CN113717879B - 植物乳杆菌zf603及其应用 - Google Patents

植物乳杆菌zf603及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株植物乳杆菌ZF603及其应用，该菌株其已于2021年6月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61734，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。本发明提供的植物乳杆菌ZF603，具有能提高发酵酱油琥珀酸、乳酸乙酯含量的优点，并且具有添加后不影响发酵酱油中其它成分的特点，既保留了发酵酱油浓郁酱香风味，又增加了酸爽口感，提升了浓厚感；基于该菌株的优点，无需后续调配即可获得高品质发酵酱油，简化酱油生产工艺，降低生产成本；该菌株属食品微生物，使用安全。整体上，采用本发明提供的植物乳杆菌ZF603能为酱油的酿造提供口感酸爽、风味鲜甜、滋味醇厚、浓厚感强的原油。

Description

植物乳杆菌ZF603及其应用
技术领域
本发明属于工业微生物技术领域，具体而言，本发明涉及一株适用于酱油生产的植物乳杆菌。
背景技术
酱油是我国传统发酵调味品，是一种以大豆、小麦、麸皮等为原料，由多种微生物共同作用经长期发酵而形成的具有独特风味的调味品。在酱油发酵过程中，乳酸菌是促进酱油风味物质形成的重要微生物。
从酱油酱醪中分离出来的乳酸菌(Lactobacillus)，在酱油发酵过程中发挥着重要作用，其主要包括嗜盐片球菌(Pediococcus halophilus)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、魏斯氏菌(Weisseria)和酱油微球菌(Tetracoccus sojae)。酱油发酵过程中，pH值为关键监控指标，发酵体系中酵母菌只有pH值下降到5.2以下时才能在盐分很高的酱醪中生长，而乳酸菌繁殖可以有效促进酱醪pH值下降。并且，乳酸菌主要分解原料中的糖类物质产生乳酸、乙酸、琥珀酸等有机酸，与酵母菌产生的醇类发生生化作用产生乳酸乙酯、乙酸乙酯等香气物质，可有效促进酱油风味物质的生成。
嗜盐片球菌的生长pH范围在5.5～9.0，接近中性部分生长最好，pH5.0以下其生长就完全受到抑制。嗜盐四联球菌的主要作用与嗜盐片球菌类似，在发酵后期活跃，当pH5.0以下也停止繁殖。因此，现有乳酸菌菌株耐pH能力导致酱油发酵体系中有机酸的积累不足，进而影响酱油风味物质的形成。我们发现，高端酱油中适量的有机酸是构成其风味的重要因素之一。不仅有机酸本身具有特殊的香味从而对酱油有着调味和增香作用，而且部分有机酸与大量的醇类物质发生酯化反应后产生酯类等风味物质，例如乳酸与乙醇反应生成的乳酸乙酯也是一种重要的香气成分。乳酸乙酯是酱油风味中酯类物质的代表，是基本的香味物质，起着香甜、浓郁而柔和的底物作用，使得酱油中的关键香味更加醇厚，对提升酱油浓厚感起着重要作用。
琥珀酸作为有机酸的一种，能够有效提升酱油的鲜味，带来令人愉快的口感，而且琥珀酸不具有挥发性，能够长时间保持酱油的鲜味。高端酱油的发展趋势是不添加任何防腐剂，而酱油中琥珀酸具有防腐功能，然而成品酱油中添加琥珀酸不被消费者所接受，不满足人们对健康生活的需求。目前，我国酱油酿造普遍采用米曲霉As3.042菌株或其诱变菌株，而这些菌株在酱油发酵过程中产生的琥珀酸浓度很低，成品酱油中的琥珀酸浓度根本达不到口味阈值。乳酸菌发酵生成有机酸类物质的能力极大影响着酱油风味物质的生成。
因此，需要找到一株耐pH能力较强的乳酸菌菌株，使得在酱油酿造过程中能够通过提升酱油中琥珀酸和乳酸乙酯含量，从而提升酱油的酸鲜口感及浓厚感。
发明内容
基于上述技术问题，本发明的主要目的在于克服上述背景技术的不足之处而提供一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603，将该菌株应用于酱油的制备，在发酵过程中能够显著提升发酵产物中琥珀酸和乳酸乙酯含量，并且该菌株耐酸性较强，能够有效促进酱醪中蛋白质的分解。发酵产物色泽鲜艳，有光泽，酱香和酯香浓郁，有适口酸味和滋味醇厚、浓厚感强的特点。
为了实现本发明的目的，本发明人通过大量的实验和不懈的探索，最终获得了如下实验方案：
一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603，其已于2021年6月22 日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603，保藏编号为GDMCC No：61734，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603，是从天然奶酪中筛选和分离鉴定获得，根据细胞形态、生理生化特征和16SrDNA测序等实验数据综合分析，该菌株被鉴定为乳酸菌(Lactobacillus plantarum)。
本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603具有以下形态特征：在MRS固体培养平板上培养48h，菌落直径达3mm～5mm，菌落呈现乳白色、菌落凸起、呈圆形，表面光滑，菌落边缘整齐。
将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603接种至固体MRS培养基斜面上连续传代10代、将第1代、第5代、第10代菌株在发酵培养基中进行发酵，检测发酵液中琥珀酸和乳酸乙酯的含量，琥珀酸和乳酸乙酯含量在各代之间稳定，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ZF603直到至少第10代未显示出回复突变，表明遗传稳定性好。
