CN103614306A - 一株酵母菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了酵母菌株及其应用，该菌株于2012年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.6840。利用该酵母菌发酵液处理种子，不仅安全环保、效果明显、病原细菌不易产生抗药性，而且不会因处理不当影响种子萌发。另外，施用PA0732-1与田间，易定殖于哈密瓜植株表面，对哈密瓜病害具有很好的预防效果。

Description

一株酵母菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一株酵母菌株及其应用，具体地说，涉及一株酵母菌株PA0732-1及其应用。 

背景技术

瓜类细菌性果斑病是近年来新发生并流行开来的一种毁灭性病害。也是世界检疫性病害。2007年5月，我国农业部重新将该病列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中，作为重大检疫性植物病害。该病主要引起西瓜、甜瓜、籽瓜果实的腐烂，导致减产。同时也能危害瓜类子叶、真叶，污染瓜种。具有发病快、防治难、为害重等特点。据不完全统计，全球已有16个国家相继报道了该病的发生，我国已达17个省市发现或报道了该病。其中新疆、内蒙古、甘肃瓜产区危害重大，常年造成10%-30%的减产，发病重的年份，个别地块绝产，严重影响了瓜农种植的积极性，使特色优势产业失去了市场竞争活力。另外瓜类细菌性果斑病对合法种子经销商的利益也不断受到损害，禁售和索赔事件频繁发生，引发一系列社会性问题。有效防治该病成为目前哈密瓜生产中面临的亟待解决的问题。 

哈密瓜细菌性果斑病由燕麦食酸菌西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp.citrulli Willems）（Aac）引起，属革兰氏阴性菌，菌体短杆状，属rRNA组I。主要危害厚皮甜瓜、西瓜、籽瓜、南瓜、黄瓜、丝瓜、蜜露洋香瓜和网纹洋香瓜等，也可以感染番茄、胡椒、茄子等，不能侵染玉米、大豆。病菌主要通过伤口和气孔侵染哈密瓜。远距离传播通过调运带菌种子人为传播，病种萌发后病菌先侵染子叶，引起幼苗染病，湿度大时，病斑上形成的菌脓，借助雨水、风、昆虫及农事操作等途径近距离的传播，从而使病菌在田间得以定殖和流行。 

对于瓜类细菌性果斑病的防治，国内外学者也做了大量的研究，虽在一定程度上控制了该病害的发生和蔓延，但成效令人不满意。因此，加强进、出口种子的检疫是预防该病发生的首要措施。对于种子检测，国内外成功建立了多种检测技术体系，如RFLP、PCR产物杂交、PCR产物测序及同源性分析、免疫磁性分离PCR技术等，这些技术能有效地检测和鉴定出病原的种类，而且成效显著。， 但检测后的带菌种子的处理及田间防治研究报道较少。目前国内外防治该病仍依赖稀酸浸种技术，铜制剂和抗生素类化学药剂进行防治。用物理方法处理种子，操作简单，能减轻病害的发生，但不能根除。施用可杀得等铜制剂浓度掌握不当，易造成西瓜和甜瓜药害。运用过量抗生素类化学药剂易造成的果实残留，对部分人群健康有害。应用抗病品种防治该病是最简便、经济、有效的途径，但目前尚未发现有免疫的哈密瓜品种。 

本项目选用了酵母菌作为该病的生防材料，其具有抗逆性强，对环境要求不高，能利用低水平的营养物质迅速繁殖成为主导菌，分泌所产生的胞外多糖具有加强其生存能力和抵制病原菌的侵染作用；受杀虫剂的影响较小；酵母菌的遗传学基础研究的比较清楚，遗传转化系统比较完善，具有通过基因工程技术改造提高防效的潜力；大多数拮抗酵母菌不产生对人体有害的抗菌素，同时可以避免病菌对抗菌素产生抗性而降低生物防治的效果。因此，这些独具优势的特性使酵母菌成为植物病害生物防治的一类极具应用潜能的新资源菌，在今后植物病害防治中起着举足轻重的生防作用，越来越受到人们的重视。 

