明在防治多种植物病害的同时，对植物生长具有显著促进作用，使综合防治与作物增产的目的实现成为可能。

本发明提供了一种可用于植物保护的复合微生物菌种，该菌种为哈茨木霉菌与毛壳菌复合菌种，分类命名为哈茨木霉(Trichodermaharzianum)MDCGTH 18，已由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)进行保藏，地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏日期为2009年3月19号，保藏编号为CGMCCNO.2965。

本发明还提供了该复合菌种的筛选分离以及复合菌培养物(也可称为复合菌剂)的制备方法。

具体操作如下：

1.菌种筛选

(1)哈茨木霉菌的筛选

①样品的采集：采集样品为苹果园土，地点为山东莱芜。用铁铲拨开表层泥土，直至见到有植物根系存在的土层，将土壤铲出，用聚乙烯袋装好，带回实验室。

②分离纯化：将土壤均匀打散，于70～85℃水浴20min，用无菌生理盐水作梯度稀释，并分别取0.1ml滴入TSM培养基平板上，用灭菌的L形玻璃棒涂匀，置28℃恒温箱中培养2～4天。挑取菌落形态近似木霉菌的单菌落，转接固体PDA平板纯化培养，经镜检初步鉴定为木霉菌，编号保存于PDA斜面上。

上述固体PDA培养基：取土豆200g，洗净切成小块，用水煮沸30min，用纱布过滤，保留滤液，加入10g葡萄糖，15g琼脂，定容至1000ml，121℃灭菌20min备用；无菌操作加入氯霉素，使培养基氯霉素含量达到100μg/ml。

上述TSM培养基(木霉菌半选择培养基)：MgSO₄·7H₂O 0.2g，K₂HPO₄，0.9g，KCI 0.15g，NH₄NO₃ 1.0g，葡萄糖3.09，玫瑰红0.159，60％敌克松可湿性粉剂0.3g，PCNB0.2g，琼脂15g，水1000mL，121℃灭菌20min备用；无菌操作加入氯霉素，使培养基氯霉素含量达到100μg/mL。

③抑菌能力测定。分别在PDA平板中央移入直径5mm的指示病原菌菌饼，在距菌饼2.5cm处点接自行筛选出的哈茨木霉菌株，28℃培养5～7天，记录抑菌带宽度，每个处理设3次重复。选择抑菌带宽、抑菌能力强的菌株为制取复合菌剂的菌株。

(2)毛壳菌的筛选

①样品的采集：山东莱芜果园桃树下距地表15cm处土样两份。

②筛选：分别称取2g不同土壤样品各放入一个三角烧瓶中，每瓶加无菌水20ml、搅拌均匀后加棉塞，置于28℃恒温箱中培养3d，然后在无菌室内分别接0.5ml菌悬液到液体培养基中(液体培养基内预先放入一条1cm×5cm的滤纸提供碳源)，在28℃恒温箱中培养7d，挑选在滤纸条上生长的菌落，分别接入灭菌后的平皿培养基进一步培养3～4d后，挑取少许菌落制成玻片，镜检确定毛壳菌菌株。

上述液体培养基为：(NH₄)₂SO₄ 0.2g，MgSO₄ 0.05g，KH₂PO₄ 0.1g，CaCl₂ 0.1g，H₂O 100ml，pH5.5；121℃灭菌20min备用。

上述平皿培养基为：CMC-Na 20g，KH₂PO₄ 2g，(NH₄)₂SO₄ 1.4g，MgSO₄ 0.3g，CaCl₂ 0.3g，FeSO₄·7H₂O 5mg，MnSO₄1.6mg，ZnCl₂ 1.7mg，琼脂20g，H₂O 1000ml，pH5.5；121℃灭菌20min备用。

③分离纯化：从平皿培养基中挑取长有毛壳菌的菌落，按照平皿稀释划线法分离接种。将划线接种平皿倒置于28℃恒温箱中培养3d，选择典型的毛壳菌单菌落，转接到相应的斜面培养基上经培养后得到纯的毛壳菌菌种。

④抗菌能力强的毛壳菌的筛选：将筛选出的纯种毛壳菌分别培养16、18、24h后，在平皿中加入10ml含多菌灵(10μg/ml)的RA，在27℃下继续培养。结果表明，大多数毛壳菌在0.5μg/ml多菌灵的浓度下不能存活，能存活的少数也不能生长。挑选出抗多菌灵的毛壳菌菌株，测定对其菌丝生长的抑制(处理菌落半径/对照菌落半径)，继代培养，挑出在高于0.5μg/ml的多菌灵处理下正常生长菌株，保存，为制取复合菌剂的菌株。