本发明还提供了所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603的筛选方法，其包括如下步骤：
1)菌株初筛：从天然奶酪中分离筛选乳酸菌，将奶酪加入生理盐水中，稀释101倍～106倍，将不同稀释浓度的奶酪稀释液，均匀涂布在固体MRS培养基上(含18％NaCl)，放入培养箱中37℃培养48h后，在固体MRS培养基上挑选具有典型菌落形态的乳酸菌，菌落呈现乳白色、菌落凸起、呈圆形，表面光滑，菌落边缘整齐，从固体MRS培养基(含18％NaCl)中共挑选出90个单菌落进行镜检复筛。筛选涂片染色后显微镜下细胞形态呈杆状，两端钝圆，单个或呈短链，不运动，革兰氏阳性的菌株，进行多次划线纯化，共获得20株具有典型乳酸菌形态的菌株，分别记作MC101、MC102、MC103、MC104、MC105、 MC106、MC107、MC108、MC109、MC110、MC111、MC112、MC113、MC114、 MC115、MC116、MC117、MC118、MC119和MC120。
2)菌株复筛：
将上述初筛获得的20株菌株活化后接入液体MRS培养基中培养。
在酱油发酵中期接入，按照传统高盐稀态发酵工艺放入28℃静置培养55天后，从各发酵罐中取样进行常规指标总酸和氨基氮指标检测以及按照 GB5009.157-2016、GB1886.197-2016所述方法分别测定琥珀酸、乳酸乙酯的含量。
取产琥珀酸、乳酸乙酯含量高的乳酸菌发酵原油，通过专业鉴评师进行感官评价，选择感官评价结果最好的菌株。
3)生产试用：按照常规高盐稀态工艺进行酱油发酵生产，在发酵酱油中期，接入乳酸菌浓度为106cfu/mL～107cfu/mL的种子液，发酵结束后，检测酱油中琥珀酸、乳酸乙酯含量及酱油的感官质量，确定乳酸菌的最佳添加量。
固体MRS培养基：称取180g氯化钠、10g蛋白胨、5g牛肉膏粉、4g酵母膏粉、20g葡萄糖、1mL吐温-80、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、 0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰和15g琼脂，溶于1000mL蒸馏水中，调节pH至6.2，分装，0.1Mpa、115℃灭菌15min。
液体MRS培养基：液体MRS培养基相对于上述固体MRS培养基，区别之处在于不添加琼脂。
在其中一个实施例中，步骤2)中，所述菌株活化后接入所述液体MRS培养基中培养的温度为30℃～37℃。
在其中一个实施例中，步骤2)中，所述菌株活化后接入所述液体MRS培养基中培养的时间为24h～72h。
在其中一个实施例中，步骤3)中，所述种子液中乳酸菌的浓度为1× 106cfu/mL～1×107cfu/mL。
在其中一个实施例中，步骤3)中，所述种子液的接种量为2％(质量百分比)。
第二方面，本发明提供一种制备酱油的方法，所述方法包括采用如上所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603进行发酵的步骤。
在其中一个实施例中，所述方法包括：
(1)对酱醪进行发酵；
(2)向所得发酵酱醪中接种权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ZF603并进行发酵。
在其中一个实施例中，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603在所述发酵酱醪中的接种活菌浓度为2.0×104cfu/mL～2×105cfu/mL。
在其中一个实施例中，步骤(1)中，发酵的时长为41天～48天。
在其中一个实施例中，步骤(2)中，发酵的时长为7天～14天。
在其中一个实施例中，步骤(2)中，发酵的温度为30℃～37℃。
在其中一个实施例中，步骤(1)中，发酵的温度为30℃～37℃。
在其中一个实施例中，步骤(2)中，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603以其发酵种子液的形式接种至所述发酵酱醅，所述发酵种子液中活菌浓度为1×106cfu/mL～1×107cfu/mL，所述发酵种子液的接种量为1.5％～2.5％。
在其中一个实施例中，所述酱醅的制备原料包含豆类原料或/和小麦类原料。
在其中一个实施例中，所述酱油为老抽酱油。
在其中一个实施例中，所述酱油为生抽酱油。
第三方面，本发明提供一种如上所述的方法制备获得的酱油。
本发明具有以下技术优势和积极效果：
(1)采用本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603，发酵获得酱油具有琥珀酸、乳酸乙酯含量高的优点，同时酱油色泽鲜艳，有光泽，酯香浓郁，具有适口酸味和滋味醇厚、浓厚感强的特点。
(2)本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603耐酸性较强，pH4.5以下仍具有较好的增殖能力，接种至酱醪发酵能够有效促进酱醪中蛋白质的分解。
(3)采用本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603发酵可获得的鲜味突出、口感协调的酱油，货架期显著延长，且后期无需通过添加其他添加剂调配制备成品，实现零添加纯酿酱油的工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603在MRS 固体培养平板上的菌落形态图；
