CN101289649A - 番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种番茄灰霉病拮抗菌株B－04－glu，其特征在于包括以下四个步骤：步骤1从感染灰霉病的土壤样品中筛选到一株高效拮抗灰霉病的蜡样芽孢杆菌，该细菌命名为B－04；步骤2培养含有B－04细菌的菌液；步骤3依次用超纯水、1mM Hepes、电击缓冲液洗；步骤4通过电击的方法将β－1，3－葡聚糖酶基因转化到B－04细菌内，获得拮抗菌株B－04－glu。本发明由于是生物防治，不含有化学农药的嘧啶胺类、吡咯类以及酰胺类等成份，所以具有无毒、不污染环境、不易产生抗药性、无残留、易生产、持效期长、治病力强、应用效果好、对非靶标生物安全等优点，具有广阔的应用前景。
Description
所属技术领域
本发明涉及一种菌株，具体是涉及一种番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu。
技术背景
灰霉病是由半知菌亚门灰葡萄孢属(Botrytis cinerea Pers)真菌侵染所致，是一种世界性重要病害。不仅对番茄的危害越来越重，而且目前已成为番茄、黄瓜、茄子、西葫芦、菜豆、莴笋、生菜、韭菜等蔬菜的主要病害，目前在生产上对番茄灰霉病的防治主要依靠喷洒化学农药，现在具有较高活性的新型化学农药主要有嘧啶胺类、吡咯类以及酰胺类等。但若连续使用化学药剂，病菌会逐渐产生了抗药性，防效逐年下降，而且化学农药影响番茄品质、污染环境、影响人类健康。
发明内容
本发明的目的是提供一种不含有化学农药的嘧啶胺类、吡咯类以及酰胺类等成份、能对治疗番茄灰霉病具有良好应用效果的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu。其技术方案为：
番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其特征在于包括以下四个步骤：步骤1从感染灰霉病的土壤样品中筛选到一株拮抗灰霉病的蜡样芽孢杆菌，该细菌命名为B-04；步骤2培养含有B-04细菌的菌液；步骤3依次用超纯水、1mM Hepes、电击缓冲液洗；步骤4通过电击的方法将β-1，3-葡聚糖酶基因转化到B-04细菌内，获得拮抗菌株B-04-glu。
所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，步骤2中：将单个B-04细菌菌落接种到LB培养基中，于26～32℃摇床剧烈振荡培养6～20h，然后将生成的菌悬液与LB培养基按1∶10的比例接种，再于26～32℃摇床剧烈振荡培养至对数生长期2～3.5h。
所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，步骤3中：将步骤2最终获得的菌液先冰浴20～40min，然后离心收集菌体，将收集的菌体依次用预冷的超纯水洗至少1～3次，用浓度为1mM、pH为7.0的Hepes洗1～3次，用浓度为1mM的Hepes、含甘油10％且pH为7.0的电击缓冲液洗1～3次，然后悬浮到1.0～2.0ml电击缓冲液中，分装成每管100μl，储藏于-70℃的冰箱中。
所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，步骤4中：电击转化时取一管菌液放在冰上溶解，溶解后加入5～10μl质粒DNA，冰上放置2～10min后转移到电击转化杯中，电击条件为800～1800V、电容25～50uF、电阻100～400Ω、电击杯内径2mm，电击后将其菌液加入到500μl～1.5ml LB培养基中，在37℃培养0.5～24h后，取100μl菌液涂在含有相应抗生素的平板上，于26～32℃培养6～24h，即获得拮抗菌株B-04-glu。
所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，以B-04为出发菌株，用β-1，3-葡聚糖酶基因构建工程菌B-04-glu，β-1，3-葡聚糖酶基因从质粒pUC1940中酶切获得。
其工作原理为：B-04细菌本身有较强的抗番茄灰霉病的功能，β-1，3-葡聚糖酶又能导致菌丝细胞壁破裂，原生质体外泄，从而杀死病原菌，因此通过电击的方法将β-1，3-葡聚糖酶基因转化到B-04细菌内，获得的拮抗菌株B-04-glu与野生菌株相比，能大大提高了防治番茄灰霉病的能力。
本发明与现有技术相比，由于是生物防治，不含有化学农药的嘧啶胺类、吡咯类以及酰胺类等成份，所以具有无毒、不污染环境、不易产生抗药性、无残留、易生产、持效期长、治病力强、应用效果好、对非靶标生物安全等优点，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
实施例1：
步骤1：从感染灰霉病的土壤样品中筛选到一株拮抗灰霉病的蜡样芽孢杆菌，即B-04细菌；
步骤2：将单个B-04细菌落接种到LB培养基中，于30℃摇床剧烈振荡培养20h，然后将生成的菌悬液与LB培养基按1∶10的比例接种，再于30℃摇床剧烈振荡培养至对数中期约3h；
步骤3：将步骤2最终获得的菌液冰浴20min，离心收集菌体，将收集的菌体依次用预冷的超纯水洗1次，用浓度为1mM、pH为7.0的Hepes洗2次，用浓度为1mM的Hepes、含甘油10％且pH为7.0的电击缓冲液洗2次，然后悬浮到1.5ml电击缓冲液中，分装成每管100μl，储藏于-70℃的冰箱中；
