CN113388533A - 一株发酵性能良好且具有产香功能的汉逊德巴利酵母菌及其筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株发酵性能良好且具有产香功能的汉逊德巴利酵母菌及其筛选方法。该菌株命名为汉逊德巴利酵母菌SH4(Debaryomyces hansenii SH4)，于2021年5月12日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.22507。汉逊德巴利酵母菌SH4接种到发酵香肠模拟体系中发酵12天后，醛类、酸类、醇类和酯类物质的含量都显著高于未接种的对照组(P>0.05)。降低了模拟体系的脂肪味，增加了发酵味、酒香味、果香味和花香味，表现出良好的作为产香发酵剂的品质。将其应用于风干肠中将对改善产品香气，增加香气的强度和复杂性具有重要意义。

Description

一株发酵性能良好且具有产香功能的汉逊德巴利酵母菌及其 筛选方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株发酵性能良好且具有产香功能的汉逊德巴利酵母菌及其筛选方法。

背景技术

传统风干肠是我国典型的自然发酵肉制品之一，因其独特的口感和风味特性深受消费者喜爱。传统风干肠主要生产于中国东北地区，通常在通风良好的环境中自然发酵10天左右。在发酵过程中，来自原料肉和发酵环境中的乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌等多个微生物菌群共同参与了品质变化和风味的形成。乳酸菌和葡萄球菌通常被认为是风干肠中起主导作用的细菌，有助于产品的酸化、颜色的稳定和风味的形成。而酵母菌作为风干肠中的优势真菌，也在发酵过程中有着不可或缺的作用。一方面，部分酵母菌能够代谢乳酸等有机酸，减缓香肠中总酸含量过高带来的尖酸刺激口感，使其滋味更加柔和。另一方面，酵母菌在生长代谢过程中产生多种挥发性化合物，包括醇类、酯类、酸类、醛类、酮类、萜烯类物质等，赋予了风干肠独特的风味特征。酵母菌产生的特征性风味物质尤其体现在高级醇和酯类物质的含量上。高级醇包括苯乙醇和异戊醇等可以增加产品的醇香味。酯类物质例如乙酸乙酯、己酸乙酯、异戊酸乙酯等可以为产品带来果香味和花香味。这些物质对风干肠的整体风味轮廓具有显著的贡献作用。

为了保持传统风干肠的独特风味特性，大多数产品仍然使用自然发酵的手工作坊式生产。但该发酵方式生产周期长，季节性强，遵循经验式生产，而且开放式的发酵环境易形成复杂的微生物体系，产品品质稳定性难以控制，不适合大规模工业化生产。因此，为了保证产品的质量和安全，采用发酵剂和可控发酵室规范发酵工艺可能是有效的方法。一些研究者逐渐开始选择酵母菌作为发酵剂，在提高产品生产可控性的同时，还能够丰富产品中的风味物质。但一些研究表明，商业化的发酵剂可能并不适用于所有的香肠产品，它们显著降低了香肠的香气复杂性，改变了香肠的本土风味特征。因此，为了保持产品的独特风味轮廓，从产品中分离筛选合适的酵母菌菌种作为发酵剂成为研究的热点。与商业发酵剂相比，在产品中占优势地位的本土酵母菌株具有更强的生长和代谢能力，可以主导自然菌群快速启动发酵，因为自然选择可能通过赋予它们生态优势使其更适合于该产品。更为重要的是，本土酵母菌株能够产生更多凸显产品特色的风味化合物，有利于保持产品独特的风味特征。

目前国内针对特定产品分离筛选能够发挥特色作用的酵母菌的研究相对较少，而东北地区风干肠中产香酵母的筛选仍处于起步阶段。本发明的目的是采用传统菌种分离手段获得中国东北地区传统风干肠中的优势酵母菌，并从中筛选出一株发酵性能良好且具有产香功能的酵母菌作为风干肠的发酵剂，增加产品稳定性，同时保持产品的独特香气和风味特点。这对丰富发酵剂菌库和推进风干肠产业的工业化发展具有重要意义。

