CN104152383A - 一种复合芽孢菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合芽孢菌剂及其制备方法和应用。本发明保护甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117。本发明还保护一种复合菌剂，包括甲基营养化芽孢杆菌LPL-117、解淀粉芽孢杆菌LPL-K13、解淀粉芽孢杆菌LPL-K103、蜡状芽孢杆菌LPL-NKY和胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ。本发明还保护所述复合菌剂在促进植物生长和/或抑制植物病原菌和/或防治植物发生植物病原菌侵染引起的相关疾病中的应用。本发明对于植物病原菌引起的相关疾病的防治具有重大价值，对于植物的栽培，特别是经济植物的栽培具有重大应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种复合芽孢菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
长期以来我国农业增产主要依靠大量化学肥料和农药的投入，不合理施用化肥和农药引起的农业生态环境问题日渐严重。近些年,随着人们保护环境意识的增强及对无公害农产品的日益重视,新技术、新产品研发不断深入,探寻新的生物肥源和生物防治以替代或部分替代化肥和农药的研究倍受关注。
芽孢杆菌是土壤和植物微生态区系的优势生物种群，因其能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的芽孢，加之易制成粉剂，便于贮藏运输，利于实现大规模生产，所以是理想的植物促生菌筛选对象。芽孢杆菌通过成功定殖至植物根际体表或体内与病原菌竞争植物周围的营养、分泌抗菌物质以抑制病原菌生长、同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到生防的目的。
目前，利用单一微生物防治植物病害和促进植物生长的报道较多，但是单一菌株作用机制单一，受环境影响较大。通过促生菌复配可实现多菌株间的优势互补与协同作用，增强其在自然环境中的适应性、竞争力及存活率，充分发挥其促生和生防效果，但目前针对多功能复合芽孢菌剂的研究较少。
发明内容
本发明的目的是提供一种复合芽孢菌剂及其制备方法和应用。
本发明保护甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117。甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117已于2013年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.7749。甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117简称甲基营养化芽孢杆菌LPL-117。
本发明还保护一种复合菌剂，包括甲基营养化芽孢杆菌LPL-117、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K13、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)LPL-K103、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LPL-NKY和胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)LPL-HYZ。
所述复合菌剂中，以上各个菌株可以独立包装，也可以混合包装。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K13已于2013年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCNO.7748。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K13简称解淀粉芽孢杆菌LPL-K13。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K103已于2013年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCNO.7747。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K103简称解淀粉芽孢杆菌LPL-K103。
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LPL-NKY已于2013年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.7761。蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LPL-NKY简称蜡状芽孢杆菌LPL-NKY。
胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)LPL-HYZ已于2013年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCNO.7750。胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)LPL-HYZ简称胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ。
所述复合菌剂中，甲基营养化芽孢杆菌LPL-117、解淀粉芽孢杆菌LPL-K13、解淀粉芽孢杆菌LPL-K103、蜡状芽孢杆菌LPL-NKY和胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ的配比具体为3.2×1010cfu：2.4×1010cfu：1.8×1010cfu：7.8×1010cfu：1.3×1010cfu。
所述复合菌剂中，甲基营养化芽孢杆菌LPL-117、解淀粉芽孢杆菌LPL-K13、解淀粉芽孢杆菌LPL-K103、蜡状芽孢杆菌LPL-NKY和胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ的配比具体为4.1×1010cfu：3.7×1010cfu：2.9×1010cfu：5.8×1010cfu：1.0×1010cfu。
本发明还保护所述复合菌剂在促进植物生长和/或抑制植物病原菌和/或防治植物发生植物病原菌侵染引起的相关疾病中的应用。所述植物可为黄瓜或番茄，具体可为黄瓜中农6号或番茄中杂9号。所述植物病原菌可为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌或辣椒疫霉。所述植物病原菌具体可为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)：ACCC 36124。尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)：ACCC 37438。辣椒疫霉(Phytophthora capsisi)：ACCC 37300。
