CN112322515A

CN112322515A - 一种贝莱斯芽孢杆菌新菌株及其应用

Info

Publication number: CN112322515A
Application number: CN201910643049.1A
Authority: CN
Inventors: 樊美珍; 柴文波; 盛强; 董建飞; 孙长胜
Original assignee: Zhejiang Bioasia Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Zhejiang Bioasia Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-07-16
Filing date: 2019-07-16
Publication date: 2021-02-05

Abstract

本发明涉及一种贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis新菌株，该菌株已作为专利菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC NO：17271。该菌株对小麦赤霉病具有显著的防治效果。

Description

一种贝莱斯芽孢杆菌新菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种贝莱斯芽孢杆菌新菌株及其在防治小麦赤霉病方面的应用，属于微生物领域。

背景技术

芽孢杆菌Bacillus velezensis是2005年由Ruiz-García等新命名的芽孢杆菌种，随后被确定为解淀粉芽孢杆菌的后期异型体，其中文名为贝莱斯芽孢杆菌。贝莱斯芽孢杆菌是一类生活在土壤中的细菌，可以促进植物的生长和抑制植物病原菌的生长，贝莱斯芽孢杆菌可以降解六磷酸肌醇，使得磷更容易被植物吸收。作为一种新型生防细菌，有关它的研究日益增多。国内已发现该菌对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌Verticillium dahliaeKleb、白菜黑斑病致病菌芸薹链格孢菌Alternaria brassicae、番茄灰霉病灰葡萄孢菌Botrytis cinerea Pers 等有拮抗活性，国外有学者发现该菌对稻瘟病菌等有强拮抗作用，还有研究者已将该菌直接作为生物制剂并应用于防治真菌病害。

小麦赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是小麦粮食产业链上最具威胁的真菌病害之一，在我国主要集中在长江中下游地区、华南冬麦区及东北春麦区，近年来则逐渐向北扩展蔓延，在黄河流域及周边地区均有发生。另外，随着免耕、秸秆还田种植技术的推广，化肥使用量的增加以及小麦品种抗性的丧失，该病的发生逐年加重。

该病由镰孢属禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schw.)为主的多种镰刀菌混合侵染而引起，在中国、日本、东南亚和美国南、北部发生较重，能危害小麦的各个生育阶段，引起穗腐、茎腐、苗腐、秆腐，其中以穗腐危害最重。小麦扬花期病原菌最易侵入，造成的经济损失最大。

我国是世界上小麦赤霉病危害最大的国家，每年受害面积约750万hm²，占全国小麦总面积的1/4，造成产量损失200万～300万t。小麦赤霉病对小麦品质的影响极大，病粒基本失去种用和工业价值。除此，还可产生多种毒素如脱氧雪腐镰菌醇(deoxynivalenol,DON)和玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)) 等，人畜食用染病籽粒后，会发生不同程度的中毒反应，如皮肤过敏以及肠胃功能紊乱，引起食欲下降、腹泻、呕吐、腹痛等症状，并延缓生长、降低机体的免疫机能，还有致癌、致畸和诱变的作用，可导致孕妇流产甚至死亡。

目前，控制小麦赤霉病的主要手段仍是使用化学药剂，过去使用最为广泛的是多菌灵、甲基托布津等内吸性杀菌剂，近期研究发现，叶菌唑和丙硫菌唑、氰烯菊酯等对小麦赤霉病具有较好的防治效果。随着化学农药抗药性的提高，人们环境保护意识的加强以及对绿色食品的重视，病害生物防治日益成为发展趋势。生物防治将成为小麦赤霉病防治的主要手段。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种贝莱斯芽孢杆菌新菌株，该菌株对小麦赤霉病具有显著的防治效果。

作为本发明的一个方面，本发明提供一种贝莱斯芽孢杆菌新菌株 BACC01558，其分类命名为Bacillus velezensis，该菌株已作为专利菌种保藏于位于我国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号： CGMCC NO：17271，保藏日期：2019年02月28日。