图2为本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603在显微镜下的形态图；
图3为本发明筛选植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603的技术路线示意图。
本发明提供的植物乳酸菌，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603。该菌株已于2021年6月22日保藏于广东微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:61734；该菌株于2021年6月22日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2021年 6月22日检测为存活菌株。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
本文中，“优选”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，则包括数值区间的两个端点。
本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固相-液相混合和固相- 固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
下述实施例中所述试验方法，如无特别说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特别说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603的分离筛选
1、菌株的初筛
从市购天然奶酪中分离筛选乳酸菌，将奶酪加入生理盐水稀释至10-1、10-2、 10-3、10-4、10-5、10-6浓度，制成奶酪稀释液，分别从奶酪稀释液中取0.1mL均匀涂布在固体MRS培养基上(含18％食盐)，放入培养箱中37℃培养48h后，在固体MRS培养基上挑选具有典型菌落形态的乳酸菌，菌落呈现乳白色、菌落凸起、表面光滑、菌落边缘整齐。从固体MRS培养基中共挑选出90个单菌落进行镜检复筛。筛选涂片染色后显微镜下细胞形态呈杆状，两端钝圆，单个或呈短链，不运动，革兰氏阳性的菌株，进行多次划线纯化，共获得20株具有典型乳酸菌形态的单一菌落菌株，分别记作MC101、MC102、MC103、MC104、MC105、 MC106、MC107、MC108、MC109、MC110、MC111、MC112、MC113、MC114、 MC115、MC116、MC117、MC118、MC119、MC120；培养成熟后进行常规保藏。
2、菌株复筛
将上述初筛获得的20株菌株活化后接入液体MRS培养基(含18％NaCl) 中，37℃培养24h，制成发酵种子液。在酱油发酵中期(例如酱醪发酵第41d、 42d、43d、44d、45d、46d、47d、48d)接入发酵种子液，发酵种子液浓度为 1.0×105cfu/mL～4.9×105cfu/mL。按照传统高盐稀态发酵工艺放入30℃～37℃静置继续培养7～14天后，从各发酵罐中取样进行常规指标总酸和氨基氮指标检测以及按照GB5009.157-2016、GB1886.197-2016所述方法分别测定琥珀酸、乳酸乙酯的含量。取产琥珀酸、乳酸乙酯含量高的乳酸菌发酵原油，通过专业鉴评师进行感官评价，选择感官评价结果最好的菌株。
琥珀酸的含量测定参照《食品安全国家标准食品中有机酸的测定GB5009.157-2016》；
乳酸乙酯的含量测定参照《食品安全国家标准食品添加剂乳酸乙酯 GB1886.197-2016》；
氨基氮的含量测定参照《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定GB5009.235-2016》；
全氮的含量测定参照《国家标准酿造酱油GB 18186-2000》。
结果如表1所示。选取发酵原油质量正常，氨基氮和琥珀酸、乳酸乙酯含量高的菌株MC101、MC103、MC108、MC112、MC115、MC116进行感官评价。
表1、发酵原油质量分析
Figure RE-GDA0003330994160000101
通过专业鉴评师对采用MC101、MC103、MC108、MC112、MC115、MC116 菌株发酵所得酱油原油进行感官评价以确定最佳乳酸菌以及添加量。感官鉴评评分标准见表2，感官评价结果见表3。
感官鉴评评分标准如表2：
表2、酱油香气与滋味评分标准
Figure RE-GDA0003330994160000111
感官评价结果如表3。
表3、发酵原油感官分析
菌种名称 色泽 香气 滋味 综合
MC101 87 90 86 89
MC103 95 94 95 95
MC108 89 92 90 90
MC112 88 89 87 88
MC115 92 92 90 91
MC116 91 92 92 92
备注：各项指标满分为100分，得分越高表示结果越好。
根据得分，选择感官评价结果最好的菌株MC103。该菌株具有如下菌落形态特征：在固体MRS培养平板上培养48h，菌落直径达3mm～5mm，菌落呈现乳白色、菌落凸起、呈圆形，表面光滑，菌落边缘整齐。具体请参见图1。
菌株MC103经过涂片染色，在显微镜下观察，细胞形态呈杆状，两端钝圆，单个或呈短链，不运动，革兰氏阳性。具体请参见图2。