本发明还保护甲基营养化芽孢杆菌LPL-117、解淀粉芽孢杆菌LPL-K13、解淀粉芽孢杆菌LPL-K103、蜡状芽孢杆菌LPL-NKY和胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ在制备复合菌剂中的应用。所述复合菌剂的用途为促进植物生长和/或抑制植物病原菌和/或防治植物发生植物病原菌侵染引起的相关疾病。所述植物可为黄瓜或番茄，具体可为黄瓜中农6号或番茄中杂9号。所述植物病原菌可为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌或辣椒疫霉。所述植物病原菌具体可为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)：ACCC 36124。尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)：ACCC 37438。辣椒疫霉(Phytophthora capsisi)：ACCC 37300。
本发明还保护一种复合芽孢杆菌菌肥，其制备方法包括如下步骤：
(1)将甲基营养化芽孢杆菌LPL-117、解淀粉芽孢杆菌LPL-K13、解淀粉芽孢杆菌LPL-K103、蜡状芽孢杆菌LPL-NKY和胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ分别进行如下操作：①将菌接种至培养基甲，使发酵体系中的初始菌浓度为107cfu/mL，30℃、通气保压0.05MPa、160rpm振荡培养36h；②完成步骤①后，取整个体系，按10％体积比的接种量转接至培养基乙，混匀后30℃静置培养5天，然后风干至含水量为10％以下(具体可为8％)，粉碎，得到各个固态发酵物；所述培养基甲(pH6.5-7.0)的组成如下：2％质量比的蔗糖、2％质量比的酵母浸膏、1.5％质量比的牛肉浸膏、0.06％质量比的MgSO4·7H2O、0.0009％质量比的FeSO4·7H2O，余量为水；所述培养基乙(自然pH，含水量为40％)的组成如下：40％质量比的米糠、30％质量比的小麦麦麸、20％质量比的花生粕、1％质量比的石灰、1％质量比的葡萄糖和8％质量比的草炭；
(2)将步骤(1)得到的五种固态发酵物等质量混合，得到复合芽孢杆菌菌肥。
所述复合芽孢杆菌菌肥中，甲基营养化芽孢杆菌LPL-117、解淀粉芽孢杆菌LPL-K13、解淀粉芽孢杆菌LPL-K103、蜡状芽孢杆菌LPL-NKY和胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ的配比具体为3.2×1010cfu：2.4×1010cfu：1.8×1010cfu：7.8×1010cfu：1.3×1010cfu。
本发明还保护所述复合芽孢杆菌菌肥在促进植物生长和/或抑制植物病原菌和/或防治植物发生植物病原菌侵染引起的相关疾病中的应用。所述植物可为黄瓜或番茄，具体可为黄瓜中农6号或番茄中杂9号。所述植物病原菌可为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌或辣椒疫霉。所述植物病原菌具体可为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)：ACCC36124。尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)：ACCC 37438。辣椒疫霉(Phytophthoracapsisi)：ACCC 37300。
本发明还保护一种复合芽孢杆菌可湿性粉剂，其制备方法包括如下步骤：
(1)将甲基营养化芽孢杆菌LPL-117、解淀粉芽孢杆菌LPL-K13、解淀粉芽孢杆菌LPL-K103、蜡状芽孢杆菌LPL-NKY和胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ分别进行如下操作：①将菌接种至培养基甲，使发酵体系中的初始菌浓度为107cfu/mL，30℃、通气保压0.05MPa、160rpm振荡培养36h；②完成步骤①后，取整个体系，每100ml加入20g硅藻土，混合均匀，然后喷雾干燥(出风口温度具体可为80℃-90℃，进风口温度具体可为230℃)，得到各个发酵液预制剂；所述培养基甲(pH6.5-7.0)的组成如下：2％质量比的蔗糖、2％质量比的酵母浸膏、1.5％质量比的牛肉浸膏、0.06％质量比的MgSO4·7H2O、0.0009％质量比的FeSO4·7H2O，余量为水；
(2)将步骤(1)得到的五种发酵液预制剂等质量混合，得到混合物；
(3)将90.5重量份步骤1得到的混合物、5重量份木质素磺酸钠、0.5重量份有机硅、0.5重量份Morwet D-425、1重量份羧甲基纤维素钠、0.5重量份辅酶A和2重量份壳聚糖混合，然后通过气流粉碎机，粉碎至44μm以下的均匀粉末，即为复合芽孢杆菌可湿性粉剂。
所述复合芽孢杆菌可湿性粉剂中，甲基营养化芽孢杆菌LPL-117、解淀粉芽孢杆菌LPL-K13、解淀粉芽孢杆菌LPL-K103、蜡状芽孢杆菌LPL-NKY和胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ的配比具体为4.1×1010cfu：3.7×1010cfu：2.9×1010cfu：5.8×1010cfu：1.0×1010cfu。
本发明还保护所述复合芽孢杆菌可湿性粉剂在促进植物生长和/或抑制植物病原菌和/或防治植物发生植物病原菌侵染引起的相关疾病中的应用。所述植物可为黄瓜或番茄，具体可为黄瓜中农6号或番茄中杂9号。所述植物病原菌可为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌或辣椒疫霉。所述植物病原菌具体可为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)：ACCC 36124。尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)：ACCC 37438。辣椒疫霉(Phytophthoracapsisi)：ACCC 37300。
本发明对于植物病原菌引起的相关疾病的防治具有重大价值，对于植物的栽培，特别是经济植物的栽培具有重大应用价值。
附图说明
图1为甲基营养化芽孢杆菌LPL-117、解淀粉芽孢杆菌LPL-K13、解淀粉芽孢杆菌LPL-K103、蜡状芽孢杆菌LPL-NKY和胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ的形态特征照片。
图2为甲基营养化芽孢杆菌LPL-117、解淀粉芽孢杆菌LPL-K13和解淀粉芽孢杆菌LPL-K103对植物病原菌的抑制作用。
图3为实施例6的步骤三的结果照片。
图4为实施例7的步骤三的结果照片。
图5为实施例7的步骤四的1的结果照片。
图6为实施例7的步骤四的2的结果照片。