(3)哈茨木霉(Trichoderma harzianum)MDCGTH 18菌种的制取

将上述筛选出的优势明显的毛壳菌菌株与哈茨木霉菌菌株，按2∶1比例进行混合，即获得用于制备本发明所述复合菌培养物的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)MDCGTH 18菌种。

2.哈茨木霉类复合菌培养物的制备方法

按以下步骤进行，以下均为重量比或重量百分比。

(1)斜面菌种：采用固体PDA培养基(配制方法同前)，将哈茨木霉(Trichoderma harzianum)MDCGTH 18复合菌种接种在试管培养基上，28℃培养2～3天。

(2)茄瓶菌种：采用液体PDA培养基(配方与固体PDA相同，但不使用琼脂)，将试管菌种接种在茄瓶液体培养基中，置于摇床上28℃振荡培养3～4天。

(3)液体菌种：采用种子培养基：玉米粉2％，葡萄糖0.5％，豆饼粉1％，磷酸氢二钾0.2％，磷酸二氢钾0.3％，碳酸钙1％，pH6.0，121℃灭菌40min，将1～2个茄瓶的种子用无菌水洗下，接种于150立升的种子罐内，30℃培养，通气量1∶0.6～0.8，搅拌速度为200r/min，培养时间为36～48h。

(4)固体菌种：采用的培养基：固体PDA培养基与麸皮、稻壳及玉米粉的重量份数分别为1∶7∶1∶2，含水量为70％(其中包括接种的液体菌种的水分)，pH6.0，121℃灭菌40min后，以循环水冷却，在混合接种器内将液体菌种与固体培养基混合均匀，接种量为5～10％，接种完毕转移到固体培养室内培养，在温度30℃下，培养3～7天，即获得含菌量为2×(10⁸～10⁹)菌株/ml的哈茨木霉类复合菌培养物。

上述关于菌种筛选及培养中，除具体说明的工艺条件外，其余均参照类似现有技术。

3、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)MDCGTH 18在防治植物病害方面的试验效果对比

(1)MDCGTH 18生物活性测定

①MDCGTH 18的抑菌能力测定

分别在PDA平板中央移入直径5mm的病原菌菌饼，在距菌饼2.5cm处点接待测菌株，28℃培养5～7天，记录抑菌带宽度，每个处理设3次重复。

指示病原菌株：蔬菜灰霉病菌Bc-6，串珠镰刀菌Fm26，麦根腐镰刀菌Fg2，由青岛农业大学提供；麦长蠕孢菌Hs11，苹果轮纹病菌Mk8，棉花枯萎病菌V19，由山东轻工业学院菌种保藏中心保存；纹枯病菌RC46和小麦全蚀病菌V32，由山东农业大学提供。MDCGTH 18的抑菌谱见表1。

表1MDCGTH 18的抑菌谱(mm)

注：数据为三次重复的平均值。

由表1可见，微生物菌剂MDCGTH 18的抑菌谱较宽，抑制病原菌的数量达到8种(还能抑制其它多种病原菌)，抑菌数量是生防制剂TO26的2.6倍。MDCGTH 18的抑菌谱比目前存在的生防制剂都要宽。

②MDCGTH 18的促生能力测定

黄瓜种子(京新2000)用MDCGTH 18(2×10⁸cfu/ml)浸泡30min后播种到健康土中，每盆20粒，重复三次，以清水作为对照。在温室中(15～30℃)培育45天后全部采样调查单株主根长、单株干重。结果见表2。

增产率％＝(处理单株干重-对照单株干重)×100％/对照单株干重。

表2MDCGTH 18的促生试验

注：数据为三次重复的平均值。

由表2可见，经过MDCGTH 18菌剂浸泡过的黄瓜主根长度和单株干重都明显增加，分别是对照的1.4倍和1.6倍；增产率达到61.3％，而用清水浸泡的黄瓜没有表现出增产能力。实验证明，MDCGTH 18菌剂能够起到促进作物生长、提高作物产量的作用。

(2)MDCGTH 18与锐顶镰孢菌对峙试验

①实验设计

将供试菌在平板培养基上培养4d后，在超净工作台内用灭过菌的打孔器分别取同质同量的拮抗菌及锐顶镰孢菌，分置于同一PDA平板培养基上进行对峙培养，镰孢菌单置一平板培养基上培养做对照，各3个重复，置于25℃下培养6d，每天测量菌落直径。实验设计如表3

