CN106854631B

CN106854631B - 一种植物病害的微生物防治方法

Info

Publication number: CN106854631B
Application number: CN201611220028.1A
Authority: CN
Inventors: 宗睿; 李佩佩; 刘鲁民; 周茜
Original assignee: Qingdao Hexie Biotechnology Co ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Hexie Biotechnology Co ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2016-12-26
Filing date: 2016-12-26
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2036-12-26
Also published as: CN106854631A

Abstract

本发明涉及功能微生物应用技术领域，具体提供了一种植物病害的防治方法。所述方法是通过施用蜡状芽孢杆菌SC2菌液实现对植物病害的防治。所述蜡状芽孢杆菌SC2已于2010年5月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（简称CGMCC），保藏编号为：CGMCC NO.3836。该菌株对尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、白腐垫壳孢菌和粉红单端孢菌均有显著抑制效果。

Description

一种植物病害的微生物防治方法

技术领域

本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种植物病害的微生物防治方法。

背景技术

生物防治对病害具有持效期长和环境友好等特点为人们所青睐。植物病害生物防治指引入或利用对植物有益的微生物，利用其抗菌、重寄生、竞争、捕食和溶菌等作用，直接作用于病原微生物，抑制病原菌的生存或活动；或者利用有益微生物的保护、诱导抗性和促生作用，提高植物的抗病性；或者利用生物多样性和植物微生态环境的相互调控，改善农田小生态，从而达到绿色环保防治病害的目的。利用有益微生物，采用以菌治菌的策略进行生物防治，已成为病害防治的重要手段。

许多有益微生物能抑制病原菌的生长发育，可作为生防菌用于生物防治。目前为止，科研工作者筛选出了大量生防菌株，主要包括真菌、细菌和放线菌，可能来自植物根际、根围、土壤、水环境、植物体内或者植物体表，分布十分广泛。

真菌是植物生防因子的主要来源，也是生防菌及其代谢产物的重要研究对象，主要包括Trichoderma、Gliocladium、Pythium、Coniothyrium等。在已经发现的超过1600 种细菌中，绝大多数是对人类有益的。较大程度上应用于植物病害生物防治的主要有Agrobacterium radiobacter、Pseudomonas fluorescens、Bacillus subtilis和B.licheniformis等。放线菌是抗生素、溶菌酶等次生代谢物的重要生产源，在已经发现的近万种微生物来源的生物活性物质中，70%以上是放线菌产生的，如武夷霉素、井冈霉素、多抗霉素等，可用于立枯丝核菌、葡萄孢菌、黄瓜黑星病菌、辣椒疫病菌、棉花黄萎病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌和白菜软腐病菌等的防治。链霉菌是放线菌中种类最多、数量最多、研究最多、应用最广的生防链霉菌。

生防菌防病机制主要表现为：1）分泌溶菌酶这是拮抗微生物降解靶标菌细胞壁最显著的特征之一，溶菌酶的种类很多，主要是针对病原菌细胞壁的不同组分以裂解细胞，使其细胞质泄漏。2）分泌促进植物生长的次生代谢物植株健壮，在一定程度上能增强对病害的抵御。若生防菌能够分泌IAA，或者具有固氮作用、溶磷作用等，必定会促进植株的生长。3）分泌抗生素如农抗120、武夷霉素、井冈霉素和多抗霉素等已经商品化，成功用于防治葡萄孢菌、立枯丝核菌、欧文杆菌所引起的植物病害。4）竞争营养迅速利用营养物质、氧气或水分，限制病原菌的生长发育和侵染。比如在根围环境下，生防菌对铁离子的争夺是抑制根际土有害病原菌的主要原因。5）抢占生态位其生长迅速，繁殖量大，而在病原物定殖前率先占据生态位点。该机制还往往与营养竞争或者分泌抑菌物质有关，生防菌分泌拮抗物质，在一定程度上降低病原物种群数量的同时，迅速繁殖，抢占生态位点。此外，能够定殖于根际土、植物体表或体内也在一定程度上表现出占位效应。生防菌的定殖效果往往决定其防病效果的持续性和稳定性。6）诱导植物抗性，植物本身存在抵抗病害或者其他逆境的抗逆系统，可通过生防菌激发。

由化学防治带来的环境污染、农产品农药残留以及病原菌抗药性的形成等副作用已经引起人们的重视，使人们日益重视替代性防治措施的开发。生物防治技术逐渐引起重视，筛选出高效广谱的有益微生物防治植物病害，是目前急需解决的问题。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种植物病害的微生物防治方法。所述方法是通过施用蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）菌液抑制植物致病菌的繁殖，进而达到防病的效果。