步骤4：电击转化时取一管菌液放在冰上溶解，溶解后加入5μl质粒DNA，质粒DNA为β-1，3-葡聚糖酶基因与质粒连接产物，冰上放置3min后转移到电击转化杯中，电击条件为电压800V、电容50uF、电阻200Ω、电击杯内径2mm，电击后将其菌液加入到800μl LB培养基中，在37℃培养45min后，取100μl菌液涂在含有相应抗生素的平板上，于30℃培养10h，获得70个转化子拮抗菌株B-04-glu。
实施例2：
其步骤1同实施例1的步骤1；
步骤2：将单个B-04细菌落接种到LB培养基中，于28℃摇床剧烈振荡培养15h，然后将生成的菌悬液与LB培养基按1∶10的比例接种，再于28℃摇床剧烈振荡培养至对数中期约2.5h；
步骤3：将步骤2最终获得的菌液冰浴30min，离心收集菌体，将收集的菌体依次用预冷的超纯水洗2次，用浓度为1mM、pH为7.0的Hepes洗1次，用浓度为1mM的Hepes、含甘油10％且pH为7.0的电击缓冲液洗2次，然后悬浮到1.5ml电击缓冲液中，分装成每管100μl，储藏于-70℃的冰箱中；
步骤4：电击转化时取一管菌液放在冰上溶解，溶解后加入8μl质粒DNA，质粒DNA为β-1，3-葡聚糖酶基因与质粒连接产物，冰上放置5min后转移到电击转化杯中，电击条件为电压1200V、电容25uF、电阻400Ω、电击杯内径2mm，电击后将其菌液加入到800μl LB培养基中，在37℃培养1h后，取100μl菌液涂在含有相应抗生素的平板上，于28℃培养15h，获得600个转化子拮抗菌株B-04-glu。
实施例3：
其步骤1同实施例1的步骤1；
步骤2：将单个B-04细菌落接种到LB培养基中，于26℃摇床剧烈振荡培养10h，然后将生成的菌悬液与LB培养基按1∶10的比例接种，再于26℃摇床剧烈振荡培养至对数中期约2h；
步骤3：将步骤2最终获得的菌液冰浴40min，离心收集菌体，将收集的菌体依次用预冷的超纯水洗2次，用浓度为1mM、pH为7.0的Hepes洗2次，用浓度为1mM的Hepes、含甘油10％且pH为7.0的电击缓冲液洗1次，然后悬浮到2.0ml电击缓冲液中，分装成每管100μl，储藏于-70℃的冰箱中；
步骤4：电击转化时取一管菌液放在冰上溶解，溶解后加入10μl质粒DNA，质粒DNA为β-1，3-葡聚糖酶基因与质粒连接产物，冰上放置8min后转移到电击转化杯中，电击条件为电压1400V、电容50uF、电阻200Ω、电击杯内径2mm，电击后将其菌液加入到800μl LB培养基中，在37℃培养1.5h后，取100μl菌液涂在含有相应抗生素的平板上，于26℃培养20h，获得800个转化子拮抗菌株B-04-glu。
Claims (5)
1、一种番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其特征在于包括以下四个步骤：步骤1从感染灰霉病的土壤样品中筛选到一株高效拮抗灰霉病的蜡样芽孢杆菌，该细菌命名为B-04；步骤2培养含有B-04细菌的菌液；步骤3依次用超纯水、1mM Hepes、电击缓冲液洗；步骤4通过电击的方法将β-1，3-葡聚糖酶基因转化到B-04细菌内，获得拮抗菌株B-04-glu。
2、如权利要求1所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其特征在于：步骤2中，将单个B-04细菌菌落接种到LB培养基中，于26～32℃摇床剧烈振荡培养6～20h，然后将生成的菌悬液与LB培养基按1∶10的比例接种，再于26～32℃摇床剧烈振荡培养至对数生长期2～3.5h。
3、如权利要求1所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其特征在于：步骤3中，将步骤2最终获得的菌液先冰浴20～40min，然后离心收集菌体，将收集的菌体依次用预冷的超纯水洗至少1～3次，用浓度为1mM、pH为7.0的Hepes洗1～3次，用浓度为1mM的Hepes、含甘油10％且pH为7.0的电击缓冲液洗1～3次，然后悬浮到1.0～2.0ml电击缓冲液中，分装成每管100μl，储藏于-70℃的冰箱中。
4、如权利要求1所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其特征在于：步骤4中，电击转化时取一管菌液放在冰上溶解，溶解后加入5～10μl质粒DNA，质粒DNA为β-1，3-葡聚糖酶基因与质粒连接产物，冰上放置2～10min后转移到电击转化杯中，电击条件为800～1800V、电容25～50uF、电阻100～400Ω、电击杯内径2mm，电击后将其菌液加入到500μl～1.5ml LB培养基中，在37℃培养0.5～2h后，取100μl菌液涂在含有相应抗生素的平板上，于26～32℃培养6～24h，即获得拮抗菌株B-04-glu。
5、如权利要求1所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其特征在于：以B-04细菌为出发菌株，用β-1，3-葡聚糖酶基因构建工程菌B-04-glu，β-1，3-葡聚糖酶基因从质粒pUC1940中酶切获得。
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