CN104988082A - 一株汉逊德巴利酵母菌株及其应用 - Google Patents

一株汉逊德巴利酵母菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）菌株，其为汉逊德巴利酵母XBL01菌株，保藏编号为CGMCC No.10464。本发明还提供该菌株和相应菌剂在制备病原菌抑制剂、病害抑制剂、生物农药和水果保鲜剂中的应用。本发明的汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌株能够很好的用于病原菌的防治，尤其是葡萄采后灰霉病菌Botrytis cinerea的防治，能够用于制备水果杀菌剂或保鲜剂，无副作用，不会给环境及生态造成巨大压力。

Description

一株汉逊德巴利酵母菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物菌剂技术领域，具体涉及一株汉逊德巴利酵母菌株及其应用。
背景技术
果实采后包括真菌和细菌病害是一类重要的病害，造成了果实的大量减产，严重影响了果实的食用价值和市场价值，导致了果农的经济收入降低。在发达国家，果实采后病害引起的损失量占果实总量的15%以上，在发展中国家由于缺少必要的防控技术和设备，果实采后病害引起的损失量占总量的30%以上。果实采后病害的发生是导致果实在流通环节中及贮藏期间发生大面积腐烂的主要诱因。果实采后病害的发生已给现代农业生产尤其是高端果蔬产品生产与加工造成了严重影响。因此，对果实采后病害的有效防控是实现果实保鲜的关键点。目前，市场上对果实采后病害防治，对果实进行保鲜的主要手段是使用食用化学杀菌剂或保鲜剂。但长期大量的使用会造成严重的“3R”问题，给环境及生态造成了巨大压力。而使用基于微生物开发的生物杀菌剂或保鲜剂则可以避免这些负面作用。
葡萄是一种浆果，是世界上最古老分布最广的一种水果之一，含镁、维生素C和铁，有一定的药用价值，是重要的供能食物和滋补品。葡萄因颜色鲜艳、味道鲜美，并具有很高的营养价值，而被人们称为“水晶明珠”。我国是世界上葡萄种植大国也是产量大国。但葡萄在运输和贮藏过程中，由于病害的发生，其腐烂较为严重。而葡萄灰霉病是引起葡萄采后腐烂的一个重要原因。
汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）在自然环境中普遍存在，主要存在于含糖量较为丰富的果实表面和花上，是植物微生态系统中的优势微生物种群之一。该菌生长速度快，营养简单，生长力强。在抑制果实采后病原菌方面，它拥有自己独特的优势： 1）该酵母菌对环境的污染较少，不产生毒素；2）该酵母菌不产生抗生素，对人类相对比较安全；3）相对于真菌而言，该酵母菌不产生致敏孢子；4）该酵母生长所需营养比较简单；5）该酵母适合商业化大规模生产；6）酵母菌细胞结构简单，基因组较小，比较容易在分子水平上进行操作。 因此，它具有很好的应用前景。
汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）是具有耐盐、耐干旱、耐渗透性的非致病酵母菌，其在自然界中分布十分广阔，而目前国内还未有应用其防治葡萄灰霉病的报道。
发明内容
本发明公开了一株汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01菌株，其保藏地址为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2015年1月30日，保藏编号为CGMCC No.10464。
本发明提供一株汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）菌株，其为汉逊德巴利酵母XBL01菌株，保藏编号为CGMCC No.10464。
本发明还提供汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）菌剂，是将权利要求1所述的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株扩大培养后得到的；作为优选，扩大培养的条件为：培养基：含有硫酸链霉素25mg/L的YPD液体培养基；培养条件：25℃ 和180-200rmp 条件下培养72h。
本发明的第三个目的是提供一种病原菌抑菌剂，其有效成分为权利要求1所述的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株和/或代谢物；或
权利要求2所述的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01  CGMCC No.10464菌剂。
汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株的代谢物能够从汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株的发酵液中获得，具体为：在液体培养基YPD (1% 酵母膏， 2% 蛋白胨，2% 葡萄糖) 中培养汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株，25℃ 和180-200rmp 条件下培养72h，除去液体培养物（即发酵液）中的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株，即得到其代谢物。
优选地，所述病原菌为葡萄采后灰霉病菌Botrytis cinerea。
本发明的第四个目的是提供一种病害抑制剂，其有效成分为权利要求1所述的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株和/或其代谢物；或
权利要求2所述的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01  CGMCC No.10464菌剂。
优选地，所述病害为葡萄灰霉病。
本发明的第五个目的是提供一种生物农药，其有效成分为权利要求1所述的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株和/或其代谢物；或
权利要求2所述的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01  CGMCC No.10464菌剂。
本发明的第六个目的是提供权利要求1所述的汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌株和/或其代谢物，权利要求2所述的汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌剂在制备病原菌抑制剂、病害抑制剂、生物农药和水果保鲜剂中的应用。
本发明的第七个目的是提供一种水果杀菌剂或保鲜剂，含有权利要求1所述的汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌株和/或其代谢物；或权利要求2所述的汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌剂。
本发明的第八个目的是提供水果杀菌剂或保鲜剂的使用方法，将葡萄在含有权利要求1所述的汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌株和/或其代谢物；或权利要求2所述的汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌剂中浸泡后晾干贮藏即可；优选地，菌株或菌剂的细胞浓度为：106 cfu/ml-109 cfu/ml。
本发明的汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌株能够很好的用于病原菌的防治，尤其是葡萄采后灰霉病菌Botrytis cinerea的防治，能够用于制备水果杀菌剂或保鲜剂，无副作用，不会给环境及生态造成巨大压力。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明的汉逊德巴利酵母（Debryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株在显微镜下细胞形态；
图2为本发明的汉逊德巴利酵母（Debryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株在PDA培养基上对葡萄采后灰霉病菌 (Botrytis cinerea) 的抑制效果；
图3为本发明的汉逊德巴利酵母（Debryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株在PDA+Milk 培养基上产蛋白酶效果；
图4为本发明的汉逊德巴利酵母（Debryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株在YPD液体培养基(含有硫酸链霉素25mg/L)上产葡聚糖酶的效果；
图5为本发明的汉逊德巴利酵母（Debryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株在不同温度下的生长曲线。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