菌株MC103的16S DNA测序结果如下SEQ ID No.1所示：GCTATACATGCAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGA TTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGC CCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAA CTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGG ATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCA ATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGAC ACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGA CGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTC GTAAARCTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTA TTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC GGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAG CGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGA AGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACT CCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAA GGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGC AAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAG TGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCC GCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGG CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAAC CTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTC GGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCA TTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTG GGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCT ACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTT AAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCG GAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCG GTGGGGTAACCTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGTGACAGATT
经鉴定，菌株MC103为植物乳杆菌，并命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ZF603。该菌株已于2021年6月22日保藏于广东微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:61734；该菌株于2021年6月22日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2021年6月22日检测为存活菌株。
参照本实施例上述“2、菌株复筛”项下步骤制备发酵种子液，对植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603进行发酵，探究不同接种浓度对酱油琥珀酸、乳酸乙酯含量及风味口感的影响。参见实施例2(发酵种子液中菌体浓度为1.0 ×104cfu/mL)、实施例3(发酵种子液中菌体浓度为1.0×105cfu/mL)、实施例4 (发酵种子液中菌体浓度为1.0×106cfu/mL)、实施例5(发酵种子液中菌体浓度为1.0×107cfu/mL)。
实施例2
将实施例1中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603活化后接入液体MRS培养基(含18％NaCl)中，放入培养箱中37℃培养48h后，制成发酵种子液，该发酵种子液含菌体浓度为1.0×105cfu/mL。
将菌体浓度为1.0×105cfu/mL的上述发酵种子液添加在发酵酱醪，此处发酵种子液在发酵酱醪发酵第42d接入，发酵种子液接种量为2％。