本发明一方面提供了蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）在植物病害防治中的应用。

所述植物病害包括枯萎病、纹枯病、白腐病和霉心病。

本发明还提供了一种防治葡萄白腐病和苹果霉心病的方法，是通过施用蜡状芽孢杆菌菌液实现的。

进一步的，所述蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）SC2，已于2010年5月13日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心（简称CGMCC），保藏编号为：CGMCC NO.3836。

所述蜡状芽孢杆菌菌液中活菌数不低于10⁵CFU/mL。

所述蜡状芽孢杆菌菌液的制备方法包括：

（1）在营养琼脂培养基上划线接种上述蜡状芽孢杆菌SC2，37℃，培养12小时；然后转接种至茄瓶新鲜营养琼脂斜面，37℃，培养12 h；

（2）将菌种从茄瓶斜面洗下接种至种子罐，37℃，培养12 h，种子罐中培养基的组分及其所占重量比分别为：豆饼粉2.5%，玉米浆2%，磷酸氢二钠0.1%，硫酸铵0.05%，硫酸锰0.05%。

（3）将种子罐中的种子接种到5 吨发酵罐（发酵罐中培养基的组分及其所占重量比分别为：豆粕4%，玉米粉2%，硫酸锰0.05%，硫酸镁0.05%）中培养，接种量5%，37℃，150rpm，培养20h，即得蜡状芽孢杆菌菌液。

本发明提供的方法是通过施用蜡状芽孢杆菌SC2菌液实现对植物病害的防治。所述蜡状芽孢杆菌SC2对尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、白腐垫壳孢菌和粉红单端孢菌均有显著抑制效果，对单丝壳白粉菌的抑制效果较差。其中，蜡状芽孢杆菌SC2对白腐垫壳孢菌和粉红单端孢菌的抑制效果最强，抑菌圈直径最大，达25-26 mm，取得了意料不到的技术效果。所述蜡状芽孢杆菌SC2能有效防治葡萄白腐病，施用活菌含量为10⁷CFU/mL的蜡状芽孢杆菌SC2菌液即能达到97.67% - 100%的防治效果，与2000倍稀释的20％戊菌唑水乳剂的防治效果相当。所述蜡状芽孢杆菌SC2还能高效防治苹果霉心病，施用蜡状芽孢杆菌SC2菌液的三个处理组，0级果分别增加33.5%～86.5%；1级果减少25.1%～70%；2～4级果减少34%～76.2%，效果显著。

具体实施方式

本发明实施例中选用的蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）筛选自青岛市崂山区沙子口水产养殖户的养殖水池的水样中，命名为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）SC2，已于2010年5月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC NO.3836。

本发明所应用的试剂可以应用任一款市售产品，下面结合具体实施例对本发明的方法进行详细描述。

实施例1 蜡状芽孢杆菌菌液的制备

在营养琼脂培养基上划线接种上述蜡状芽孢杆菌SC2，37℃，培养12小时；然后转接种至茄瓶新鲜营养琼脂斜面，37℃，培养12 h；将菌种从茄瓶斜面洗下接种至种子罐，37℃，培养12 h，种子罐中培养基的组分及其所占重量比分别为：豆饼粉2.5%，玉米浆2%，磷酸氢二钠0.1%，硫酸铵0.05%，硫酸锰0.05%。

将种子罐中的种子接种到5 吨发酵罐（发酵罐中培养基的组分及其所占重量比分别为：豆粕4%，玉米粉2%，硫酸锰0.05%，硫酸镁0.05%）中培养，接种量5%，37℃，150rpm，培养20h，发酵液中蜡状芽孢杆菌活菌量达到10⁸CFU/mL。

实施例2 蜡状芽孢杆菌抑菌实验

（1）病原菌制备：

将尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、白腐垫壳孢菌、粉红单端孢菌和单丝壳白粉菌（由青岛农业大学赠送）的菌块（Φ7 mm）分别接于PDA固体培养基中央，30℃培养7 d；

（2）打孔扩散法筛选：

将灭菌后的PDA培养基温度保持在55℃，然后用无菌水轻轻冲洗上述病原菌的斜面获得病原菌孢子悬液，并取适量分别加入PDA培养基中，混匀后倒平板。待凝固后，即制得病原菌含量约为10⁷cfu/ml的PDA固体培养基。

用牛津杯在距培养皿中央25 mm的对称两侧各打一个孔（Φ7 mm），并加入150μl蜡状芽孢杆菌SC2的菌液于孔内，每种病原菌设3个平行。将平板放入30℃培养箱，72 h后测量抑菌圈的直径。结果见表1。