发明内容

本发明针对以上问题，提供了一株发酵特性良好且具有产香功能的汉逊德巴利酵母菌，以期将其开发成发酵剂应用于风干肠中，使之能够保持和提升风干肠的独特优良风味。

本发明的又一目的是提供上述发酵特性良好且具有产香功能的汉逊德巴利酵母菌的筛选方法，使其具备特定的工业用途。

为达到上述目的，本发明提供的一株发酵性能良好且具有产香功能汉逊德巴利酵母菌SH4是从东北地区传统风干肠中分离得到的，菌株分类命名为汉逊德巴利酵母菌(Debaryomyces hansenii)，将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.22507。本发明所提供的酵母菌，在YPD琼脂培养基上培养48h生长出的菌落为圆形、乳白色、有光泽、边缘整齐、易挑起。经ITS rRNA序列鉴定为汉逊德巴利酵母菌。

本发明提供的发酵特性良好且具有产香功能汉逊德巴利酵母菌SH4通过以下技术方案筛选实现：

(1)从东北5个地区(哈尔滨、绥化、大庆、鹤岗、牡丹江)采集传统风干肠样品，采用传统酵母菌种分离纯化手段从样品中分离酵母菌。

(2)通过菌体形态和ITS rRNA序列鉴定，确定共分离出46株酵母菌。

(3)通过对酸、盐和亚硝酸钠的耐受性、生物胺生成和水解蛋白质和脂质能力检测，筛选得到7株发酵特性优良的酵母菌。

(4)将7株发酵特性优良的酵母菌接种于发酵香肠模拟体系中进行发酵试验，并对发酵12天的发酵香肠模拟体系进行挥发性化合物测定和感官评价，最终筛选得到一株具有产香功能的汉逊德巴利酵母菌SH4。

通过本发明提供的技术方案，能够获得如下的有益效果：

(1)本发明提供的保藏编号为CGMCC NO.22507的汉逊德巴利酵母菌SH4具有良好的发酵能力，能够耐受pH 4.0的酸性环境、6％的盐浓度和0.015％的亚硝酸钠，不产生物胺，能够水解肌浆蛋白和脂质。

(2)通过发酵试验发现汉逊德巴利酵母菌SH4能够产生更加丰富的香气物质，对照组中共检测到29种挥发性化合物，而在接种该菌株的发酵香肠模拟体系中共检测到39种挥发性化合物。接种该菌株的发酵香肠模拟体系中检测出的挥发性化合物中，有13种化合物的气味活性值大于1，对改善产品香气，增加产品香气的强度和复杂性具有重要意义。汉逊德巴利酵母菌SH4具有产生大量酯类物质的能力，例如乙酸乙酯产生量达到278μg/kg，己酸乙酯达到650.72μg/kg。而且与对照组相比，产生了9种新型酯类物质，多种类和高含量的酯类物质可以为产品带来花香味和果香味。该菌株还产生了大量的醇类物质，例如体系中乙醇的含量达到688.55μg/kg，异戊醇达到64.18μg/kg，为产品提供酒香味和醇香味，1-辛烯-3-醇的含量增加到8.26μg/kg，为产品带来独特的蘑菇味。接种汉逊德巴利酵母菌SH4发酵产生的丰富的挥发性化合物，可以对产品的香气复杂性做出重要的贡献。

通过感官评价，与对照组相比，接种汉逊德巴利酵母菌SH4降低了发酵香肠模拟体系的脂肪味，增加了发酵味、酒香味、果香味和花香味，使得香气层次丰富，复杂度高，总体可接受性优于对照组，充分体现了传统风干肠的独特风味轮廓，表现出良好的作为产香发酵剂的品质。

本发明提供了保藏编号为CGMCC NO.22507的发酵性能良好且具有产香功能的汉逊德巴利酵母菌SH4及其筛选方式。该菌株具有增加风干肠挥发性化合物种类和含量的功能，如将本发明的汉逊德巴利酵母菌SH4投入到风干肠的生产中，可保持或改善产品风味，使风干肠香气更有层次感。

生物保藏说明

本发明提供的汉逊德巴利酵母菌SH4(Debaryomyces hansenii SH4)，于2021年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.22507，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为本发明汉逊德巴利酵母菌SH4在YPD琼脂培养基上的菌落形态；