20世纪50年代以来，酵母菌在植物病害防治领域的研究发展迅速，利用酵母菌防治植物真菌病害的研究已取得了不少的突破性进展，尤其在果蔬采后病害的防治上相关文献报道很多，但对于植物细菌病害防治目前国内外研究少见报道。迄今为止，已报道有20多种酵母菌用于苹果、梨、草莓、柑橘、葡萄、桃、樱桃、油桃、猕猴桃等果实真菌病害的生物防治。一些国家还成功利用酵母菌研制开发了安全有效的生物制剂等，在控制柑橘类和仁果类果实采后腐烂具有很好的防效。利用酵母菌防治病害已逐步发展成为国内外研究的热点。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术所存在的上述不足，而提供一株酵母菌株PA0732-1及其应用。通过从外界环境中经大量的分离、筛选酵母菌，成功获得一株拮抗Aac效果显著的酵母菌株PA0732-1，证明了利用酵母菌可以防治细菌性病害。同时发现酵母菌株0732-1发酵液中存在酸性抑细菌菌物质。利用酵母菌发酵液处理种子，不仅安全环保、效果明显、病原细菌不易产生抗药性，而且不会因处理不当影响种子萌发。另外，施用PA0732-1于田间，易定殖于哈密瓜植株表面，对哈密瓜病害具有很好的预防效果。 

其技术方案为： 

本发明所述酵母菌株分离于石河子西瓜叶片表面，菌株代号为PA0732-1，该菌株于2012年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.6840。 

一种酵母菌株PA0732-1发酵液的制备方法，包括以下步骤： 

1）酵母菌株PA0732-1通过PDA培养基或PSA培养基，进行菌种培养或活化，PSA培养基配方为：土豆200g，蔗糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH6.8～7.0； 

2）将PSB培养液加入容器中，PSB培养液配方为土豆200g，蔗糖20g，水1000ml，pH7.0，加入量为容器空间体积与培养液体积4∶1，按2%的接种量接入≈1×10⁸cfu/ml菌种悬浮液，置于26℃，150r/min恒温摇床上震荡培养4天。 

本发明所述酵母菌株发酵液在防治哈密瓜细菌性果斑病中的应用。 

本发明的有益效果： 

本发明获得的酵母菌株PA0732-1，施用于田间，易定殖于哈密瓜植株表面，带菌种子经酵母菌PA0732-1处理时间大于30min以上可以取得很好的防治效果，利用浓度高于1×10⁷cfu/ml的酵母菌PA0732-1菌悬液处理瓜叶，防治效果将优于利用杀菌剂可杀得2000（Kocide）。 

附图说明

图1为酵母菌PA0732-1形态特征，其中A，菌落形态（PDA/28℃/2d）；B，假菌丝形态；C，菌体及其芽殖；D，子囊孢子形态； 

图2为哈密瓜苗期细菌性果斑病叶部发病病情分级标准症状； 

图3为酵母菌PA0732-1发酵产物对哈密瓜种子处理后防病效果； 

图4为发酵液处理不同时间对哈密瓜果斑病发病的影响； 

图5为哈密瓜田间叶片发病病情分级标准症状； 

图6为田间接种浓度对哈密瓜叶片防病效果的影响，A，发病率；B，病情指数。 

微生物信息 

本发明的一个优选实施方式以及具体实施方式中所使用的异常毕赤酵母菌（Pichia anomala）已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.6840，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年11月19日。 

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的方法作进一步详细地说明。 

1、菌株特征： 

酵母菌株在PDA培养基上菌落乳白色、圆形或椭圆形，表面隆起，中央无光泽，边缘光滑整齐，质地粘稠，有芳香味。易形成发达的的假菌丝。菌体细胞呈卵圆形，5～7μm×3～5μm（长×宽），菌体多芽殖。不形成掷孢子产生。产生圆形子囊，内含多个礼帽形子囊孢子，大小为3.5～4.2μm×1.2～1.8μm（见图1）。在半厌氧条件下，酵母菌PA0732-1可发酵D-葡萄糖、D-半乳糖、麦芽糖和蔗糖，但不能发酵乳糖。在有氧环境下，可以同化D-葡萄糖、D-半乳糖、麦芽糖、蔗糖、D-木糖、淀粉、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、甘露醇、甘油、乙醇和山梨醇，不能同化甲醇、乳糖和肌醇。对氮源同化测定，酵母菌PA0732-1可以同化L-赖氨酸盐酸盐、硝酸钾和硫酸铵，但不能同化肌酸。另外，该菌能在42℃生长。耐高渗透压。利用引物ITS1和引物ITS4的序列分别为5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’PCR扩增后，可获得酵母菌株的ITS-5.8SrDNA片段大小为617bp。所获序列已提交GenBank，登录号为EU380207。 