图7为实施例7的步骤五的1的结果照片。
图8为实施例7的步骤五的2的结果照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。取钾长石，研磨后过100目筛，收集粒径为100目以下的粉末并水洗，阴凉干燥，得到钾长石粉。
木质素磺酸钠：购自天津市盛富江化工销售有限公司，CAS NO.8061-51-6。有机硅：购自广州虎桥威盟国际物流有限公司，CAS NO.63148-62-9。Morwet D-425(有效成分为烷基萘磺酸缩聚物的钠盐)：购自南京捷润科技有限公司。羧甲基纤维素钠：购自北京金路鸿生物技术有限公司。辅酶A：购自易秀博谷生物科技有限公司，CASNO.85-61-0。壳聚糖：购自河北百味生物科技有限公司，CAS NO.9012-76-4。
立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)：ACCC 36124。尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)：ACCC 37438。辣椒疫霉(Phytophthora capsisi)：ACCC 37300。圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)：CGMCC 1.233。番茄中杂9号：中国农业科学院蔬菜花卉研究所。黄瓜中农6号：中国农业科学院蔬菜花卉研究所。
无氮改良ACCC55培养基：蔗糖10g、K2HPO4·3H2O 0.5g、NaCl 0.2g、CaCO3 1g、MgSO4·7H2O 0.2g、酵母膏0.5g、蒸馏水1000ml、琼脂1.5％-2.0％，pH 7.0-7.2。
蒙金娜有机磷固体培养基：蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、NaC15.0g、Agar 15g、水1000mL，pH7.0，分装灭菌，临用时每50mL加入3mL蛋黄溶液(蛋黄溶液即新鲜蛋黄与0.9％生理盐水的等体积混合得到的混合液；蛋黄提供难利用的卵磷脂)。
孟金娜有机磷液体培养基：蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、NaC15.0g、水1000mL，pH7.0分装灭菌，临用时每50mL加入3mL蛋黄溶液(蛋黄溶液即新鲜蛋黄与0.9％生理盐水的等体积混合得到的混合液；蛋黄提供难利用的卵磷脂)。
PKO固体培养基(解无机磷微生物分离固体培养基)：葡萄糖10g、(NH4)2S040.5g、NaCl 0.1g、KCl 0.2g、MgSO4·7H2O 0.1g、FeS04·7H2O 0.1mg、MnSO4·H2O 0.1mg、Ca3(P04)25g、酵母膏0.4g、琼脂18g、蒸馏水1000mL，pH7.0-7.5。
PKO液体培养基(解无机磷微生物分离液体培养基)：葡萄糖10g、(NH4)2S040.5g、NaCl 0.1g、KCl 0.2g、MgSO4·7H2O 0.1g、FeS04·7H2O 0.1mg、MnSO4·H2O 0.1mg、Ca3(P04)25g、酵母膏0.4g、蒸馏水1000mL，pH7.0-7.5。
解钾固体培养基：蔗糖5g、MgS04·7H2O 0.5g、FeCl30.005g、Na2HPO42g、钾长石粉(提供难利用的钾)5g、CaCO30.1g、FeCl30.005g、蒸馏1000mL、琼脂20g，pH7.1-7.4。
解钾液体培养基：蔗糖5g、MgS04·7H2O 0.5g、FeCl30.005g、Na2HPO42g、钾长石粉(提供难利用的钾)5g、CaCO30.1g、FeCl30.005g、蒸馏1000mL，pH7.1-7.4。
无钾液体培养基：蔗糖5g、MgS04·7H2O 0.5g、FeCl30.005g、Na2HPO42g、CaCO30.1g、FeCl30.005g、蒸馏1000mL，pH7.1-7.4。
培养基甲(pH6.5-7.0)的组成如下：蔗糖2％(质量比)、酵母浸膏2％(质量比)、牛肉浸膏1.5％(质量比)、MgSO4·7H2O 0.06％(质量比)、FeSO4·7H2O 0.0009％(质量比)，余量为水。
培养基乙的组成如下(自然pH，含水量为40％)：米糠40％(质量比)、小麦麦麸30％(质量比)、花生粕20％(质量比)、石灰1％(质量比)、葡萄糖1％(质量比)和草炭8％(质量比)。
育苗基质：草炭:蛭石:珍珠岩＝3:1:1；体积比；草炭购自黑龙江桦美泥炭有限公司，蛭石和珍珠岩均购自河北省灵寿县京石矿产加工厂。
实施例1、Bacillus methylotrophicus LPL-117的分离、鉴定和保藏
一、Bacillus methylotrophicus LPL-117的分离、鉴定和保藏
2012年9月从北京市土壤样本中分离得到一株菌，命名为LPL-117。
LPL-117的形态特征：在LB平板培养48h，形成灰白色不透明的近圆形菌落，有清香味，菌落直径4-5.5mm，低凸起，菌落表面不光滑有褶皱，不透明，边缘不整齐，无光泽，菌落质地膜状(见图1)；革兰氏染色阳性；菌体短杆状，多单生，大小为0.5-0.8×1.5-2.8μm，形成椭圆形芽孢。
LPL-117的16S rDNA如序列表的序列1所示。
基于形态鉴定和分子鉴定的结果，菌株LPL-117属于甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117已于2013年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.7749。甲基营养化芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)LPL-117简称甲基营养化芽孢杆菌LPL-117。
二、甲基营养化芽孢杆菌LPL-117对植物病原菌的抑制作用
1、用无菌水悬浮甲基营养化芽孢杆菌LPL-117，得到108cfu/ml的菌悬液。
2、实验组：取PDA培养基平板，在中央放置直径为5mm的立枯丝核菌菌饼，然后在4个点滴加步骤1得到的菌悬液(每个点距离立枯丝核菌菌饼边缘的垂直距离均为2.5cm，每个点滴加2微升步骤1制备的菌悬液)，28℃对峙培养72h。用无菌水代替步骤1制备的菌悬液进行上述操作，作为对照组。
3、实验组：取PDA培养基平板，在中央放置直径为5mm的尖孢镰刀菌菌饼，然后在4个点滴加步骤1得到的菌悬液(每个点距离尖孢镰刀菌菌饼边缘的垂直距离均为2.5cm，每个点滴加2微升步骤1制备的菌悬液)，28℃对峙培养120h。用无菌水代替菌悬液进行上述操作，作为对照组。
4、实验组：取PDA培养基平板，在中央放置直径为5mm的辣椒疫霉菌饼，然后在4个点滴加步骤1得到的菌悬液(每个点距离辣椒疫霉菌饼边缘的垂直距离均为2.5cm，每个点滴加2微升步骤1制备的菌悬液)，28℃对峙培养120h。用无菌水代替菌悬液进行上述操作，作为对照组。
步骤2、步骤3和步骤4完成后，拍照并计算抑菌带直径(6个重复处理的平均值)。
抑菌带直径＝抑菌圈直径-甲基营养化芽孢杆菌LPL-117的菌落直径。