表1 蜡状芽孢杆菌SC2对病原菌的抑制效果

病原菌	尖孢镰刀菌	立枯丝核菌	白腐垫壳孢菌	粉红单端孢菌	单丝壳白粉菌
						抑菌圈直径	22mm	21mm	26mm	25mm	10mm

从表1的数据可以看出，本发明提供的蜡状芽孢杆菌SC2对尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、白腐垫壳孢菌和粉红单端孢菌均有显著抑制效果，对单丝壳白粉菌的抑制效果较差。其中，蜡状芽孢杆菌SC2对白腐垫壳孢菌和粉红单端孢菌的抑制效果最强，抑菌圈直径最大，达25-26 mm，取得了意料不到的技术效果。

实施例3 蜡状芽孢杆菌对葡萄白腐病的防治效果

葡萄白腐病病原菌：白腐垫壳孢菌，半知菌类。葡萄白腐病多发于高温多雨季节，是引起葡萄烂果的主要病害之一，尤其是欧亚种葡萄，主要为害葡萄的果实和穗轴，也能为害枝蔓和叶片。侵染果穗时，离地面越近的果穗越容易发病，通常先发病部位为果穗尖端，产生褐色水渍状不规则的病斑，染病组织皮层腐烂，易脱落，发病组织有土腥味。随后，病斑向果粒感染，染病的果粒从基部开始变褐腐烂，最后至整个果粒呈褐色腐软，发病到末期，整个果穗腐烂，穗轴、果梗皱缩枯萎。病粒受震易脱落，不脱落的果粒干缩后成僵果，长久不落，病穗轴及病粒表面密生灰白色小点，湿度大时会溢出灰色粘液，使整个果粒呈灰白色腐烂。叶片侵染一般从叶缘开始，起初是水渍状斑点带灰色小粒，病斑发展严重时，叶片干枯破裂。枝蔓发病现在从植株基部徒长枝开始，呈水绩状斑点，发展到最后呈褐色腐烂，直至枯死。病斑发展到后期，病部的表皮呈丝状纵裂并与木质部分离，如麻丝状。

、实验地点：

青岛市平度大泽山葡萄园；

实验地土壤肥力中等，地势为缓坡地，排水良好，果园管理正常，长势良好。试材为8年生巨峰。

、实验设置：

（1）空白对照：清水；

（2）药剂处理组：20％戊菌唑水乳剂；

（3）微生物处理组：蜡状芽孢杆菌SC2菌液，活菌含量108CFU/mL。

其中，药剂处理组分别按2000倍、3000倍、4000倍稀释戊菌唑水乳剂后喷施；微生物处理组分别按10倍、100倍、1000倍稀释菌液后喷施。

试验区随机排列，每个处理设3个重复，每个试验区面积约25m²,喷施2次，每次间隔15d。

各处理组第一次施药：2016年7月1日；第二次施药：2016年7月16日。喷药时叶片正面、背面，枝条上下及果穗、果粒等部位均匀喷布药液。

、效果统计：

第1次施药后13天（7月14日）调查每个实验区的全部果穗，第2次施药后15天（7月31日）调查每个实验区的全部果穗。每次调查后剪下的病粒果穗，按分级标准记载各级病穗数，计算病情指数和防治效果，具体结果见表2。

按病情分级标准考查每叶发病程度，并计算防治效果，利用DMRT法进行差异显著性分析。叶片病害分级标准：0级，无病；1级，病粒数/整穗粒数在5%以下；3级占6%-10%；5级占11%-25%；7级占26%-50%；9级占50%以上。调查结束后，用各处理区与对照区病情指数相比较。病情指数：取样点的每个样本，按病情分级标准，调查处各级样本数据，代入公式计算出病情指数。

病情指数=∑（各级病穗数×相对级数）/（调查总穗数×最高级数）×100

防治效果（%）=（对照区病情指数-处理区病情指数）/对照区病情指数×100

表2 蜡状芽孢杆菌SC2对葡萄白腐病的防治效果

从表2的结果可知，与清水对照组相比，施用20％戊菌唑水乳剂和蜡状芽孢杆菌SC2菌液的实验组中葡萄的白腐病病情指数得到大幅度降低，说明本发明提供的蜡状芽孢杆菌SC2与20％戊菌唑水乳剂均能有效抑制白腐病的发作。其中，施用活菌含量为10⁵CFU/mL的蜡状芽孢杆菌SC2菌液，对葡萄糖白腐病的防治效果就能超过90%，明显高于4000倍稀释的20％戊菌唑水乳剂的防治效果；而施用活菌含量为10⁷CFU/mL的蜡状芽孢杆菌SC2菌液即能达到97.67% - 100%的防治效果，与2000倍稀释的20％戊菌唑水乳剂的防治效果相当。

