CN102321554A - 一种蜡状芽孢杆菌及其作为植物根际促生菌的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)CGMCC No.4991及其作为番茄枯萎病拮抗菌的应用。通过大棚和大田蔬菜苗番茄、黄瓜、辣椒、茄子四种作物的幼苗根际土壤样品进行筛选、驯化选育，获得一株编号为HG5的菌株。通过对所获菌株进行形态特征及16S rRNA序列测定及系统发育分析，初步确定了其分类地位；同时，该细菌HG5兼有促进植物生长和生物防治功能良好的技术效果。本发明菌株具有广泛应用领域。

Description

一种蜡状芽孢杆菌及其作为植物根际促生菌的应用
发明领域
本发明涉及促生菌生物技术领域，具体的说，本发明涉及一种蜡状芽孢杆菌及其作为植物根际促生菌应用的技术领域。
背景技术
植物根围促生细菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，简称PGPR)，生存于植物根际、根表，能够直接或间接地促进或调节植物以及作物生长。近年来，PGPR菌株的筛选利用及其促生机制的研究已成为一个热点。大量资料表明，植物根际细菌是筛选PGPR的重要资源库。现报道较多的是假单胞菌属和芽胞杆菌属的根际细菌具有防病促生的能力。PGPR集中的一些菌属如假单胞菌属(Pseudomonas)、布克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、杆菌属(Bacillus)等，同时也是植物常见病原菌较为集中的几类菌属。这些菌株对设施作物来说，是促生或是抑制，取决于不同物种或品种作物以及菌种代谢产物不同的浓度是否适宜。
农业生产中化肥和农药的使用量逐年增加，在提高作物产量的同时也产生了极大的环境问题。随着现代生物科学技术的进步，人们对接种微生物促进作物生长给予了高度重视。兼有促进植物生长和生物防治功能的PGPR菌是解决农业可持续发展的有效途径之一，其产生的植物激素可促进植物根系生长、增强根系吸收矿物营养和水分的能力，从而促进植物生长。同时，PGPR在根围的定殖能力在一定程度上抑制病原物的定殖和传播。更重要的是有些PGPR能够诱导植物产生系统抗性(induced systemic resistance，ISR)，从而提高植物整体的抗病能力。目前，国内外，尤其是国外研究人员已从一些重要的作物如水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestirum)、玉米(Zea mays)、甘蔗(Saccharum officinarum)和棉花(Anemonevitifolia)等作物根际分离筛选出大量高效优良促生菌株，并且部分菌株已用于商业化菌肥生产，在农业生产中发挥着重要作用。
随着科学的发展和技术的进步、筛选和鉴定手段的改善以及人们对PGPR的了解和认识逐步加深，大大地促进了PGPR菌剂的开发和商品化，研制和生产出能部分替代化学肥料及农药的产品已成为国际上重要的发展方向。PGPR以其促生潜力为开发和利用生物肥料及农药提供了理论和实践上的可能，具有深远的经济和社会意义。
发明内容
目前，国内外还未有针对蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)作为植物根际促生菌的研究现状，本发明旨在一种蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)及其作为植物根际促生菌的应用，通过试验验证，采用本发明提供的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)具有良好的植物根际促生的技术效果。
本发明的技术方案：通过选取新疆乌鲁木齐县六十户乡大棚和大田蔬菜苗番茄、黄瓜、辣椒、茄子四种作物的幼苗根际土壤样品进行筛选、驯化选育，获得一株编号为HG5的菌株。通过对所获菌株进行形态特征及16S rRNA序列测定及系统发育分析，初步确定了其分类地位；同时，该细菌HG5兼有促进植物生长和生物防治功能良好的技术效果。
具体的，本发明提供的一种蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，命名为HG5。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2011年6月27日，保藏号是CGMCC No.4991。经微生物学鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。在LB平板培养基上，37℃，培养24h，形成圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落(似蜡烛样颜色)直径5-7mm。在显微镜下，呈杆状，芽孢椭圆形，中端或次端生，包囊无明显膨大。依照第九版《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey，s Manual of Systematic Bacterio-logy》)和《常用细菌系统鉴定手册》对HG5菌株进行形态学测定，生理生化检测确定HG5菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)中的成员。通过BLAST同源比对，菌株HG5的ITS序列与Bacillus velezensis的ITS序列的相似性最高，因而将HG5菌株确定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。