表3拮抗菌与锐顶镰孢菌对峙试验

②实验结果分析：实验结果如表4、表5、表6。

A、毛壳菌与锐顶镰孢菌对峙实验结果

表4毛壳菌与锐顶镰孢菌对峙培养的菌落直径(mm)

实验结果表明，毛壳菌对锐顶链孢菌有很强的抑制作用，由于毛壳菌的抑制作用，锐顶镰孢菌从培养第3天就开始停止生长，而且毛壳菌越接近锐顶链孢菌，气生菌丝越茂盛，充分表明自然界生物间对空间和营养基地的竞争，二者之间出现明显的拮抗线。而对照的锐顶链孢菌在生长到6d后长满平皿。

B、木霉菌与锐顶镰孢菌对峙实验结果

表5木霉菌与锐顶镰孢菌对峙实验的菌落直径(mm)

实验结果表明，木霉菌对锐顶镰孢菌也有很强的抑制作用。木霉菌的产孢量很大，在培养第3天就出现孢子圈，抑制了生长，在培养第6天时，锐顶镰孢菌菌落仅为10.1mm，而对照的锐顶镰孢菌培养6d后长满平板。

C、毛壳菌与木霉菌复合菌MDCGTH 18与锐顶镰孢菌对峙实验结果

表6MDCGTH 18与锐顶镰孢菌对峙实验的菌落直径(mm)

实验结果表明，MDCGTH 18对均有很强的抑制作用，而毛壳菌与木霉菌之间亦相互竞争。开始木霉菌生长速度较快，但以后毛壳菌生长速度加快，甚至超过木霉菌，或与之平分秋色。到培养后期，木霉菌产生大量分生孢子，可覆盖住，而逐渐逼近毛壳菌。毛壳菌的竞争优势表现在菌丝生长速度快，能快速占领空间；木霉菌竞争优势是能产生大量孢子，扩大生存空间。

实验证明，MDCGTH 18是山杨根腐病病原菌很好的拮抗菌，对锐顶镰孢菌有较强的抑制作用。毛壳菌的竞争优势在于气生菌丝生长速度快，而木霉菌竞争优势在于产孢量大而扩大生存空间。用这两种菌拌土培根使山杨根腐病的发病率降低，可作为山杨根腐病生物防治的措施之一。

(3)MDCGTH 18对其它疫病的防治效果

除了对锐顶镰孢菌有较强抑制作用外，MDCGTH 18对西瓜枯萎病、烟草青枯病、小麦赤霉病等多种由真菌、细菌引起的植物病害有很好的防治作用，防治效果见表7。

表7MDCGTH 18对某些疫病的防治效果

用MDCGTH 18微生物制剂浸根处理对西瓜枯萎病和烟草青枯病苗期防效都达100％。自筛的毛壳菌与哈茨木霉菌的防治促生长效果比现有的菌剂明显，将两种优良菌株混合复配后效果更佳，对小麦赤霉病、西瓜枯萎病和烟草青枯病、山杨根腐病的田间防效分别为76.4％、73.1％和79.6％、81.01％，并有明显的增产作用，比现有的毛壳菌与哈茨木霉菌以及某些菌剂防治效果好，生防水平显著提高。

本发明还提供了该复合菌培养物在防治植物病害方面的应用。

从以上试验对比可以看出，MDCGTH 18是利用拮抗性微生物进行生物防治，同时又具有诱导植物抗病性反应的功能，对山杨根腐病、苹果轮纹病、柑橘黄龙病、西瓜枯萎病、烟草青枯病、小麦赤霉病、全蚀病、根腐病、纹枯病、黄瓜白粉病、霜霉病、蔬菜灰霉病、枯萎病等多种疫病有显著防治效果，可用作防治上述植物病害的生物杀菌剂。MDCGTH 18能够在诱导植物抗病性反应的同时促进植物生长，由于其具有较高的酶活性，一方面可以利用产生的代谢产物如纤维素酶、几丁质酶等分解土壤中植物残体的纤维素、几丁质，增加土壤中的营养成分含量，促进土壤中有机质转化，产生的植物生长素又有益于植物根系的发育，促进植物生长。

本发明所述复合菌培养物可以单独用作植物病害的生物防治菌剂，也可以与其他生物杀菌剂、植物抗生素、植物生长调节剂以及现有杀菌剂进行复配，例如：与拟康氏木霉菌、枯草芽孢杆菌、巨壳菌、小盾壳霉菌、甲壳素、寡糖素、复硝酚钠、复硝酚钾、氯吡脲(果果佳)等复配，用于制备适用于不同植物病害防治的各种生物杀菌剂。