上述结果表明，施用本发明提供的蜡状芽孢杆菌SC2菌液能有效防治葡萄的白腐病，其防治效果可与常用的化学农药相当，甚至优于化学农药，而且不会对环境产生污染，无有毒残留，有利于身体健康，是一种理想的化学农药替代产品，应用前景广阔。

实施例4 蜡状芽孢杆菌对苹果霉心病的防治效果

苹果霉心病，又称心腐病，一般从心室和萼筒开始发病，会在心室内生长出灰黑、黑白或灰绿的霉状物，也可从心室逐渐向外霉烂，果肉味极苦。外观症状不明显，较难识别。幼果受害重的，早期脱落。近成熟果实受害偶尔果面发黄，果形不整，或者着色较早。国内有研究者将苹果霉心病和心腐病症状分为心室小病斑型、心室大病斑型、心室腐烂型及整果腐烂型则将苹果霉心病和心腐病症状划分为褐变型、霉心型和腐烂型三种。

、实验地点：

青岛市城阳区惜福镇苹果园；

实验地土壤肥力中等，地势为缓坡地，排水良好，果园管理正常，长势良好。试验树为红富士品种, 树龄15年

2、实验设置：

（1）空白对照：清水；

（2）微生物处理组：蜡状芽孢杆菌SC2菌液，活菌含量10⁸CFU/mL。

微生物处理组，设3个处理, 分别按10倍、100倍、1000倍稀释菌液后喷施。每一处理用2株树, 重复3次。喷施日期为4月15日(花瓣初展)、4月20日(盛花期)和4月29日(花瓣大部分脱落), 共喷施3次。

试验园于8月27日采收, 每株树采果约120个, 置18℃室内诱发20天后剖果检查。分5级记载, 分级标准为：0级，无病；1级，心室内有淡褐色、褐色点状或条状小斑点，无明显菌丝丛，不影响食用和商品价值；2级，心室内有褐色斑块，范围超过心室壁之半或有明显菌丝丛，菌丝丛浓密或种子变色，但心室壁以外果肉完好；3级，心室壁以外果肉开始腐烂，宽度在5mm 以内；4级，心室壁以外果肉腐烂，宽度在5mm以上，粉红色干腐或褐色软腐。计算0级果、1级果、2～4级果所占百分率，测验差异显著性，分析防治效果，具体结果见表3。

表3 不同处理组各级果所占百分比

从表3中的数据可以看出，与清水对照组相比，本发明施用蜡状芽孢杆菌SC2菌液的三个处理组，0级果分别增加33.5%～86.5%；1级果减少25.1%～70%；2～4级果减少34%～76.2%，而且从剖果检查中看到, 蜡状芽孢杆菌处理组的苹果, 心室与萼筒间的组织变褐的较少, 保持绿色的较多；1级病果中, 霉点局限于心室顶端, 而清水对照组苹果心室中霉点分布较广。上述结果表明，本发明提供的蜡状芽孢杆菌SC2能有效防治苹果霉心病，有助于减少该病对果农的经济损失，同时减少苹果的农药残留，实现绿色生产。

Claims

1.一种防治葡萄白腐病和苹果霉心病的方法，其特征在于，所述方法是通过施用蜡状芽孢杆菌菌液实现的，所述的蜡状芽孢杆菌的保藏编号为：CGMCC NO.3836。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蜡状芽孢杆菌菌液中活菌数不低于10⁵CFU/mL。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的蜡状芽孢杆菌菌液的制备方法包括：

(1)在营养琼脂培养基上划线接种蜡状芽孢杆菌，37℃，培养12小时；然后转接种至茄瓶新鲜营养琼脂斜面，37℃，培养12h；

(2)将菌种从茄瓶斜面洗下接种至种子罐，37℃，培养12h，种子罐中培养基的组分及其所占重量比分别为：豆饼粉2.5％，玉米浆2％，磷酸氢二钠0.1％，硫酸铵0.05％，硫酸锰0.05％。

(3)将种子罐中的种子接种到5吨发酵罐中培养，发酵罐中培养基的组分及其所占重量比分别为：豆粕4％，玉米粉2％，硫酸锰0.05％，硫酸镁0.05％，接种量5％，37℃，150rpm，培养20h，即得蜡状芽孢杆菌菌液。