照片见图2。甲基营养化芽孢杆菌LPL-117可有效抑制立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和辣椒疫霉，抑菌带直径分别为0.75±0.10cm、1.39±0.17cm、1.14±0.12cm。
三、甲基营养化芽孢杆菌LPL-117的固氮能力、溶磷能力和解钾能力
1、固氮能力(即将空气中的游离氮转化为化合态氮的能力)的测定
实验组：在15×150mm螺口试管中加入5ml无氮改良ACCC55培养基制成斜面，接种甲基营养化芽孢杆菌LPL-117，28℃培养72h后换橡胶塞，抽出气体2.5ml，注入乙炔气体2.5ml，然后28℃反应2h；然后抽出100μl气体并用气相色谱仪测定乙烯含量；然后收取斜面上的菌，提取总蛋白并采用Bradford法检测总蛋白含量；
阴性对照组：不接种甲基营养化芽孢杆菌LPL-117，其它同实验组。
阳性对照组：用圆褐固氮菌代替甲基营养化芽孢杆菌LPL-117，其它同实验组。
固氮酶活性[nmol/(mg·h)]＝C2H4(nmol)/[菌体蛋白量(mg)×反应时间(h)]，其中C2H4(nmol)＝1000×C2H4体积(μl)×273×P/[22.4×(273+t)×760]，P为气压(mm汞柱)，t为反应温度(℃)。
每组设置6个重复处理，结果取平均值。
甲基营养化芽孢杆菌LPL-117的固氮酶活性为66.86±3.81nmol/mg·h，圆褐固氮菌的固氮酶活性为118.84±20.97 nmol/mg·h。
2、溶磷能力(即将植物不能直接利用的磷转变成植物能利用的可溶性磷的能力)的测定
(1)定性测定
将甲基营养化芽孢杆菌LPL-117点接种于蒙金娜有机磷固体培养基或PKO固体培养基上，28℃培养5d，拍照并计算D/d值(溶磷圈直径D与菌落直径d的比值)。
设置6个重复处理，结果取平均值。
甲基营养化芽孢杆菌LPL-117在蒙金娜有机培养基上生长良好，能形成明显的溶磷圈，溶磷圈直径为2.69±0.42cm，菌落直径为1.17±0.36cm，D/d值为2.38±0.36。
甲基营养化芽孢杆菌LPL-117在PKO培养基上生长良好，能形成明显的溶磷圈，溶磷圈直径为1.35±0.48c，菌落直径为0.85±0.15cm，D/d值为1.59±0.32。
(2)定量测定
①用无菌水将甲基营养化芽孢杆菌LPL-117制备成菌浓度为109cfu/mL的菌悬液。
②将步骤①得到的菌悬液121℃高温灭菌20分钟，得到灭活菌液。
③实验组：将1mL步骤①得到的菌悬液接种至50mL孟金娜有机磷液体培养基或PKO液体培养基，28℃、180rpm振荡培养5d，然后将整个培养体系转移至无菌的50mL离心管，加入0.5g无磷活性碳，然后采用KQ-500DB型数控超声波清洗器进行超声波细胞破碎(处理时间为20min，释放出细胞内的有效磷)，然后4℃、10000rpm离心15min，取上清液。用1mL步骤②得到的灭活菌液代替步骤①得到的菌悬液，进行上述处理，作为对照组。
④取步骤③得到的上清液，采用钼酸铵比色法检测可溶性磷含量。
P＝K×V/V1；P:有效磷增量；K:从标准曲线查得显色液的磷含量(mg/L)；V:显色时溶液定容的体积(mL)；V1:显色时吸取上清液的体积(mL)。
溶磷量＝实验组的P值-对照组的P值。
每组设置6个重复处理，结果取平均值。
采用孟金娜有机磷液体培养基时，溶磷量为57.76±3.89mg/L。
采用PKO液体培养基时，溶磷量为120.08±0.20g/L。
3、解钾能力(即将植物不能利用的钾转变成植物能利用的可溶性钾的能力)的测定
(1)用无菌水将甲基营养化芽孢杆菌LPL-117制备成菌浓度为109cfu/mL的菌悬液。
(2)将步骤(1)得到的菌悬液121℃高温灭菌20分钟，得到灭活菌液。
(3)实验组：将5mL步骤(2)得到的菌悬液接种至100mL解钾液体培养基，28℃、180rpm培养7d，然后4℃、10000rpm离心10min，取上清液。用1mL步骤(2)得到的灭活菌液代替步骤(1)得到的菌悬液，进行上述处理，作为对照组。
(4)取步骤(3)得到的上清液，利用火焰分光光度计法测钾含量。
解钾量＝实验组的钾含量-对照组的钾含量。
每组设置6个重复处理，结果取平均值。
解钾量为0.42±0.12mg/L。
步骤二和步骤三的结果表明，甲基营养化芽孢杆菌LPL-117具有很强的抑制植物病原菌的能力，具有很强的溶无机磷的能力，同时具有一定的固氮、溶有机磷和解钾能力。
实施例2、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K13的分离、鉴定和保藏
一、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K13的分离、鉴定和保藏
2012年9月从北京市中国科学院蔬菜花卉研究所黄瓜育苗草炭土中分离得到一株菌，命名为LPL-K13。
LPL-K13的形态特征：在LB平板培养48h，形成灰白色不透明的圆形菌落，菌落直径3.5-4.2mm，凸起，菌落表面不光滑有褶皱，不透明，边缘不整齐，无光泽，菌落质地膜状(见图1)；革兰氏染色阳性；菌体短杆状，多单生，大小为0.6-0.9×1.6-3.0μm，形成椭圆形芽孢。
LPL-K13的16S rDNA如序列表的序列2所示。
LPL-K13的GYRB基因序列如序列表的序列3所示。
基于形态鉴定和分子鉴定的结果，菌株LPL-K13属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K13已于2013年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.7748。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K13简称解淀粉芽孢杆菌LPL-K13。
二、解淀粉芽孢杆菌LPL-K13对植物病原菌的抑制作用
用解淀粉芽孢杆菌LPL-K13代替甲基营养化芽孢杆菌LPL-117，其它同实施例1的步骤二。
照片见图2。解淀粉芽孢杆菌LPL-K13可有效抑制立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和辣椒疫霉，抑菌带直径分别为0.74±0.19cm、1.08±0.30cm、1.01±0.12cm。
三、甲基营养化芽孢杆菌LPL-K13的固氮能力、溶磷能力和解钾能力
1、固氮能力(即将空气中的游离氮转化为化合态氮的能力)的测定
用解淀粉芽孢杆菌LPL-K13代替甲基营养化芽孢杆菌LPL-117，其它同实施例1的步骤三的1。
解淀粉芽孢杆菌LPL-K13的固氮酶活性为26.23±3.69 nmol/mg·h，圆褐固氮菌的固氮酶活性为118.84±20.97 nmol/mg·h。
2、溶磷能力(即将植物不能直接利用的磷转变成植物能利用的可溶性磷的能力)的测定
用解淀粉芽孢杆菌LPL-K13代替甲基营养化芽孢杆菌LPL-117，其它同实施例1的步骤三的2。
解淀粉芽孢杆菌LPL-K13在蒙金娜有机培养基上生长良好，能形成明显的溶磷圈，溶磷圈直径为2.87±0.36cm，菌落直径为1.07±0.08cm，D/d值为2.69±0.31。