下述实施例中所用到的病原菌公众可从野外采集，也可从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心获得，以重复本申请实验。
葡萄采后灰霉病菌为灰葡萄孢石竹变种(Botrytis cinerea Per. ex Fr)。
实施例1 本发明汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01的分离与菌株鉴定
1、样品采集
从中国北方有机果园中，采集葡萄。
2、菌株的分离筛选及拮抗筛选
从有机葡萄上分离菌株，采用常规梯度稀释涂布分离，用PDA(含有硫酸链霉素25mg/L) 和 YPD琼脂(含有硫酸链霉素25mg/L)共2种培养基分别在25℃条件下培养，挑取菌落形态差异较大并可纯培养的菌落，在YPD琼脂培养基上(含有硫酸链霉素25mg/L)纯化保存，并以葡萄采后灰霉病菌为靶标病原菌进行拮抗菌的初筛和多次复筛，最终得到一株抑菌活性强的汉逊德巴利酵母菌株，命名其为XBL01，并将其进行保藏，保藏编号为CGMCC No.10464。
3、菌株的鉴定
对菌株XBL01进行形态学、生理生化特性和部分保守序列的分析。参考 《The Yeasts, a Taxonomic Study》（Kurtzman, C. P. (1998a). Williopsis Zender. In The Yeasts, a Taxonomic Study, 4th edn, pp. 529-920. Edited by C. P. Kurtzman & J. W. Fell. Amsterdam: Elsevier.）中描述方法进行生理生化测定和分子生物学鉴定。
结果表明，汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌株的形态学特征：菌体营养细胞呈球形，卵形或近球形，单边或多边出芽生殖；在YPD琼脂培养基上产生红色色素，菌落为白色不透明，扁平或圆形，边缘整齐，菌落无褶皱。
汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌株的生理生化特征：可进行葡萄糖发酵，半乳糖发酵，蔗糖发酵，不可进行麦芽糖和乳糖发酵；碳源同化方面：葡萄糖、半乳糖、木糖、纤维二糖、蜜糖、海藻糖、L-阿拉伯糖为阳性，D-阿拉伯糖、鼠李糖、核糖醇为阴性。
汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌株于含有25%（质量含量）氯化钠的培养基中均可正常生长，于含有18%（质量含量）甘油三醇的培养基中不可生长，于pH 3.0-10.0 的培养基中均可正常生长，在环境温度为4℃下生长势弱，在15℃下就能够生长，在35℃以上不可生长；最佳适宜生长温度为20-28℃。在PDA+Milk 培养基上培养，发现能产蛋白酶（参见图3）；在YPD液体培养基(含有硫酸链霉素25mg/L)中，25℃ 和180-200rmp 条件下培养72h, 经离心获得汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌株的发酵液，发酵液以多聚葡萄糖为底物进行反应，反应后与DNS试剂混合成红褐色，说明该菌产葡聚糖酶（参见图4），这些都是具有抑菌活性的关键性指标。
汉逊德巴利酵母（Debryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株的5.8S rDNA 基因、ITS1/ITS2序列以及26S rDNA D1/D2核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1 所示。
实施例2 本发明的汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌株低温耐受性试验
目前，文献报道的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）适宜生长温度范围一般为20-30℃，在37℃条件下能生长。但是本申请中所述的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株的适宜生长温度为15-28℃，而在37℃条件下不生长。其适宜生长温度测定实验方法如下：
将等量的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株（106 cells）菌体接种含有1升的YPD液体培养基(含有硫酸链霉素25mg/L)锥形瓶中，然后分别在4℃、10℃、15℃、20℃、25℃ 、28℃、30℃条件下摇瓶培养（180-200rmp） 条件下培养96h。其中，每个处理每间隔12h取样一次，用梯度稀释平板计数法进行菌落数统计，计量单位为cfu/ml。然后统计结果换算成对数，进行分析。汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株在不同温度下生长曲线见图5。从图中可以看出，汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株在15℃下依然能够正常生长，而目前报道的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）一般在15℃生长极其缓慢。一般而言，若酵母菌能够在低于16℃下能够正常生长，可以说明具有低温耐受性。所以说汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01CGMCC No.10464菌株具有低温耐受性。
实施例3 本发明的汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌株抑菌效果试验
供试病原菌：
葡萄采后灰霉病菌--灰葡萄孢 (Botrytis cinerea Per. ex Fr)。
选择葡萄采后灰霉病菌为指示真菌，采用平板对峙培养法。
具体操作如下：将汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株在PDA培养基上25℃恒温培养48h。将指示真菌在PDA平板上25℃恒温培养3-4天，自菌落边缘用直径0.7cm 无菌不锈钢打孔器打制带菌琼脂片；用无菌接种针挑取病原菌菌片，菌丝面朝下接种于PDA 平板中心处，同时在距病原真菌菌片两侧均约3.00cm处用无菌接种环划线汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株，以仅接病原菌的平板为对照，每个处理三次重复，25℃恒温培养5-7 天，测量病原真菌边缘与汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株的菌落带宽中心之间的抑菌带宽度。具体参见表1和图2。
由表1和图2可知，汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株对葡萄采后灰霉病菌的抑制作用比较明显，抑菌圈直径为10mm以上。说明汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株对葡萄采后灰霉病菌具有稳定、高效的抗菌性能。
表1 汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌株对葡萄采后灰霉病菌的抑制效果
实施例4 本发明的汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌株的扩大培养
将本发明的汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌株加入YPD液体培养基(含有硫酸链霉素25mg/L)中，25℃ 和180-200rmp 条件下培养72h。得到扩大培养后的发酵液。
实施例5 本发明的汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464对葡萄采后灰霉病害的防治效果试验
葡萄采摘后，经汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌液（细胞浓度分别为106 cfu/ml、107  cfu/ml、108 cfu/ml、109 cfu/ml，菌液采用实施例3的方法制备）浸泡处理30-60秒，然后室温条件下，风干，然后于温度为1℃，相对湿度为95%条件下，黑暗贮藏。贮藏21天后，与对照组相比，当菌液浓度为106 cfu/ml，其防效为50%；当菌液浓度为107 cfu/ml，其防效为60%；当菌液浓度达到108 cfu/ml时，其防效为75%；当菌液浓度达到109 cfu/ml时，其防效达80%。具体参见表2。当菌液浓度在109 cfu/ml时，其防效变化较小。可见，本申请的汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464对植物病原真菌引起的腐烂病有较好的防治效果。
表2不同浓度的汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464对葡萄采后灰霉病害的防效
。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
  序列表
 