图2为本发明汉逊德巴利酵母菌SH4在pH为4.0和5.0的条件下的生长情况；

图3为本发明汉逊德巴利酵母菌SH4在NaCl浓度为4％和6％条件下的生长情况；

图4为本发明汉逊德巴利酵母菌SH4在亚硝酸钠浓度为0.01％和0.015％条件下的生长情况；

图5为接种本发明汉逊德巴利酵母菌SH4的发酵香肠模拟体系发酵12天后的感官评价。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步说明：

实施例1：传统风干肠样品的采集和酵母菌的分离纯化

从东北5个地区(哈尔滨、绥化、大庆、鹤岗、牡丹江)采集传统风干肠样品，取10g绞碎的风干肠样品加入90mL浓度为0.85％的无菌生理盐水(w/v)中，于摇床上震荡30min，经过10倍梯度稀释后，在超净工作台中取100μL涂布于添加100mg/L的氯霉素的YPD琼脂平板上，置于微生物培养箱中28℃培养48h。选择平板中菌落个数在30～300的YPD琼脂平板，挑取平板上不同形态的且符合酵母菌菌落形态特征的独立菌落，进一步在新的YPD琼脂平板上划线纯化，直至获得纯培养物，得到的菌株使用20％的甘油保藏在-80℃的环境下备用。

实施例2：酵母菌的鉴定

将筛选出的菌株进行形态分析和ITS rRNA序列鉴定，使用的扩增引物是ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，测定结果在NCBI上对比，鉴定结果发现共分离出46株酵母菌。

如图1所示，所述菌株SH4的形态学特征为：在YDP琼脂平板上生长的菌落为乳白色、菌落球形突起、表面光滑有光泽、边缘整齐、不透明、易挑起(见图1)。

本发明提供的菌株SH4的ITS rDNA测序结果与NCBI数据中的已有序列比对，确认菌株SH4为汉逊德巴利酵母菌(Debaryomyces hansenii)。

实施例3：具有优良发酵特性的酵母菌的筛选

(1)耐酸、耐盐、耐亚硝酸盐酵母菌的筛选：将46株酵母菌株以10⁶CFU/mL分别接种到不同pH梯度(4.0和5.0)、不同氯化钠浓度(4％和6％)和不同亚硝酸钠浓度(0.01％和0.015％)的YPD液体培养基中作为处理组，以正常YPD液体培养基作为对照，于28℃培养24h后，在YPD琼脂平板上测定菌落数量，最终筛选出8株能够耐受pH＝4.0、6％氯化钠浓度和0.015％亚硝酸钠浓度的酵母菌。

汉逊德巴利酵母菌SH4的耐酸、耐盐、耐亚硝酸盐能力分别如图2、3、4所示。发酵结束后，风干肠的pH通常在4.0～5.0之间，对酸敏感的酵母菌的生长会受到抑制。本发明的汉逊德巴利酵母菌SH4在pH为4.0和5.0时生长良好，菌落数量分别达到8.60和8.62CFU/mL。风干肠的食盐添加量一般为2％～3％，在发酵过程中随着水分含量的降低，盐的浓度会不断升高到5％～6％。汉逊德巴利酵母菌SH4在NaCl浓度为4％和6％时皆有一定生长能力，菌落数量分别达到8.70和8.31CFU/mL。风干肠的亚硝酸钠添加量最大为0.015％，在经验生产中通常添加0.01％～0.015％，汉逊德巴利酵母菌SH4在亚硝酸钠浓度为0.01％和0.015％时生长能力较强，菌落数量分别达到8.70和8.64CFU/mL。

(2)酵母菌产生物胺测定：将8株具有较强耐受性的酵母菌接种到添加0.006％溴甲酚紫和1％的氨基酸混合物(亮氨酸、赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、鸟氨酸和精氨酸以相同的比例添加)的YPD琼脂平板上，于28℃培养7天，培养基颜色从黄色变为紫色表明菌株产生生物胺。最终筛选出7株不产生物胺的酵母菌，其中本发明的汉逊德巴利酵母菌SH4不产生物胺。

(3)酵母菌的蛋白和脂质水解能力：

将7株具有较强耐受性且不产生物胺的酵母菌接种到分别添加2mg/mL肌原纤维蛋白、2mg/mL肌浆蛋白和1％三丁酸甘油酯的YPD琼脂平板上，菌落周围产生透明区域的菌株具有蛋白水解或脂质水解活性。水解活性＝菌落直径/菌落与透明区域的直径。如表1所示，本发明的汉逊德巴利酵母菌SH4具有水解肌浆蛋白和脂质的能力，不具有水解肌原纤维蛋白的能力。