解淀粉芽孢杆菌LPL-K13在PKO培养基上生长良好，能形成明显的溶磷圈，溶磷圈直径为1.32±0.49cm，菌落直径为1.05±0.16cm，D/d值为1.26±0.28。
采用孟金娜有机磷液体培养基时，溶磷量为73.82±0.99mg/L。
采用PKO液体培养基时，溶磷量为37.80±0.05g/L。
3、解钾能力(即将植物不能利用的钾转变成植物能利用的可溶性钾的能力)的测定
用解淀粉芽孢杆菌LPL-K13代替甲基营养化芽孢杆菌LPL-117，其它同实施例1的步骤三的3。
解钾量为1.17±0.11mg/L。
步骤二和步骤三的结果表明，解淀粉芽孢杆菌LPL-K13具有很强的抑制植物病原菌的能力，同时具有一定的固氮、溶无机磷、溶有机磷和解钾能力。
实施例3、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K103的分离、鉴定和保藏
一、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K103的分离、鉴定和保藏
2012年9月从北京市中国科学院蔬菜花卉研究所番茄幼苗根内分离得到一株菌，命名为LPL-K103。
LPL-K103的形态特征：在LB平板培养48h，形成白色不透明的圆形菌落，菌落直径3.5-5mm，平展，菌落表面不光滑有褶皱，不透明，边缘不整齐，无光泽，菌落质地膜状(见图1)；革兰氏染色阳性；菌体短杆状，多单生，大小为0.5-1.0×1.6-3.0μm，形成椭圆形芽孢。
LPL-K103的16S rDNA如序列表的序列4所示。
LPL-K103的GYRB基因序列如序列表的序列5所示。
基于形态鉴定和分子鉴定的结果，菌株LPL-K103属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K103已于2013年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.7747。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K103简称解淀粉芽孢杆菌LPL-K103。
二、解淀粉芽孢杆菌LPL-K103对植物病原菌的抑制作用
用解淀粉芽孢杆菌LPL-K103代替甲基营养化芽孢杆菌LPL-117，其它同实施例1的步骤二。
照片见图2。解淀粉芽孢杆菌LPL-K103可有效抑制立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和辣椒疫霉，抑菌带直径分别为0.43±0.13cm、0.60±0.26cm、0.45±0.14cm。
三、甲基营养化芽孢杆菌LPL-K103的固氮能力、溶磷能力和解钾能力
1、固氮能力(即将空气中的游离氮转化为化合态氮的能力)的测定
用解淀粉芽孢杆菌LPL-K103代替甲基营养化芽孢杆菌LPL-117，其它同实施例1的步骤三的1。
解淀粉芽孢杆菌LPL-K103的固氮酶活性为129.77±27.49 nmol/mg·h，圆褐固氮菌的固氮酶活性为118.84±20.97 nmol/mg·h。
2、溶磷能力(即将植物不能直接利用的磷转变成植物能利用的可溶性磷的能力)的测定
用解淀粉芽孢杆菌LPL-K103代替甲基营养化芽孢杆菌LPL-117，其它同实施例1的步骤三的2。
解淀粉芽孢杆菌LPL-K103在蒙金娜有机培养基上生长良好，能形成明显的溶磷圈，溶磷圈直径为2.70±0.36cm，菌落直径为1.05±0.14cm，D/d值为2.59±0.38。
采用孟金娜有机磷液体培养基时，溶磷量为82.58±0.05mg/L。
3、解钾能力(即将植物不能利用的钾转变成植物能利用的可溶性钾的能力)的测定
用解淀粉芽孢杆菌LPL-K103代替甲基营养化芽孢杆菌LPL-117，其它同实施例1的步骤三的3。
解钾量为2.61±0.26mg/L。
步骤二和步骤三的结果表明，解淀粉芽孢杆菌LPL-K103具有很强的抑制植物病原菌的能力，具有很强的固氮能力，同时具有一定的溶有机磷和解钾能力。
实施例4、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LPL-NKY的分离、鉴定和保藏
一、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LPL-NKY的分离、鉴定和保藏
2012年9月从北京市土壤样本中分离得到一株菌，命名为LPL-NKY。
LPL-NKY的形态特征：在LB平板培养48h，形成白色蜡状或油脂状不透明的圆形菌落，菌落直径3.5-5mm，低凸，菌落表面光滑发亮微磨砂状，不透明，边缘整齐，有光泽，菌落质地膏状(见图1)；革兰氏染色阳性；菌体短杆状，多单生，大小为1-1.5×2-3.0um，形成椭圆形芽孢。
LPL-NKY的16S rDNA如序列表的序列6所示。
基于形态鉴定和分子鉴定的结果，菌株LPL-NKY属于蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)。蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LPL-NKY已于2013年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.7761。蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LPL-NKY简称蜡状芽孢杆菌LPL-NKY。
二、蜡状芽孢杆菌LPL-NKY的固氮能力、溶磷能力和解钾能力
1、固氮能力(即将空气中的游离氮转化为化合态氮的能力)的测定
用蜡状芽孢杆菌LPL-NKY代替甲基营养化芽孢杆菌LPL-117，其它同实施例1的步骤三的1。
蜡状芽孢杆菌LPL-NKY的固氮酶活性为6.53±2.74nmol/mg·h，圆褐固氮菌的固氮酶活性为118.84±20.97 nmol/mg·h。
2、溶磷能力(即将植物不能直接利用的磷转变成植物能利用的可溶性磷的能力)的测定
用蜡状芽孢杆菌LPL-NKY代替甲基营养化芽孢杆菌LPL-117，其它同实施例1的步骤三的2。
蜡状芽孢杆菌LPL-NKY在蒙金娜有机培养基上生长良好，能形成明显的溶磷圈，溶磷圈直径为3.92±0.61cm，菌落直径为1.37±0.25cm，D/d值为2.85±0.24。
蜡状芽孢杆菌LPL-NKY在PKO培养基上生长良好，能形成明显的溶磷圈，溶磷圈直径为0.80±0.46cm，菌落直径为0.5±0.15cm，D/d值为1.6±0.32。
采用孟金娜有机磷液体培养基时，溶磷量为109.24±3.55mg/L。
采用PKO液体培养基时，溶磷量为83.24±0.15g/L。
3、解钾能力(即将植物不能利用的钾转变成植物能利用的可溶性钾的能力)的测定
用蜡状芽孢杆菌LPL-NKY代替甲基营养化芽孢杆菌LPL-117，其它同实施例1的步骤三的3。
解钾量为0.26±0.04mg/L。
步骤二的结果表明，蜡状芽孢杆菌LPL-NKY具有很强的溶有机磷能力，同时具有一定的固氮、溶无机磷和解钾能力。
实施例5、胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)LPL-HYZ的分离、鉴定和保藏