<110>  新疆鲜宝莱生物科技有限公司
<120>  一株汉逊德巴利酵母菌株及其应用
   
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  587
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
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Claims (10)

1.一株汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）菌株，其为汉逊德巴利酵母XBL01菌株，保藏编号为CGMCC No.10464。
2.汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）菌剂，是将权利要求1所述的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株扩大培养后得到的；作为优选，扩大培养的条件为：采用含有硫酸链霉素25mg/L的YPD液体培养基；培养条件：25℃ 和180-200rmp 条件下培养。
3.一种病原菌抑菌剂，其有效成分为权利要求1所述的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株和/或其代谢物；或
权利要求2所述的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01  CGMCC No.10464菌剂。
4.根据权利要求3所述的病原菌抑制剂，其特征在于：所述病原菌为葡萄采后灰霉病菌Botrytis cinerea。
5.一种病害抑制剂，其有效成分为权利要求1所述的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株和/或其代谢物；或
权利要求2所述的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01  CGMCC No.10464菌剂。
6.根据权利要求5所述的病害抑制剂，其特征在于：所述病害为葡萄灰霉病。
7.一种生物农药，其有效成分为权利要求1所述的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01 CGMCC No.10464菌株和/或其代谢物；或
权利要求2所述的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）XBL01  CGMCC No.10464菌剂。
8.权利要求1所述的汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌株和/或其代谢物，权利要求2所述的汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌剂在制备病原菌抑制剂、病害抑制剂、生物农药和水果保鲜剂中的应用。
9.一种水果杀菌剂或保鲜剂，其特征在于：含有权利要求1所述的汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌株和/或其代谢物；或
权利要求2所述的汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌剂。
10.权利要求9所述的水果杀菌剂或保鲜剂的使用方法，其特征在于：将葡萄在含有权利要求1所述的汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌株和/或其代谢物；或权利要求2所述的汉逊德巴利酵母XBL01 CGMCC No.10464菌剂中浸泡后晾干贮藏即可；优选地，菌株或菌剂的细胞浓度为：106 cfu/ml-109 cfu/ml。
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