以相同菌体浓度和接种量人工接种酱油常用乳酸菌耐盐四链球菌(Tetragenococcus halophilus)(购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号 CICC10286)为菌株对照组，记为CICC 10286组，按照传统高盐稀态发酵工艺在30℃～37℃静置继续发酵13d，发酵结束后酱油原油指标检测、感官鉴评与实施例1相同。
实施例3
将实施例1中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603活化后接入液体MRS培养基(含18％NaCl)中，放入培养箱中37℃培养48h后，制成发酵种子液，该发酵种子液含菌体浓度为1.0×106cfu/mL。
将菌体浓度为1.0×106cfu/mL的上述发酵种子液添加在发酵酱醪中，此处发酵种子液在发酵酱醪发酵第42d接入，发酵种子液接种量为2％。
以相同菌体浓度和接种量人工接种酱油常用乳酸菌耐盐四链球菌(Tetragenococcus halophilus)(购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号 CICC10286)为菌株对照组，记为CICC 10286组，按照传统高盐稀态发酵工艺在30℃～37℃静置继续发酵13d，发酵结束后酱油原油指标检测、感官鉴评与实施例1相同。
实施例4
将实施例1中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603活化后接入液体MRS培养基(含18％NaCl)中，放入培养箱中37℃培养48h后，制成发酵种子液，该发酵种子液含菌体浓度为1.0×107cfu/mL。
将菌体浓度为1.0×107cfu/mL的上述发酵种子液添加在发酵酱醪，此处发酵种子液在发酵酱醪发酵第46d接入，发酵种子液接种量为2％。
以相同菌体浓度和接种量人工接种酱油常用乳酸菌耐盐四链球菌(Tetragenococcus halophilus)(购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号 CICC10286)为菌株对照组，记为CICC 10286组，按照传统高盐稀态发酵工艺在30℃～37℃静置继续发酵9d，发酵结束后酱油原油指标检测、感官鉴评与实施例1相同。
实施例5
将实施例1中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603活化后接入液体MRS培养基(含18％NaCl)中，放入培养箱中37℃培养48h后，制成发酵种子液，该发酵种子液含菌体浓度为1.0×108cfu/mL。
将菌体浓度为1.0×108cfu/mL的上述发酵种子液添加在发酵酱醪，此处发酵种子液在发酵酱醪发酵第48d接入，发酵种子液接种量为2％。
以相同菌体浓度和接种量人工接种酱油常用乳酸菌耐盐四链球菌(Tetragenococcus halophilus)(购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号 CICC10286)为菌株对照组，记为CICC 10286组，按照传统高盐稀态发酵工艺在30℃～37℃静置继续发酵7d，发酵结束后酱油原油指标检测、感官鉴评与实施例1相同。
对比例
按照传统高盐稀态发酵工艺发酵酱醪，不接种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ZF603发酵作为空白对照组，其他发酵条件与实施例2相同。发酵结束后酱油原油指标检测与实施例1相同。
实施例2至实施例5、对比例实验结果分析如下：
(1)琥珀酸含量分析如表4所示；
(2)乳酸乙酯含量分析如表5所示；
(3)感官鉴评结果分析如表6所示；
(4)酱油中氨基氮、全氮指标检测结果分析如表7所示。
表4、酱油中琥珀酸含量(g/L)
Figure RE-GDA0003330994160000161
实施例2中试验组琥珀酸含量与菌株对照组相比，提高了56.74％。实施例 3中试验组琥珀酸含量与菌株对照组相比，提高了103.31％。实施例4中试验组琥珀酸含量与菌株对照组相比，提高了113.33％。实施例5中试验组琥珀酸含量与菌株对照组相比，提高了199.53％。证实了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603产琥珀酸能力优于酱油常用乳酸菌耐盐四链球菌 (Tetragenococcus halophilus)，能够显著提高酱油中琥珀酸含量。
表5、酱油中乳酸乙酯含量(mg/L)
Figure RE-GDA0003330994160000162
实施例2中试验组乳酸乙酯含量与菌株对照组相比，提高了332.94％。实施例3中试验组乳酸乙酯含量与菌株对照组相比，提高了455.79％。实施例4中试验组乳酸乙酯含量与菌株对照组相比，提高了335.54％。实施例5中试验组乳酸乙酯含量与菌株对照组相比，提高了321.68％。证实了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603产乳酸乙酯能力优于酱油常用乳酸菌耐盐四链球菌 (Tetragenococcus halophilus)，能够显著提高酱油中乳酸乙酯含量。
表6、感官评价结果
Figure RE-GDA0003330994160000171
实施例2、实施例3、实施例4、实施例5中，试验组的色泽、香气、滋味均优于菌株对照组与菌株对照组。
表7、酱油中氨基氮、全氮指标检测结果
Figure RE-GDA0003330994160000172
各实施例中，试验组的氨基酸态氮、全氮含量与菌株对照组、空白对照组无明显差异。