表1汉逊德巴利酵母菌SH4的蛋白和脂质水解活性以及生物胺产生情况

实施例4：酵母菌在发酵香肠模拟体系中的发酵试验

(1)发酵剂的制备：将7株具有较强耐受性且不产生物胺的酵母菌在YPD液体培养基中28℃培养24h，在4℃下6000×g离心10min，收集沉淀用无菌水洗涤三次并重悬得到菌悬液待用。

(2)发酵香肠模拟体系的制备：发酵香肠模拟体系是使用提取的肌原纤维蛋白沉淀、肌浆蛋白溶液、猪脂肪和其他辅料制备的。向肌浆蛋白溶液(g/L)中添加以下辅料：NaCl(37.5)、葡萄糖(15.0)、亚硝酸钠(0.15)，味精(4.5)和玉泉大曲(15.0)。该溶液通过真空过滤系统(0.22μm滤膜)灭菌。将肌原纤维蛋白沉淀(175.0g)、猪脂肪(75.0g)和500mL肌浆蛋白溶液(添加辅料)均质化以制备发酵香肠模拟体系。

处理组为将前述7种酵母菌株制作的发酵剂接种到发酵香肠模拟体系中，所述接种量为10⁶CFU/mL。对照组不添加发酵剂。

向发酵香肠模拟体系中添加7.5mL的葡萄糖酸-β-内酯(56mM)使其酸化形成凝胶，模拟香肠真实状态。

上述发酵香肠模拟体系在25℃下发酵12天。

(3)发酵香肠模拟体系中挥发性化合物的测定：用气相色谱和质谱联用仪(GCMS-QP2020 NX，岛津，日本)测定发酵12天的发酵香肠模拟体系中的挥发性化合物种类和含量。具体条件：样品45℃顶空萃取30min，内标物质为1，2-二氯苯，色谱柱为InertCap WaX毛细管柱(60m×0.25mm×0.25μm)，载气为高纯氦气，流速1mL/min，顶空固相微萃取手动进样，采用不分流模式，气相色谱进样口温度为230℃，热解析3min。柱温箱的升温程序：40℃保持3min，以5℃/min的速度升温至200℃，然后以10℃/min的速度升温至230℃，保持2min。离子源温度为230℃，电离方式EI，离子能量70ev，质量扫描范围45-500amu。挥发性化合物的鉴定是通过比较NIST 17质谱库中的试验质谱实现的，取相似度大于90％作为鉴定结果，并且通过计算标准烷烃(C6-C20)的保留指数，与文献报道结果相比较进行辅助鉴定。挥发性化合物的定量采用内标法，定量结果以μg/kg表示。通过将挥发性化合物的含量除以其气味阈值来计算气味活性值。

表2发酵香肠模拟体系中接种汉逊德巴利酵母菌SH4产生的挥发性化合物含量和气味活性值。

注：不同小写字母表示接种汉逊德巴利酵母菌SH4处理组与对照组的挥发性化合物含量存在显著性差异(P<0.05)。

对发酵12天后的发酵香肠模拟体系进行挥发性化合物种类和含量的测定，从表1可以看出，对照组中共鉴定出29种挥发性化合物，而接种汉逊德巴利酵母菌SH4的模拟体系中检测到39种挥发性化合物。该酵母菌株产生了更多的醛类、酸类、醇类和酯类，其中13种化合物的气味活性值都大于1，对整体风味起到一定的贡献作用。接种汉逊德巴利酵母菌SH4的模拟体系中产生的异戊醛含量为16.34μg/kg，可以为产品带来坚果味和巧克力味。1-辛烯-3-醇的含量增加到8.26μg/kg，为产品带来蘑菇味，这些物质都是风干肠中的典型挥发性化合物。由该菌株产生的酯类物质种类比对照组多9种，而且所有产生的酯类物质的含量都显著高于对照组(P<0.05)，属于高产酯类的菌株。其中乙酸乙酯的含量达到278.10μg/kg，可以为产品带来果香和酯香味；丁酸乙酯的含量达到32.18μg/kg，具有凤梨和白兰地味；异戊酸乙酯的含量达到6.20μg/kg，具有苹果和甜味；己酸乙酯的含量达到650.72μg/kg，具有凤梨和香蕉味；2-甲基丁酸乙酯的含量达到25.79μg/kg，具有苹果和葡萄味。3-苯丙酸乙酯的含量达到18.17μg/kg，具有玫瑰花香和蜂蜜味。接种汉逊德巴利酵母菌SH4发酵产生的丰富的挥发性化合物组分，能够使得产品的香气得到更好的体现，构成产品风味的独特性。