本发明贝莱斯芽孢杆菌BACC01558的主要形态特征(LB培养基)：

短杆状，0.5～0.7μm×1.5～2.8μm，革兰氏染色阳性，细胞内生芽孢，芽孢为卵圆形，不产生伴孢晶体。在固体培养基上菌落呈淡黄色，不透明，表面粗糙，边缘不规则，见图1。

本发明的贝莱斯芽孢杆菌BACC01558具有如SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因序列。

本发明的贝斯芽孢杆菌BACC01558具有如SEQ ID NO:2所示的gyrB基因序列。

作为本发明的第二个方面，本发明提供所述贝斯芽孢杆菌BACC01558在防治小麦赤霉病中的应用。

作为本发明的第三个方面，本发明提供所述贝莱斯芽孢杆菌BACC01558 联合哈茨木霉菌在防治小麦赤霉病中的应用。

作为本发明的第四个方面，本发明提供一种防治小麦赤霉病的方法，所述方法为：于小麦始花期开始先后两次喷洒生物农药，两次喷药间隔为4-7天；

其中，所述生物农药选自哈茨木霉菌或贝莱斯芽孢杆菌。

在具体实施方式中，喷洒方式可以是先后两次喷洒同一种生物农药(哈茨木霉菌或贝莱斯芽孢杆菌)；也可以是先喷洒哈茨木霉菌，后喷洒贝莱斯芽孢杆菌；或者是先喷洒贝莱斯芽孢杆菌，后喷洒哈茨木霉菌。

在优选的实施方式中，所述喷洒方式为先喷洒哈茨木霉菌，后喷洒贝莱斯芽孢杆菌。

在优选的实施方式中，在上述生物农药中加入化学农药，所述化学农药选自氰烯菊酯、多菌灵、甲基托布津、叶菌唑和丙硫菌唑中的任意一种或几种。优选为氰烯菊酯，所述氰烯菊酯的用量为10-20ml/亩。

在优选的实施方式中，所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌 BACC01558，保藏编号：CGMCC NO：17271。

本发明的有益效果：贝莱斯芽孢杆菌BACC01558菌株对小麦赤霉病，无论是室内试验，还是大田防治均表现出良好效果。目前国家对赤霉病防治的指导原则是，始花期喷第一次药，五天后第二次。本发明意外发现将哈茨木霉和贝莱斯芽孢杆菌密切结合起来，并加入少量化学农药，其发病率防效为76.41％，病情指数防效为88.12％，防治效果显著优于单独两次用同一种生防制剂的效果。

生物材料保藏信息

本发明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BACC01558，已作为专利菌种保藏于位于我国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC NO：17271，保藏日期：2019年02月28日。

附图说明

图1为贝莱斯芽孢杆菌BACC01558的形态特征；

其中，图1A为菌体形态；图1B为芽孢形态；图1C为菌落形态。

图2为贝莱斯芽孢杆菌与赤霉菌的对峙实验结果；

其中，图2A为贝莱斯芽孢杆菌与赤霉菌的对峙平板，上面的菌落为赤霉菌，下面的菌落为贝莱斯芽孢杆菌；图2B为赤霉菌对照平板。

图3为贝莱斯芽孢杆菌与哈茨木霉菌的对峙实验结果；

其中，图3A为贝莱斯芽孢杆菌与哈茨木霉菌的对峙平板，左边的菌落为哈茨木霉菌，右边的菌落为贝莱斯芽孢杆菌；图3B为哈茨木霉菌对照平板。

具体实施方式

实施例1菌种鉴定

菌种的鉴定通过以下工作进行:

1、形态特征和理化试验鉴定结果

本发明贝莱斯芽孢杆菌BACC01558菌株细胞形态和理化试验结果(LB培养基上)见表1。

表1贝莱斯芽孢杆菌BACC01558菌株细胞形态和理化试验结果

2、分子鉴定

本发明贝莱斯芽孢杆菌BACC01558具有如SEQ ID NO:1所示的16S rRNA 基因序列和如SEQ ID NO:2所示的gyrB基因序列。

根据菌种的细胞形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列、gyrB基因序列等实验数据综合分析，参考《伯杰斯系统细菌学手册》以及Intenational Journal of Systematicand Evolutionary Microbiology有关研究论文，该菌种鉴定为：Bacillus velezensis贝莱斯芽孢杆菌。