进一步，本发明一种蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)作为番茄枯萎病拮抗菌的应用。
本发明进一步提供了菌种的保存条件。采用灭菌的脱脂牛乳洗脱试管斜面上的菌苔，制成浓厚菌悬液。然后用无菌吸管将菌悬液滴入小试管底部。每管一滴，然后转动小试管使菌液分散在试管底部的壁上。标记菌名，将小试管装在15×150mm的试管中，在大试管底部事先装上1.5cm高的(p2o5或koh)，管口用带玻璃管的橡皮塞塞紧，蜡封。将大试管与真空泵连通，抽真空至0.1～0.2mm汞柱时，将玻璃管熔封，置室温暗处或冰箱-20℃保存。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果：本发明提供了分离得到的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)CGMCC No.4991，是一种芽孢杆菌，兼有促进植物生长和生物防治功良好的技术效果，通过将筛选出的菌种接种于大田，在实际应用中具有良好的促生效应。
附图说明
图1所示为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)CGMCC No.4991的菌落形态图。
图2所示为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)CGMCC No.4991的拮抗菌16SrRNA片段PCR扩增结果图。
图3所示为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)CGMCC No.4991的16S rRNA系统发育树图。
图4所示为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)CGMCC No.4991兼有促进植物生长和生物防治功良好的技术效果图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂和仪器设备：MSSPX-250型生化培养箱，SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台，MLS-3020高压蒸汽灭菌锅，E360K离心机，恒温摇床HWY-100。PCR Eppendorf No：5345，电泳仪Bio-Rad Model 200/2.0，凝胶成像仪United-Bio，GK-330C plus，恒温水浴锅，PCR预混液(TaKaRaBiotechnology)，其余试剂均为分析纯。
土样的采集：选取乌鲁木齐县六十户乡大棚和大田蔬菜苗番茄、黄瓜、辣椒、茄子四种作物的幼苗根际土。经随机取样，将样品放在自封袋中，立即带回实验室，放置4℃冰箱备用。取幼苗根部，轻轻掸去外围土壤，用灭菌的剪刀自根部以上全部剪去，把剪下的根放入盛有无菌水的三角瓶中。常温下，180rpm/min，震荡30min，使根部土完全融于无菌水中。
本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：菌种的分离、筛选与鉴定
(1)用于细菌分离、培养和纯化的LB培养基
液体LB：胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl 10g；用5mol/L NaOH调pH至6.8-7.0，去离子水定容至1L。
固体LB：胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl 10g；琼脂15g；用5mol/LNaOH调pH至6.8-7.0，去离子水定容至1L。
(2)根际促生菌的分离
涂布法，将根部土混合液，按8个浓度梯度10-1-10-8cfu/mL涂布于平板，各设一个重复，于30℃培养箱培养3-5天。选择合适的浓度平板，按照形态、大小、颜色，挑取细菌的典型单个菌落，在LB培养基上纯化后，对筛选到的菌株进行斜面保存。4℃冰箱，备用。
经平皿培养，得到蜡状芽孢杆菌HG5。参见附图1。
(3)对优势PGPR菌进行16S rRNA序列扩增及其测序挑取少量单菌落，放入盛有25μL无菌水的EP管中，100℃煮沸8-10min，后迅速放入冰水混合物中5min。离心10000r/min、5min，4℃保存，用时取上清。PCR扩增乳酸菌16S rRNA序列。
引物1(27F)：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；
引物2(1492R)：5′-CAAACTTGGTCATTAGAGGA-3′。
PCR扩增反应体系为50μL，含有24μL premix Taq，引物1 1μL，引物2 1μL，模板2μL，无菌水22μL。扩增条件：94℃4min；94℃30s，55℃90s，72℃30s，30个循环；72℃7min。扩增产物(约1500bp)经1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，PCR产物直接进行双向测序。