2、菌株培养方法： 

（1）PSB培养液的制备：将洗净后去皮的马铃薯切块，放入1000ml水中，煮沸20～30min，用纱布滤去马铃薯，滤液中加入蔗糖20g，搅拌，使糖溶解后补水至1000ml，然后用40%NaOH调节溶液pH为7.0。制好的培养液分装入三角瓶中，封口后，放入湿热灭菌器中，121℃（压力≈0.105MPa）灭菌25min，取出冷却后待用。 

（2）菌株活化：将4℃保藏的PA0732-1试管菌株取出，在无菌环境中（或超净工作台内）用接种环刮取试管斜面上的菌体少许放入100mlPBS培养液中，封口后，置于28℃，160r/min恒温摇床上震荡培养48小时后待用。 

（4）菌株菌悬液的配制：将活化好的菌株取出后，用无菌水进行稀释，利用纽鲍尔血球计数板计数法，使稀释液中菌株菌体控制在约1×10⁸cfu/ml即可。 

（3）发酵液的制备：在无菌环境中，将灭菌后的PSB培养液加入容器中，加入量为容器剩余空间体积比与培养液3∶1，按2%的接种量接入≈1×10⁸cfu/ml菌种悬浮液，置于26℃，150r/min恒温摇床上震荡培养4天。 

3、生产方法 

菌株置于PSB发酵后所得发酵液即可使用。 

4、具体实施案例-------对哈密瓜细菌性果斑病的防治应用 

实验材料： 

（1）病原菌的准备：将-70℃保存的哈密瓜细菌性果斑病菌XJ05-1（Aac）经KBA培养基（配方：蛋白胨20g，甘油10g，磷酸氢二钾1.5g，七水硫酸镁1.5g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2）平板上活化（28℃，48h）后，蘸取少量菌体接种于KB培养液（KBA中不加琼脂即可）中，摇培（28℃，160r/min）48h。利用紫外-可见分光光度计将菌悬液的浓度调整到OD₆₀₀≈0.3，即1×10⁸cfu/ml待用。 

（2）酵母菌PA0732-1种子处理液的制备：将新培养的酵母菌接种于装有150mlPSB培养液的三角瓶（V500ml）中，置于26℃，150r/min恒温振荡摇培，96h后，取发酵液备用。 

（3）供试种子：哈密瓜品种86-1购自新疆石河子市蔬菜所。 

（4）数据统计与分析：所获数据采用SAS统计软件（SAS Institute，Cary，NC，USA，Version8.0，1999）进行方差分析（ANOVA）。发病率和防治效果方差分析前先进行平方根反正弦转化。采用Duncan氏新复极差法比较处理之间的差异显著性（P=0.05）。 

试验一：带菌种子处理试验 

将哈密瓜种子浸于1×10⁸cfu/mlAac菌悬液中，20min后，滤出种子，28℃过夜晾干备用。试验设置3种处理带菌哈密瓜种子：A、酵母菌PA0732-1发酵液；B、2％盐酸（v/v）；C、0.1％农用链霉素溶液（g/g）。处理时间为20min。处理后，除了A处理不需要清洗外，其他处理需在流水下冲洗3遍，晾干备用。处理后的种子播种于装有无菌土的营养钵中，底部灌水湿润土壤后，放于温室内（室温30～32℃，湿度>85%），待幼苗长出10d后，观察并记录发病情况。每处理重复3次。整个试验重复3次。以浸泡过Aac的种子作对照。病情指数（Disease Index，DI）计算公式： 

$\mathrm{DI}=100\underset{i=0}{\overset{4}{\mathrm{\Σ}}}(L_i\×i)/4\underset{i=0}{\overset{4}{\mathrm{\Σ}}}\left(L_i\right)$

i：代表分级数；L_i：每级数发病叶片数。 

调查苗期病情指数的标准： 

1级：叶片健康，无病斑产生（见图2中0级）； 

2级：叶片形成的病斑面积占整片叶片面积小于15%（见图2中1级）； 

3级：叶片形成的病斑面积占整片叶片面积16～50%（见图2中2级）； 

4级：叶片形成的病斑面积占整片叶片面积50～80%（见图2中3级）； 

5级：叶片形成的病斑面积占整片叶片面积大于80%（见图2中4级）。 

试验结果： 

由图3可得，用2%的HCl、PA0732-1发酵液和0.1%硫酸链霉素处理带菌哈密瓜种子后，瓜苗期细菌性果斑病的发病率明显降低，发病率分别为6.6%、10.7%和71.2%，对照为97%。2%的HCl和PA0732-1发酵液处理带菌种子防效明显，且防效差异不显著，防效分别为97.5%和95.4%。虽然2%的HCl防效最高，但用于处理种子技术要求较高，尤其对处理的时间和盐酸的浓度，时间过长或浓度过高往往会影响种子的出苗。 