根据表4、表5、表6、表7可知：将本发明植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603应用于酱油生产的过程中，可有显著提升酱油中琥珀酸、乳酸乙酯的含量，同时不影响酱油中其它成分。在实施例2～实施例5中，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603添加的量越多酱油中琥珀酸、乳酸乙酯含量越高，但是当植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ZF603添加的量增大到一定程度时例，如实施例5，使得酱油中琥珀酸含量偏高、酸味较重，酱味风味受到影响并且乳酸乙酯含量涨幅小，因此在添加本发明提供的植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)ZF603进行酱油发酵的过程中，应注意植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603的添加剂量。本发明上述研究表明：在植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603种子液菌体浓度为1.0×106cfu/mL～1.0 ×107cfu/mL、接种量为2％时，酱油发酵效果最佳，即有效生成琥珀酸、乳酸乙酯，又不改变酱油的风味。
实施例7、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603遗传稳定性试验
将实施例1所得植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603在固体MRS 培养基斜面上连续传代10代，观察并记录各代菌株的生长情况，并将第1代、第5代和第10代斜面种按照实施例6所述的方法进行培养和发酵。
检测发酵酱油中琥珀酸及乳酸乙酯含量，判断植物乳杆菌ZF603菌株的遗传稳定性，若十代测定琥珀酸及乳酸乙酯的含量间误差在10％误差范围内，则表明菌株遗传稳定性良好。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603菌株的遗传稳定性检测结果如表8所示。
表8、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603菌株的遗传稳定性检测结果
传代数 琥珀酸(g/L) 乳酸乙酯(mg/L)
1 0.647±0.03 16.66±0.01
5 0.625±0.02 17.45±0.04
10 0.651±0.02 15.95±0.03
不同代数植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603菌株发酵产生的琥珀酸、乳酸乙酯含量间误差在10％范围内，表明该菌株遗传稳定性良好。
实施例8、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603菌株耐酸性测试
将实施例1所得植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603在MRS斜面培养基上传代2次，然后将其接种至液体MRS培养液中，液体MRS培养基用质量浓度为1.0g/L的盐酸调节pH值分别达到3.5、4.0、4.5和5.0。
接种后的培养液于37℃恒温静置培养12h，采用平板稀释法计数，参照《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验GB 4789.35-2016》。涂布平板于37℃恒温静置培养48h后进行乳酸菌活菌计数。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603菌株耐酸性测试结果如表9所示。
表9、植物乳杆菌ZF603菌株耐酸性测试结果
活菌数(CFU/mL) pH3.5 pH4.0 pH4.5 pH5.0
0h 1.02×107 1.02×107 1.02×107 1.02×107
12h 3.5×107 1.12×108 6.17×108 8.11×108
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF603菌株耐酸性较强，在pH4.5以下仍具有较好的增殖能力。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
序列表
<110> 广东海天创新技术有限公司
佛山市海天（高明）调味食品有限公司
佛山市海天调味食品股份有限公司
<120> 植物乳杆菌ZF603及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1455
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400> 1
gctatacatg cagtcgaacg aactctggta ttgattggtg cttgcatcat gatttacatt 60
tgagtgagtg gcgaactggt gagtaacacg tgggaaacct gcccagaagc gggggataac 120
acctggaaac agatgctaat accgcataac aacttggacc gcatggtccg agcttgaaag 180