本发明的优点在于：

(1)MDCGTH 18复合菌剂本身对病原微生物有较强的抑制作用，抑菌同时又能诱导植物自身产生抗性来控制病害。

(2)与现有哈茨木霉菌株在培养条件相同的情况下，本发明自筛哈茨木霉菌株生长速度快，菌丝粗大，子囊壳黑色，与原菌株呈现出不同的生长状况。这一特性缩短了育菌周期，使其产业化更加方便、容易。

(3)实验证明，该菌剂在非选择压力下连续培养十代，抗药稳定性不变，该性状说明其目的基因表达非常稳定，有利于这一菌剂应用于植物病害的综合防治的实践中；

(4)通过实验发现，具有生物防治作用的MDCGTH 18对植物还有促生作用，能够将植物病害生物防治和植物促生作用紧密地联系起来。采用本发明复合菌剂，能持续控制晚疫病，提高生防效果，保护环境。将优良菌株的定殖能力、代谢产物、诱导杭病作用以及对植物促生作用有机地接合起来。

(5)MDCGTH 18菌剂在植物病害的生物防治中具有持续有效、防治效果好、又可以改善土壤肥力，减少化学农药造成的环境污染，对人畜安全、无残留、特异性强等优点，有利于保护环境、保持生态平衡。本发明复合菌剂研究周期短，投人低，易于产业化商品化开发，为农业可持续发展创造条件。

具体实施方式：

实施例1

本发明复合菌剂对黄瓜白粉病防治及促进黄瓜增产的对照实验。

选用MDCGTH 18菌剂、多菌灵、粉锈宁三种防治产品用同样的方法处理种子与植株，再选用不经过处理的种子与植株作为对照实验。处理方法如下：用4％浓度的菌剂浸泡种子5小时；用2％浓度的菌剂在幼苗期对苗床喷洒2次，三日一次；生长期对叶花喷洒3次，五日一次；开花期喷洒3次，五日一次；果期对果叶喷洒3次，七日一次。在黄瓜幼苗3d时每组选择20株接种白粉病菌，观察其染菌数量、病情指数及最终的增产情况，结果见表8。

表8三种防治产品对黄瓜增产与白粉病防治效果

注：以上实验重复三次，数据取其平均值。

由上表可以看出，用MDCGTH 18菌剂处理后，对黄瓜白粉病的防治效果非常好，达到85％，使黄瓜增产35.6％，而其它产品根本没有增产效果，对白粉病防治效果很差。由此可见，MDCGTH 18菌剂对防治黄瓜白粉病及提高黄瓜产量有很大作用。

Claims (4)

1.一种哈茨木霉类复合菌培养物，其特征在于菌种为哈茨木霉菌与毛壳菌复合菌种，分类命名为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)MDCGTH 18，已由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCCNO.2965。

2.如权利要求1所述的一种哈茨木霉类复合菌培养物，其特征在于所述的菌种哈茨木霉(Trichoderma harzianum)MDCGTH 18中，毛壳菌与哈茨木霉菌菌株比例为2∶1。

3.如权利要求1所述的一种哈茨木霉类复合菌培养物的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：

(1)斜面菌种：采用固体PDA培养基，将哈茨木霉(Trichoderma harzianum)MDCGTH 18复合菌种接种在试管培养基上，28℃培养2～3天；

(2)茄瓶菌种：采用液体PDA培养基，将试管菌种接种在茄瓶液体培养基中，置于摇床上28℃振荡培养3～4天；

(3)液体菌种：采用种子培养基：玉米粉2％，葡萄糖0.5％，豆饼粉1％，磷酸氢二钾0.2％，磷酸二氢钾0.3％，碳酸钙1％，pH6.0，121℃灭菌40min，将1～2个茄瓶的种子用无菌水洗下，接种于150升的种子罐内，30℃培养，通气量1∶0.6～0.8，搅拌速度为200r/min，培养时间为36～48h；

(4)固体菌种：采用的培养基：固体PDA培养基与麸皮、稻壳及玉米粉的重量份数分别为1∶7∶1∶2，含水量为70％，pH6.0，121℃灭菌40min后，以循环水冷却，在混合接种器内将液体菌种与固体培养基混合均匀，接种量为5～10％，接种完毕转移到固体培养室内培养，在温度30℃下，培养3～7天，即获得含菌量为2×(10⁸～10⁹)菌株/ml的哈茨木霉类复合菌培养物。

4.如权利要求1所述的一种哈茨木霉类复合菌培养物在植保方面的应用，其特征在于可用作防治山杨根腐病、西瓜枯萎病、烟草青枯病、小麦赤霉病、黄瓜白粉病的生物杀菌剂。