实施例2贝莱斯芽孢杆菌BACC01558的培养

步骤一，用贝莱斯芽孢杆菌BACC01558菌株，接种于LB培养基(每升培养基含10g蛋白胨，5g氯化钠，10g葡萄糖，10g酵母浸出物，琼脂20g,以水补足1升)制作的斜面培养基，制作一级斜面种子。在30±0.5℃的恒温箱，培养24h。

步骤二，将所述步骤一中的斜面种子，接种于装有LB液体培养基的三角瓶或发酵罐中，所述种子液在LB液体培养基中的浓度为10％，在温度为29～ 31℃下，160r/min恒温培养8h，进入对数生长期，即可出料。

其中，所述LB液体培养基基本同斜面培养基，仅无琼脂。

该液体培养步骤还可以用FSTB培养基(FeSO₄·7H₂O 25mg/L，NH₄NO₃ 286mg/L，KCl929mg/L，CaCl₂ 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，pH值为7.0-7.5，4ml/L甘油)、SOC培养基(2％胰蛋白胨,0.5％酵母提取物,10mM NaCl,2.5mM KCl,10mMMgCl₂,10mM MgSO₄，20mM 葡萄糖)、YT培养基(1.6％胰蛋白胨,1％酵母提取物,0.5％NaCl)或蛋白胨培养基(蛋白胨20g，牛肉膏3g，氯化钠5g)。

步骤三，将所述的步骤二中的液体种子，接种于固体培养基中，培养基组成为：麸皮35％,稻壳28.25％,玉米粉8.0％,豆粕28.3％,硫酸镁0.1％,硫酸铵0.3％, 磷酸二氢钾0.05％。料水比为1:1.5，30±0.5℃温度下，避光培养52h。烘干 (600.5℃)，粉碎，产品含菌量900ⅹ10⁸/g。

实施例3贝莱斯芽孢杆菌BACC01558菌株对小麦赤霉病的抑制作用

1、与小麦赤霉菌的对峙实验

采用“平板对峙法”评价菌株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)对真菌的拮抗活性：将6mm赤霉菌的菌饼接种到PDA培养基的中央，用接种环挑取少量的贝莱斯芽孢杆菌在距离2.5cm处划线，实验设置三个重复组，以不接贝莱斯芽孢杆菌作为空白对照，28℃培养2-6天，培养结果见图2，并计算抑菌率：抑菌率(％)＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径ⅹ100％。

抑菌率＝(30.46-9.64)/30.46＝0.68即抑菌率为68％。

2、贝莱斯芽孢杆菌的作用机制

滤去菌体的发酵液(培养好的发酵液，用0.22微米一次性过滤器过滤，去除菌体，取上清液)，制作平板。将不同浓度的上清液分别取1ml，加入9ml 40-45℃ PDA培养基中，混匀，倒平板(直径9cm)。待凉后，将6mm赤霉菌的菌饼反转接种到上述PDA培养基的中央，共设贝莱斯芽孢杆菌10⁴、10⁵、10⁶、10⁷四个不同浓度处理。

试验均无抑菌效果，结果说明，抑菌作用的主体是贝莱斯芽孢杆菌的菌体，而不是发酵液。

3、贝莱斯芽孢杆菌与化学农药氰烯菊酯的相容性

为了提高生物农药的防治效果，往往在其中加入极少量的化学农药。试验中先配制不同浓度的贝莱斯芽孢杆菌LB含药平板(10⁵、10⁶、10⁷)，是往平板培养基中注入一定量的贝莱斯芽孢杆菌菌液来实现的，混匀，倒平板，每个约 20ml。完成后水平静置。

将灭菌好的4个牛津杯放入平板的四个角，做好标记。将农药进行稀释，分别将12μl、10μl、8μl、6μl(相当于30、25、20、15ml药剂/亩)，溶于40毫升无菌水中，分别从中取200微升加入4个对应的牛津杯中。放入37度培养箱中培养12小时。

结果：三种菌液浓度、四种农药浓度下(相当于30、25、20、15ml/亩)，牛津杯法均无抑菌现象发生，说明贝莱斯芽孢杆菌可以与氰烯菊酯混用，应选择最低浓度15ml/亩。