(4)发酵香肠模拟体系的感官评价：将发酵12天的发酵香肠模拟体系进行感官评价，感官评价是由20名食品专业人员组成的感官评定小组完成，其中包括10位女性和10位男性，他们具有肉制品感官评定的经验，并按照GB/T 22210-2008对感官评定小组人员进行培训。采用定量描述性感官分析来评估发酵香肠模拟体系，总共选定了包括6种风味(脂肪味、发酵味、酒香味、果香味、花香味和酵母味)和整体气味可接受性的共7个评价属性以表征感官特性。每个属性的强度评分味从0到7(0：无味道；7：味道非常强烈)。

由图5所示，从感官评分的结果看出，综合发酵香肠模拟体系的各项气味指标，20位评审小组给与了汉逊德巴利酵母菌SH4所发酵的模拟体系更高的评价，认为其总体可接受性优于未接种的模拟体系。接种汉逊德巴利酵母菌SH4降低了发酵香肠模拟体系的脂肪味，增加了发酵味、酒香味、果香味和花香味，使得香气层次丰富，复杂度高，体现了传统风干肠的独特风味轮廓，表现出作为产香发酵剂的良好品质。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。应当指出，在本发明的技术构思范围内，还可以对本发明的技术方案做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一株发酵性能良好且具有产香功能的汉逊德巴利酵母菌，菌株命名为汉逊德巴利酵母菌SH4(Debaryomyces hansenii SH4)，于2021年5月12日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.22507。

2.权利要求1所述的汉逊德巴利酵母菌SH4，其特征为从东北地区传统风干肠中分离得到，筛选方法是：

(1)从东北5个地区(哈尔滨、绥化、大庆、鹤岗、牡丹江)采集传统风干肠样品，采用传统酵母菌种分离纯化手段从样品中分离酵母菌。

(2)通过菌体形态和ITS rRNA序列鉴定，确定共分离出46株酵母菌。

(3)通过对酸、盐和亚硝酸钠的耐受性、生物胺生成和水解蛋白质和脂质能力检测对酵母菌进行初筛。

(4)将酵母菌接种于发酵香肠模拟体系中进行发酵试验，并对发酵12天的发酵香肠模拟体系进行挥发性化合物测定和感官评价进行复筛，最终获得一株发酵性能良好且具有产香功能的汉逊德巴利酵母菌SH4。

3.一种包含权利要求1所述汉逊德巴利酵母菌SH4的发酵剂，其特征在于，所述发酵剂为将权利要求1所述汉逊德巴利酵母菌SH4在YPD液体培养基中28℃培养24h，在4℃下6000×g离心10min，收集沉淀用无菌水洗涤三次并重悬得到的菌悬液。

4.权利要求2所述发酵香肠模拟体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)发酵香肠模拟体系是使用提取的肌原纤维蛋白沉淀、肌浆蛋白溶液、猪脂肪和其他辅料制备的。向肌浆蛋白溶液(g/L)中添加以下辅料：NaCl(37.5)、葡萄糖(15.0)、亚硝酸钠(0.15)，味精(4.5)和玉泉大曲(15.0)。该溶液通过真空过滤系统(0.22μm滤膜)灭菌。将肌原纤维蛋白沉淀(175.0g)、猪脂肪(75.0g)和500mL肌浆蛋白溶液(添加辅料)均质化以制备发酵香肠模拟体系。

(2)将权利要求3所述发酵剂接种到发酵香肠模拟体系中，所述接种量为10⁶CFU/mL。

(3)向发酵香肠模拟体系中添加7.5mL的葡萄糖酸-β-内酯(56mM)使其酸化形成凝胶，模拟香肠真实状态。

(4)发酵香肠模拟体系在25℃下发酵12天。

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