试验二：酵母菌发酵液对哈密瓜细菌性果斑病菌致死效应 

哈密瓜种子浸泡于Aac菌悬液（≈1×10⁸cfu/ml）中，20min后，滤出种子，28℃过夜晾干备用。然后各取50粒病种分别用酵母发酵液处理10、30、60、90和120min，以带菌种子作对照。处理后的种子播种于装有无菌土的营养钵中种子，底部灌水湿润土壤后，放于温室内（室温30℃～32℃，湿度>90%），待幼苗长出10d左右，记录发病情况。病情指数分级标准参照试验一。 

试验结果： 

由图4可示，利用酵母菌发酵液处理带菌种子，发病率和病情指数随着处理时间的延长而降低。处理30、60、90和120min时，各处理间病情指数差异不显著。说明带菌种子经酵母菌PA0732-1处理时间大于30min以上可以取得很好的防治效果。 

试验三：田间接种浓度对哈密瓜叶片防病效果的影响 

为确定酵母菌PA0732-1在田间条件下抑制病原菌Aac的最低有效浓度。试验于2008、2009年分别在农六师103团6连和石河子大学试验站进行。选择田间气温 为30℃～35℃，当天下午进行试验。将浓度为1×10⁵、1×10⁷和1×10⁹cfu/ml的PA0732-1菌悬液分别喷布于哈密瓜瓜苗（苗龄为一芯四片真叶）上，待瓜叶晾干后喷布Aac菌悬液（1×10⁸cfu/ml）。每个处理15株瓜苗。Aac为阳性对照，800倍可杀得2000（Kocide）为阴性对照。3d后，开始统计瓜苗第2片真叶的发病率和病情指数（Disease index，DI）。每组试验重复3次。病情指数（DI）计算公式如下： 

$\mathrm{DI}=100\underset{i=0}{\overset{4}{\mathrm{\Σ}}}(L_i\×i)/4\underset{i=0}{\overset{4}{\mathrm{\Σ}}}\left(L_i\right)$

i：代表分级数；Li：每级数发病叶片数。 

田间调查病情指数分级标准： 

1级：叶片健康，无病斑产生（见图5中1⁰）； 

2级：叶片形成的病斑面积占整片叶片面积小于15%（见图5中2⁰）； 

3级：叶片形成的病斑面积占整片叶片面积16～30%（见图5中3⁰）； 

4级：叶片形成的病斑面积占整片叶片面积31～60%（见图5中4⁰）； 

5级：叶片形成的病斑面积占整片叶片面积大于60%（见图5中5⁰）。 

试验结果： 

由图6可示，不同接种浓度的处理随着病程的延长，哈密瓜叶片发病率最终均达100%。但在病情指数上有很大的不同，对照病情指数远高于其它的处理。接种15d后，对照病情指数为89.4。用1×10⁷cfu/ml和1×10⁹cfu/ml酵母菌PA0732-1菌悬液处理瓜叶片的病情指数分别为54.2和50.0，两者之间差异不显著（P=0.05）。可杀得2000处理后的病情指数为77.5，与对照差异不显著（P=0.05）。由此说明，利用浓度高于1×10⁷cfu/ml的酵母菌PA0732-1菌悬液处理瓜叶，防治效果将优于利用杀菌剂可杀得2000（Kocide）。 

本发明所涉及的核苷酸序列： 

酵母菌株PA0732-1的ITS-5.8SrDNA片段核苷酸序列，大小617bp，具体序列为SEQ ID NO.1。 

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。 

Application Project 

------------------- 

<120>Title:酵母菌株及其应用 

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Sequence 

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<211>Length:617 

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SequenceDescription。 

Claims (3)

1.一株酵母菌株，菌株代号为PA0732-1，该菌株于2012年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNo.6840。

2.一种权利要求1所述的酵母菌株PA0732-1发酵液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）酵母菌株PA0732-1通过PDA培养基或PSA培养基，进行菌种培养或活化，PSA培养基配方为：土豆200g，蔗糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH6.8～7.0；

2）将PSB培养液加入容器中，PSB培养液配方为土豆200g，蔗糖20g，水1000ml，pH7.0，加入量为容器空间体积与培养液体积4∶1，按2%的接种量接入≈1×10⁸cfu/ml菌种悬浮液，置于26℃，150r/min恒温摇床上震荡培养4天。

3.权利要求1所述酵母菌株发酵液在防治哈密瓜细菌性果斑病中的应用。

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