atggcttcgg ctatcacttt tggatggtcc cgcggcgtat tagctagatg gtggggtaac 240
ggctcaccat ggcaatgata cgtagccgac ctgagagggt aatcggccac attgggactg 300
agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccacaa tggacgaaag 360
tctgatggag caacgccgcg tgagtgaaga agggtttcgg ctcgtaaarc tctgttgtta 420
aagaagaaca tatctgagag taactgttca ggtattgacg gtatttaacc agaaagccac 480
ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggatttat 540
tgggcgtaaa gcgagcgcag gcggtttttt aagtctgatg tgaaagcctt cggctcaacc 600
gaagaagtgc atcggaaact gggaaacttg agtgcagaag aggacagtgg aactccatgt 660
gtagcggtga aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg gcgaaggcgg ctgtctggtc 720
tgtaactgac gctgaggctc gaaagtatgg gtagcaaaca ggattagata ccctggtagt 780
ccataccgta aacgatgaat gctaagtgtt ggagggtttc cgcccttcag tgctgcagct 840
aacgcattaa gcattccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctgaaactca aaggaattga 900
cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagctacgcg aagaacctta 960
ccaggtcttg acatactatg caaatctaag agattagacg ttcccttcgg ggacatggat 1020
acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1080
gagcgcaacc cttattatca gttgccagca ttaagttggg cactctggtg agactgccgg 1140
tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct 1200
acacacgtgc tacaatggat ggtacaacga gttgcgaact cgcgagagta agctaatctc 1260
ttaaagccat tctcagttcg gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag tcggaatcgc 1320
tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380
gtcacaccat gagagtttgt aacacccaaa gtcggtgggg taacctttag gaaccagccg 1440
cctaagtgac agatt 1455

Claims (9)

1.一株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ZF603，其已于2021年6月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61734，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
2.一种制备酱油的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ZF603进行发酵的步骤。
3.根据权利要求2所述的制备酱油的方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）对酱醪进行发酵；
（2）向所得发酵酱醪中接种权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ZF603并进行发酵。
4.根据权利要求3所述的制备酱油的方法，其特征在于，所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ZF603在所述发酵酱醪中的接种活菌浓度为2.0×104cfu/mL～2×105 cfu/mL。
5.根据权利要求3所述的制备酱油的方法，其特征在于，步骤（1）中，发酵的时长为41天～48天。
6.根据权利要求3所述的制备酱油的方法，其特征在于，步骤（2）中，发酵的时长为7天～14天。
7.根据权利要求3所述的制备酱油的方法，其特征在于，步骤（2）中，发酵的温度为30℃～37℃。
8.根据权利要求3至7任一项所述的制备酱油的方法，其特征在于，步骤（1）中，发酵的温度为30℃～37℃；或/和，所述酱醪的制备原料包含豆类原料或/和小麦类原料。
9.根据权利要求2至7任一项所述的制备酱油的方法，其特征在于，所述酱油为老抽酱油或生抽酱油。
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