(4)16S rRNA序列比对及系统发育分析将测序得到的16S rRNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行BLAST分析，从中获取相近的16S rRNA序列，用ClustalX软件和MEGA 4.1中的Neighbor-joining法构建系统进化树。
(5)PCR结果及系统发育分析
有明显促生优势的菌株HG5 16S rDNA PCR鉴定结果。参见附图2所示，扩增条带片段大小约为1500bp，与预计大小相当，扩增的样品整齐度较高，目标条带清晰，无杂带。
对所筛选具有广适促生潜能的菌株HGB5进行16s rDNA基因序列分析，结果显示HG5属于芽孢杆菌属(Bacillus)。参见附图3。
实施例二：蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的生理生化测定
结合《伯杰细菌鉴定手册》对菌株的生理生化特征进行分析。结果见表1。
把菌株HG5接到含不同盐(NaCl)浓度、抗生素(氨苄青霉素)浓度、pH的PDA培养基上，置入28℃培养箱培养7d。再把菌株HG5接到PDA培养基上，分别置入4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的培养箱中培养。结果见表2。HG5在35℃、PH7.0、NaCl浓度6％生长最好。
表1：菌株HG5的生理生化特性
  生理生化试验  结果   生理生化试验  结果
  运动性        +   淀粉水解      -
  过氧化氢酶    +   明胶水解      +
  V.P           +   酪素水解      +
  硝酸盐                +   葡萄糖     +
  柠檬酸盐              +   蔗糖       +
  PH5.7肉汤培养基生长   +   麦芽糖     +
  甲基红                -   糊精       +
表2：温度、pH、盐、抗生素对菌株HG5生长的影响
  温度(℃)   4   10   15   20   25   30
  生长情况   -   -   -   +   ++   +++
  温度(℃)   35   40   45   50   55   60
  生长情况   ++++   ++   ++   -   -   -
  pH   1   2   3   4   5   6
  生长情况   -   -   -   -   -   -
  pH   7   8   9   10
  生长情况   ++   +   -   -   -
  NaCl浓度   0.5％   1％   2％   3％   4％   5％
  生长情况   +   ++   ++   +   ++   ++
  NaCl浓度   6％   7％   8％   9％   10％
  生长情况   +++   +++   ++   -   -   -
  氨苄青霉素μg/ml   50   100   150   200   250   400
  生长情况   +   -   -   -   -   -
实施例三：蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)植物根际促生检验
PGPR平皿实验：操作在无菌条件下进行。番茄，黄瓜种子处理，用10％双氧水处理20min，用清水冲洗5-6遍，去除表面残留，晾干备用。将分离纯化后的菌株接种到LB液体培养基中，接种置于180rpm，28℃摇床培养，菌量得数量级达109cfu/mL为宜。对菌液进行梯度稀释，共7个梯度，10-1-10-7cfu/mL。将消毒后的黄瓜和番茄种子置于预先装有湿润滤纸的灭菌培养皿中，加入各梯度菌悬液，对照用无菌水处理。放置于光照培养箱，28℃，定期观察种子萌发情况。3d后测量番茄、黄瓜根长及下胚轴长。
对HG5初步平板筛选到对番茄、黄瓜幼苗有明显的促生作用，相对于对照组，经过菌剂处理的幼苗根长、须根多、茎粗。
营养钵促生测定：平皿初选后，通过营养钵促生实验进一步验证HG5促生能力。将菌悬液处理的番茄、黄瓜种子，播于营养钵中，所用的土是经过两次高压湿热灭菌的菜园土。每钵播种3个，每菌株20个重复。对照用无菌水处理。然后将钵置于温室中，室温下培养。定期观察出苗率、生长势、存活苗数情况，出苗两周后取材，比较植株根长、茎粗、株高、真叶展开度和鲜(干)重质量等生理指标等生理指标。最后，试验数据使用SPSS 17.0统计软件对数据进行单因素方差统计分析，显著性比较运用T检验法。
与对照组相比，HG5对黄瓜、番茄幼苗生长有较为显著的促进作用，接种幼苗表现为根粗，须根多，株高，茎粗，真叶扩展大，鲜(干)重均比对照组重。综合分析，HG5对黄瓜、番茄幼苗的生长均具有促生作用。见表3、4
表3接种不同作物根际促生菌番茄幼苗生长的影响
Figure BSA00000564980300081
表4接种不同作物根际促生菌番茄幼苗生长的影响
Figure BSA00000564980300082

Claims (2)

1.一种蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，其保藏编号为CGMCC No.4991。
2.如权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)CGMCC No.4991作为番茄枯萎病拮抗菌中的应用。
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