一、胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)LPL-HYZ的分离、鉴定和保藏
2012年9月从北京市土壤样本中分离得到一株菌，命名为LPL-HYZ。
LPL-HYZ的形态特征：在无氮培养基和解钾培养基上形成圆形，凸起，透明、光滑、有光泽的大型菌落(见图1)；革兰氏染色阳性；菌体杆状，0.9-1.1×3-5μm，芽孢椭圆，位于细胞中央，荚膜厚2-3μm。
LPL-HYZ的16S rDNA如序列表的序列7所示。
基于形态鉴定和分子鉴定的结果，菌株LPL-HYZ属于胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)。胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)LPL-HYZ已于2013年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.7750。胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillusmucilaginosus)LPL-HYZ简称胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ。
二、胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ的固氮能力、溶磷能力和解钾能力
1、固氮能力(即将空气中的游离氮转化为化合态氮的能力)的测定
用胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ代替甲基营养化芽孢杆菌LPL-117，其它同实施例1的步骤三的1。
胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ的固氮酶活性为89.66±2.47nmol/mg·h，圆褐固氮菌的固氮酶活性为118.84±20.97 nmol/mg·h。
2、溶磷能力(即将植物不能直接利用的磷转变成植物能利用的可溶性磷的能力)的测定
用胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ代替甲基营养化芽孢杆菌LPL-117，其它同实施例1的步骤三的2。
胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ在蒙金娜有机培养基上生长良好，能形成明显的溶磷圈，溶磷圈直径为2.93±0.45cm，菌落直径为1.18±0.07cm，D/d值为2.47±0.24。
胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ在PKO培养基上生长良好，能形成明显的溶磷圈，溶磷圈直径为0.80±0.46cm，菌落直径为0.83±0.29cm，D/d值为0.94±0.22。
采用孟金娜有机磷液体培养基时，溶磷量为70.24±5.06mg/L。
采用PKO液体培养基时，溶磷量为89.52±0.27g/L。
3、解钾能力(即将植物不能利用的钾转变成植物能利用的可溶性钾的能力)的测定
用胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ代替甲基营养化芽孢杆菌LPL-117，其它同实施例1的步骤三的3。
解钾量为26.13±1.59mg/L。
步骤二的结果表明，胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ具有很强的解钾能力，同时具有一定的固氮、溶无机磷、溶有机磷能力。
实施例6、复合芽孢菌肥的制备和应用
一、制备各个固态发酵物
将甲基营养化芽孢杆菌LPL-117、解淀粉芽孢杆菌LPL-K13、解淀粉芽孢杆菌LPL-K103、蜡状芽孢杆菌LPL-NKY和胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ分别进行如下固态发酵：
1、将单菌落接种到液体NB培养基中，30℃、160rpm振荡培养24h，得第一培养物；
2、将第一培养物接种至培养基甲(使发酵体系中的初始菌浓度为107cfu/mL)，30℃、通气保压0.05MPa、160rpm振荡培养36h，得第二培养物；
3、将第二培养物做为固态发酵的种子液，按10％(体积比)的接种量转接至培养基乙，混匀后30℃静置培养5天，得到第三培养物。
4、将第三培养物进行风干，直至含水量为8％(实际应用中，含水量为10％以下均可)，粉碎，过18目筛，收集粉末，即为各个固态发酵物。
甲基营养化芽孢杆菌LPL-117得到的固态发酵物的菌含量为3.2×1010cfu/g。
解淀粉芽孢杆菌LPL-K13得到的固态发酵物的菌含量为2.4×1010cfu/g。
解淀粉芽孢杆菌LPL-K103得到的固态发酵物的菌含量为1.8×1010cfu/g。
蜡状芽孢杆菌LPL-NKY得到的固态发酵物的菌含量为7.8×1010cfu/g。
胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ得到的固态发酵物的菌含量为1.3×1010cfu/g。
二、复合芽孢菌肥的制备
将步骤一得到的五种菌的固态发酵物等质量混匀，得到复合芽孢菌肥。
三、复合芽孢菌肥在番茄工厂化育苗中的应用
实验组：将每升育苗基质与10g复合芽孢菌肥混合后作为栽培基质，按照常规方法播种番茄中杂9号的种子并常规管理。对照组：采用育苗基质作为栽培基质，按照常规方法播种番茄中杂9号的种子并常规管理。
播种28天后的照片见图3。
播种30天后，测量植株生长的各个参数，结果见表1(进行三次重复实验，每次重复实验每组测量20株植株，结果取平均值)。壮苗指数＝茎粗(cm)/株高(cm)×全株干重(g)。
表1播种30天后实验组和对照组植株的各个参数的测量结果
播种30天后，将各组的栽培基质风干，检测其中有效氮的含量、有效磷的含量和有效钾的含量。检测有效氮的含量的方法为碱解扩散法，检测有效磷的含量的方法为0.5mol/L碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法，检测有效钾的含量的方法为1mol/L醋酸铵浸提-火焰光度计法；参考文献：杨剑虹，王成林，代亨林.土壤农化分析与环境监测[M].中国大地出版社，2008.182－184，282－290。结果见表2。复合芽孢菌肥可明显提高栽培基质中有效氮、有效磷和有效钾的含量。
表2复合芽孢菌肥对栽培基质中矿质元素含量的影响
| 有效氮(mg/g) | 有效磷(mg/g) | 有效钾(mg/g) | |
| 对照组 | 196.95±9.23 | 109.99±4.54 | 73.25±2.13 |
| 实验组 | 1428.87±1.74 | 199.77±7.53 | 848.79±7.63 |
实施例7、复合芽孢杆菌可湿性粉剂的制备和应用
一、制备各个发酵液预制剂