4、与哈茨木霉的互作效应

木霉菌(Trichoderma spp.)属半知菌类半知菌类的丝孢纲，对多种重要植物病原真菌具有拮抗作用。哈茨木霉(Trichoderma harzianum)是木霉属中应用最多的，是多种植物病原菌的寄生菌和拮抗菌之一。本实验考察贝莱斯芽孢杆菌和哈茨木霉菌的互作效应，所用哈茨木霉菌为专利CN200910016337.0中公开的菌种，保藏编号为CGMCC NO：2965，该菌株对小麦赤霉病具有防治作用。

对峙试验：分别培养哈茨木霉菌(PDA培养基)和贝莱斯芽孢杆菌(LB 培养基)，将6mm哈茨木霉菌的菌饼接种到PDA培养基一端，另一端用接种环挑取少量的贝莱斯芽孢杆菌在距离2.5cm处划线，实验设置四个重复组，以不接贝莱斯芽孢杆菌作为空白对照，28℃培养2-6天，并计算抑菌率：抑菌率(％) ＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径ⅹ100％。

结果见表2，图3。

表2哈茨木霉与贝莱斯芽孢杆菌的抑制率

结果说明：两生防菌间互相抑制力很强，不能混用。只能分别使用。

5、应用贝莱斯芽孢杆菌BACC01558菌株对小麦赤霉病的田间防治试验

22019年大田防治，田间自然发生小麦赤霉菌，各实验组于始花期第1次喷洒农药，5天后喷洒第二次，试验共设置八组：

A组：生物农药①+化学农药

生物农药：哈茨木霉孢子粉(含量250亿/g)50％；载体：硅藻土15％；润湿剂：BX(拉开粉)5％；分散剂：NNO(甲基双萘磺酸钠)5％；吸附剂：活性炭13％；乳化剂：吐温20 7％；磷酸二氢钾：5％；用前混合；200克/亩；

化学农药：氰烯菊酯15ml/亩；

紫外吸收剂：UV327中国台湾永光0.1％；

水：75斤；

喷洒两次。

B组：生物农药对照①

在A组的基础上去掉化学农药氰烯菊酯；

喷洒两次。

C组：生物农药②+化学农药

生物农药：贝莱斯芽孢杆菌BACC01558(10⁶)37500ml(配制好的发酵液- 含菌体)。

化学农药：氰烯菊酯15ml/亩；

紫外吸收剂：UV327中国台湾永光0.1％；

喷洒两次。

D组：生物农药对照②

在C组的基础上去掉化学农药氰烯菊酯；

喷洒两次。

E组：第一次喷洒A组的“生物农药①+化学农药”，五天后喷洒C组的“生物农药②+化学农药”。

F组：化学农药对照①

氰烯菊酯(120ml/亩)，加水75斤；

喷洒两次。

G组：化学农药对照②

50％多菌灵可湿性粉剂，每次100克/亩，每次加水75斤；

喷洒两次。

H组：对照组，不喷洒任何药物。

结果见表3。

表3大田防治效果

从防治效果看出，贝莱斯芽孢杆菌BACC01558菌株对小麦赤霉菌，无论是室内试验，还是大田防治均表现出良好效果。目前国家对赤霉病防治的指导原则是，始花期喷第一次药，五天后第二次。在E处理中巧妙的将哈茨木霉和贝莱斯芽孢杆菌密切结合起来，先喷洒哈茨木霉菌，再喷洒贝莱斯芽孢杆菌，防治效果显著优于单独两次用同一种生防制剂的效果，虽在防治中加入了少量的化学农药，但加入量仅为防治推荐量的12.5％(1/8)。所以效果是很明显的。