将甲基营养化芽孢杆菌LPL-117、解淀粉芽孢杆菌LPL-K13、解淀粉芽孢杆菌LPL-K103、蜡状芽孢杆菌LPL-NKY和胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ分别进行如下步骤：
1、将单菌落接种到液体NB培养基中，30℃、160rpm振荡培养24h；
2、完成步骤1后，取整个发酵体系，接种至培养基甲(使发酵体系中的初始菌浓度为107cfu/mL)，30℃、通气保压0.05MPa、160rpm振荡培养36h；
3、完成步骤2后，取整个发酵体系，每100ml发酵体系加入20g硅藻土，混合均匀，然后喷雾干燥(出风口温度为80℃-90℃，进风口温度为230℃)，得到发酵液预制剂(含水量为3.27％)。
甲基营养化芽孢杆菌LPL-117得到的发酵液预制剂的菌含量为4.1×1010cfu/g。
解淀粉芽孢杆菌LPL-K13得到的发酵液预制剂的菌含量为3.7×1010cfu/g。
解淀粉芽孢杆菌LPL-K103得到的发酵液预制剂的菌含量为2.9×1010cfu/g。
蜡状芽孢杆菌LPL-NKY得到的发酵液预制剂的菌含量为5.8×1010cfu/g。
胶冻样类芽孢杆菌LPL-HYZ得到的发酵液预制剂的菌含量为1.0×1010cfu/g。
二、复合芽孢杆菌可湿性粉剂的制备
1、将步骤一得到的五种菌的发酵液预制剂等质量混匀，得到混合物。
2、将90.5重量份步骤1得到的混合物、5重量份木质素磺酸钠(分散剂和紫外光保护剂)、0.5重量份有机硅、0.5重量份Morwet D-425(润湿剂，分散剂)、1重量份羧甲基纤维素钠(稳定剂)、0.5重量份辅酶A(激活酶)和2重量份壳聚糖混合，然后通过气流粉碎机，粉碎至44μm以下的均匀粉末，即为复合芽孢杆菌可湿性粉剂(润湿率为66s,悬浮率为84.4％)。
三、复合芽孢杆菌可湿性粉剂在黄瓜工厂化育苗中的应用
实验组：将1体积份复合芽孢杆菌可湿性粉剂与99体积份育苗基质混合后作为栽培基质，按照常规方法播种黄瓜中农6号的种子并常规管理。对照组：采用育苗基质作为栽培基质，按照常规方法播种黄瓜中农6号的种子并常规管理。
播种28天后的照片见图4。
播种30天后，测量植株生长的各个参数，结果见表3(进行三次重复实验，每次重复实验每组测量20株植株，结果取平均值)。壮苗指数＝茎粗(cm)/株高(cm)×全株干重(g)。
表3播种30天后实验组和对照组植株的各个参数的测量结果
四、复合芽孢杆菌可湿性粉剂对立枯丝核菌引起的黄瓜病害和尖孢镰刀菌引起的黄瓜病害的防效
1、复合芽孢杆菌可湿性粉剂对立枯丝核菌的防效
实验组：将每升育苗基质与10g复合芽孢杆菌可湿性粉剂以及0.5克立枯丝核菌菌体混合后作为栽培基质，按照常规方法播种黄瓜中农6号的种子并常规管理。对照组：将每升育苗基质与0.5克立枯丝核菌菌体混合后作为栽培基质，按照常规方法播种黄瓜中农6号的种子并常规管理。进行三次重复实验，每次重复实验每组100个植株。
播种10天后的照片见图5(圆圈内为发病植株)。由立枯丝核菌引起的立枯病的发病症状为幼苗茎基部产生褐色病斑(初为水渍状，并很快扩展、溢缩变细如“线”
样)，子叶尚未凋萎仍为绿色，从茎基部(或茎中部)突然倒伏而贴于床面，幼茎逐渐萎缩直至幼苗变褐枯死。
播种25天后，统计存活率(三组的平均值)。实验组的存活率为74.03％，对照组的存活率为22.87％。
2、复合芽孢杆菌可湿性粉剂对尖孢镰刀菌的防效
实验组：将每升育苗基质与10g复合芽孢杆菌可湿性粉剂以及0.5克尖孢镰刀菌菌体混合后作为栽培基质，按照常规方法播种黄瓜中农6号的种子并常规管理。对照组：将每升育苗基质与0.5克尖孢镰刀菌菌体混合后作为栽培基质，按照常规方法播种黄瓜中农6号的种子并常规管理。进行三次重复实验，每次重复实验每组100个植株。
播种10天后的照片见图6(圆圈内为发病植株)。由尖孢镰刀菌引起的枯萎病的发病症状为受害幼苗萎蔫死亡(尖孢镰刀菌会侵染寄主植物的维管束系统，破坏植物的输导组织，并在植物生长发育代谢过程中产生毒素来危害作物，造成植物萎蔫死亡)。
播种25天后，统计存活率(三组的平均值)。实验组的存活率为64.86％，对照组的存活率为22.26％。
五、复合芽孢杆菌可湿性粉剂对立枯丝核菌引起的番茄病害和尖孢镰刀菌引起的番茄病害的防效
1、复合芽孢杆菌可湿性粉剂对立枯丝核菌的防效
实验组：将每升育苗基质与10g复合芽孢杆菌可湿性粉剂以及0.5克立枯丝核菌菌体混合后作为栽培基质，按照常规方法播种番茄中杂9号的种子并常规管理。对照组：将每升育苗基质与0.5克立枯丝核菌菌体混合后作为栽培基质，按照常规方法播种番茄中杂9号的种子并常规管理。进行三次重复实验，每次重复实验每组100个植株。
播种15天后的照片见图7(圆圈内为发病植株)。
播种25天后，统计存活率(三组的平均值)。实验组的存活率为89.99％，对照组的存活率为57.08％。
2、复合芽孢杆菌可湿性粉剂对尖孢镰刀菌的防效
实验组：将每升育苗基质与10g复合芽孢杆菌可湿性粉剂以及0.5克尖孢镰刀菌菌体混合后作为栽培基质，按照常规方法播种番茄中杂9号的种子并常规管理。对照组：将每升育苗基质与0.5克尖孢镰刀菌菌体混合后作为栽培基质，按照常规方法播种番茄中杂9号的种子并常规管理。进行三次重复实验，每次重复实验每组100个植株。
播种15天后的照片见图8(圆圈内为发病植株)。
播种25天后，统计存活率(三组的平均值)。实验组的存活率为85.42％，对照组的存活率为54.90％。
Claims (8)
1.甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117，其保藏编号为CGMCC NO.7749。
2.一种复合菌剂，包括甲基营养化芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)LPL-117、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K13、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K103、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)LPL-NKY和胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)LPL-HYZ；
所述甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117的保藏编号为CGMCC NO.7749；所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K13的保藏编号为CGMCC NO.7748；所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K103的保藏编号为CGMCC NO.7747；所述蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LPL-NKY的保藏编号为CGMCC NO.7761；所述胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillusmucilaginosus)LPL-HYZ的保藏编号为CGMCC NO.7750。
3.权利要求2所述复合菌剂在促进植物生长和/或抑制植物病原菌和/或防治植物发生植物病原菌侵染引起的相关疾病中的应用。
4.甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K13、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)LPL-K103、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LPL-NKY和胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)LPL-HYZ在制备复合菌剂中的应用；
所述甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117的保藏编号为CGMCC NO.7749；所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K13的保藏编号为CGMCC NO.7748；所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K103的保藏编号为CGMCC NO.7747；所述蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LPL-NKY的保藏编号为CGMCC NO.7761；所述胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillusmucilaginosus)LPL-HYZ的保藏编号为CGMCC NO.7750。
5.一种复合芽孢杆菌菌肥，其制备方法包括如下步骤：
(1)将甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K13、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)LPL-K103、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LPL-NKY和胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)LPL-HYZ分别进行如下操作：①将菌接种至培养基甲，使发酵体系中的初始菌浓度为107cfu/mL，30℃、通气保压0.05MPa、160rpm振荡培养36h；②完成步骤①后，取整个体系，按10％体积比的接种量转接至培养基乙，混匀后30℃静置培养5天，然后风干至含水量为10％以下，粉碎，得到各个固态发酵物；所述培养基甲的组成如下：2％质量比的蔗糖、2％质量比的酵母浸膏、1.5％质量比的牛肉浸膏、0.06％质量比的MgSO4·7H2O、0.0009％质量比的FeSO4·7H2O，余量为水；所述培养基乙的组成如下：40％质量比的米糠、30％质量比的小麦麦麸、20％质量比的花生粕、1％质量比的石灰、1％质量比的葡萄糖和8％质量比的草炭；
所述甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117的保藏编号为CGMCC NO.7749；所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K13的保藏编号为CGMCC NO.7748；所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K103的保藏编号为CGMCC NO.7747；所述蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LPL-NKY的保藏编号为CGMCC NO.7761；所述胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillusmucilaginosus)LPL-HYZ的保藏编号为CGMCC NO.7750；
(2)将步骤(1)得到的五种固态发酵物等质量混合，得到复合芽孢杆菌生物菌肥。
6.权利要求5所述复合芽孢杆菌菌肥在促进植物生长和/或抑制植物病原菌和/或防治植物发生植物病原菌侵染引起的相关疾病中的应用。
7.一种复合芽孢杆菌可湿性粉剂，其制备方法包括如下步骤：
(1)将甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K13、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)LPL-K103、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LPL-NKY和胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)LPL-HYZ分别进行如下操作：①将菌接种至培养基甲，使发酵体系中的初始菌浓度为107cfu/mL，30℃、通气保压0.05MPa、160rpm振荡培养36h；②完成步骤①后，取整个体系，每100ml加入20g硅藻土，混合均匀，然后喷雾干燥，得到各个发酵液预制剂；所述培养基甲的组成如下：2％质量比的蔗糖、2％质量比的酵母浸膏、1.5％质量比的牛肉浸膏、0.06％质量比的MgSO4·7H2O、0.0009％质量比的FeSO4·7H2O，余量为水；
所述甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117的保藏编号为CGMCC NO.7749；所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K13的保藏编号为CGMCC NO.7748；所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LPL-K103的保藏编号为CGMCC NO.7747；所述蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LPL-NKY的保藏编号为CGMCC NO.7761；所述胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillusmucilaginosus)LPL-HYZ的保藏编号为CGMCC NO.7750；
(2)将步骤(1)得到的五种发酵液预制剂等质量混合，得到混合物；
(3)将90.5重量份步骤1得到的混合物、5重量份木质素磺酸钠、0.5重量份有机硅、0.5重量份Morwet D-425、1重量份羧甲基纤维素钠、0.5重量份辅酶A和2重量份壳聚糖混合，然后通过气流粉碎机，粉碎至44μm以下，即为复合芽孢杆菌可湿性粉剂。
8.权利要求7所述复合芽孢杆菌可湿性粉剂在促进植物生长和/或抑制植物病原菌和/或防治植物发生植物病原菌侵染引起的相关疾病中的应用。
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