序列表

<110> 浙江泛亚生物医药股份有限公司

<120> 一种贝莱斯芽孢杆菌新菌株及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1425

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 1

cttcggcggc tggctccata aaggttacct caccgacttc gggtgttaca aactctcgtg 60

gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg 120

attactagcg attccagctt cacgcagtcg agttgcagac tgcgatccga actgagaaca 180

gatttgtggg attggcttaa cctcgcggtt tcgctgccct ttgttctgtc cattgtagca 240

cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg 300

tttgtcaccg gcagtcacct tagagtgccc aactgaatgc tggcaactaa gatcaagggt 360

tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac 420

cacctgtcac tctgcccccg aaggggacgt cctatctcta ggattgtcag aggatgtcaa 480

gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540

gcccccgtca attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc ggagtgctta 600

atgcgttagc tgcagcacta aggggcggaa accccctaac acttagcact catcgtttac 660

ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgct cctcagcgtc 720

agttacagac cagagagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct acgcatttca 780

ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gttccccagt ttccaatgac 840

cctccccggt tgagccgggg gctttcacat cagacttaag aaaccgcctg cgagcccttt 900

acgcccaata attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta 960

gttagccgtg gctttctggt taggtaccgt caaggtgccg ccctatttga acggcacttg 1020

ttcttcccta acaacagagc tttacgatcc gaaaaccttc atcactcacg cggcgttgct 1080

ccgtcagact ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg 1140

ccgtgtctca gtcccagtgt ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca tcgtcgcctt 1200

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<210> 2

<211> 860

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 2

ctttagaaga cagtccgcca gtttgcccgg cagattggaa atctcaagcg cacttttgcg 60

ccgggtcaat tcccgggctt ttttcgccgc catccgcgct cttgcggcca ttaaaccttt 120

ttcaacgatt ttgcgggctg agtccggatt ttcaagaagg aatgtttcca gcgcagaaga 180

aaacagcgta tcagtgatcg ttctcgcttc ggagttgccg agcttcgttt tcgtctgccc 240

ttcgaattgc ggatcagggt gcttaattga aataatggca gtcagccctt ctctcacatc 300

atccccgctt aaattcggat cattttcttt gaaaatccct tttcttcttg catagtcgtt 360

tatgacacgg gtcagaccgg ttttaaatcc ggcctcgtgc gtgccgcctt cgtatgtgtt 420

gatattattt gtgaaagaat aaatattgct tgtatagctg tcgttatatt gcaatgcgac 480

ttcaaccgtt atgccgtctt tctcgccttc gatataaatc ggctcttcat gaacgacttc 540

tttggaacgg tttaagtact caacatagct tttgattccg ccttcgtagt ggtactcgtt 600

tttccgttct tgtccttcac gtttgtcttc aatcgtgatg tttacgcctt ttgtcaggaa 660

ggccaattcc cggacacggt ttgaaagcag atcatagtca tatacagttg tttctttgaa 720

aatttccggg tccggaacga agtgcgtaat cgttccggtc ttatcagttt cgccgatcac 780

ttcaagatcg gccacaggta caccgcgctc gtacgcctga taatggattt ttccgtcacg 840

atgaaccgta acgtcaagag 860

Claims

1.一种贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis新菌株BACC01558，该菌株已作为专利菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC NO：17271。

2.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌BACC01558，其特征在于，具有如SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因序列。

3.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌BACC01558，其特征在于，具有如SEQ ID NO:2所示的gyrB基因序列。

4.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌BACC01558在防治小麦赤霉病中的应用。

5.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌BACC01558联合哈茨木霉菌在防治小麦赤霉病中的应用。

6.一种防治小麦赤霉病的方法，其特征在于，所述方法包括：于小麦始花期开始先后两次喷洒生物农药，两次喷药间隔为4-7天；

其中，所述生物农药选自哈茨木霉菌或贝莱斯芽孢杆菌。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，喷洒方式为先后两次喷洒同一种生物农药；或者是先喷洒哈茨木霉菌，后喷洒贝莱斯芽孢杆菌；或者是先喷洒贝莱斯芽孢杆菌，后喷洒哈茨木霉菌。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述喷洒方式为先喷洒哈茨木霉菌，后喷洒贝莱斯芽孢杆菌。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述生物农药中加入化学农药，所述化学农药选自氰烯菊酯、多菌灵、甲基托布津、叶菌唑和丙硫菌唑中的任意一种或几种。

10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌BACC01558，保藏编号：CGMCC NO：17271。